CN107064402B - 一种益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物制剂检测领域，具体涉及一种益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法。该检测方法，通过TLC法鉴别参鹿补片中的人参皂苷Rg1，解决了现有的红参的TLC鉴别法不适用于鉴别参鹿补片中药材红参中的人参皂苷Rg1的问题，该检测方法快速、全面、针对性强，进一步联合该中药制剂中淫羊藿苷的含量测定方法和现有的齐墩果酸的TLC鉴别方法，有利于对该中药制剂的质量进行全面有效控制，有助于提高该药材使用的安全性和稳定性。

Description

一种益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法
技术领域
本发明属于药物制剂检测领域，具体涉及一种益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法。
背景技术
参鹿补片是由红参、鹿肉、淫羊藿、狗脊、墨旱莲、玉竹、女贞子(酒制)、熟地黄、锁阳、续断、白术(炒)、仙鹤草、党参、鸡血藤组成的中药制剂，具有益气养血、补肾壮阳的功效，用于肾阳虚衰、气血不足、畏寒肢冷、精神疲乏、腰膝酸软和头晕耳鸣的治疗。参鹿补片为部颁标准所收载，但该标准中仅仅包括齐墩果酸的薄层色谱鉴别方法，不仅检测的指标较为单一，而且不能检测该中药制剂中所含其他药材的质量，不利于从整体上对该中药制剂的质量进行有效控制。因此，建立一种快速、全面、针对性强的参鹿补片的质量检测及质量控制的方法具有重要的意义。
“酸水解-衍生化-TLC法鉴别利康颗粒中的红参”(《中医药信息》，2013，30(3)，59-61)公开了用甲醇回流法通过TLC鉴别利康颗粒中的红参的方法，具体如下：取利康颗粒，研细，精密称取30g，置500mL圆底烧瓶中，加甲醇200mL，置85℃水浴中回流l h，放冷，滤过取滤液250mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加热水50mL使溶解，转移至250mL分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次(50mL，50mL，50mL)，合并正丁醇液，用氨试液洗2次(50mL，50mL)，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲2mL使溶解，作为供试品溶液。吸取上述供试品溶液20μL，对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿一甲醇一水(13：7：2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。以上述方法对参鹿补片中药材红参中的人参皂苷Rg1进行鉴别时，尽管供试品色谱中的色带较深，但是在与对照品色谱相应位置上的斑点比较淡。因此，上述方法并不适用于参鹿补片中人参皂苷Rg1。
因此，建立一种参鹿补片中人参皂苷Rg1的TLC鉴别方法，对于参鹿补片的质量进行全面控制具有重要意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于现有的参鹿补片的检测方法检测的指标较为单一，不能检测其中的人参皂苷Rg1的含量，不利于从整体上对该中药制剂的质量进行有效控制，从而提出一种快速、全面、针对性强的参鹿补片的质量检测及质量控制的方法。
为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，该药物制剂的原料药组成为：红参、鹿肉、淫羊藿、狗脊、墨旱莲、玉竹、女贞子、熟地黄、锁阳、续断、白术、仙鹤草、党参、鸡血藤；
该检测方法包括如下对人参皂苷Rg1的鉴别方法：
取待测药物制剂，研细，加甲醇30～50mL，水浴回流0.5～2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20～40mL使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取1～3次，每次20～40mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水40～60mL洗涤，弃去水洗液，正丁醇蒸干，残渣加甲醇0.5～2mL使溶解，作为供试品溶液；
另取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1mL中含0.5～2mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5-10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％～15％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
优选地，本发明上述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，
所述对人参皂苷Rg1的鉴别方法如下：
取待测药物制剂，研细，加甲醇40mL，水浴回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水30mL使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水50mL洗涤，弃去水洗液，正丁醇蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
另取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1mL中含1mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5-10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
进一步优选地，本发明上述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，还包括如下对淫羊藿苷的含量测定方法：
取待测药物制剂，精密称定，研细，取1～3g，精密称定，置40～60mL容量瓶中，加入稀乙醇30～50mL，超声处理0.5～2小时，放冷，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，用稀乙醇制成每1mL中含5～15μg的溶液，即得对照品溶液；
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为25～35：65～75乙腈-水溶液为流动相，检测波长为260～280nm，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于2000；
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～15μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
进一步优选地，本发明上述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，所述对淫羊藿苷的含量测定方法具体如下：
取待测药物制剂，精密称定，研细，取2g，精密称定，置50mL容量瓶中，加入稀乙醇40mL，超声处理1小时，放冷，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，用稀乙醇制成每1mL中含10μg的溶液，即得对照品溶液；
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为29:71乙腈-水溶液为流动相，检测波长为270nm，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于2000；
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
进一步优选地，本发明上述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，所述超声处理的条件为：功率350W，频率35kHz。
进一步优选地，本发明上述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，还包括如下对齐墩果酸的鉴别方法：
取待测药物制剂，研细，加1～5％的氢氧化钠溶液20～40mL，超声处理20～60分钟，离心，上清液用盐酸调pH 1-4，用乙醚振摇提取1～3次，每次20～40mL，合并乙醚提取液,蒸干，残渣加甲醇0.5～2mL使溶解，作为供试品溶液；
另取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1mL含0.5～1.5mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5-10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为20：4：0.5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％～15％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
进一步优选地，本发明上述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，所述对齐墩果酸的鉴别方法具体如下：
取待测药物制剂，研细，加2％的氢氧化钠溶液30mL，超声处理30分钟，离心，上清液用盐酸调pH 2-3，用乙醚振摇提取2次，每次30mL，合并乙醚提取液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
另取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5-10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为20：4：0.5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
进一步优选地，本发明上述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，所述离心的条件为：以3000转/分钟的速度离心5分钟。
进一步优选地，本发明上述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，所述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的原料药组成为：红参18～22重量份、鹿肉27～33重量份、淫羊藿67.5～82.5重量份、狗脊67.5～82.5重量份、墨旱莲90～110重量份、玉竹22.5～27.5重量份、女贞子136～166重量份、熟地黄90～110重量份、锁阳46～56重量份、续断45～55重量份、白术67.5～82.5重量份、仙鹤草90～110重量份、党参45～55重量份、鸡血藤180～221重量份。
进一步优选地，本发明上述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，所述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的原料药组成为：红参20重量份、鹿肉30重量份、淫羊藿75重量份、狗脊75重量份、墨旱莲100重量份、玉竹30重量份、女贞子151重量份、熟地黄100重量份、锁阳51重量份、续断50重量份、白术75重量份、仙鹤草100重量份、党参50重量份、鸡血藤201重量份。
进一步优选地，本发明上述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，所述女贞子为酒制女贞子，所述白术为炒白术。
进一步优选地，本发明上述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，所述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的制备方法为：
以上十四味，取红参、鹿肉7.2～8.8重量份、淫羊藿7.2～8.8重量份、狗脊7.2～8.8重量份、墨旱莲9.9～12.1重量份、玉竹2.7～3.3重量份、女贞子15.3～18.7重量份、熟地黄1.8～2.2重量份、锁阳5.4～6.6重量份、续断0.9～1.1重量份、白术7.2～8.8重量份、仙鹤草9.9～12.1重量份、党参0.9～1.1重量份、鸡血藤19.8～24.2重量份、粉碎成细粉，过筛混匀；剩余鹿肉加水煎煮2～6小时，滤过；药渣与剩余淫羊藿等十三味加水煎煮二次，每次2～6小时，滤过，滤液与鹿肉合并，浓缩至80℃下相对密度为1.25～1.40的稠膏，加入上述细粉，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成临床可接受的剂型。
进一步优选地，本发明上述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，所述益气养血、补肾壮阳的药物制剂的制备方法为：
以上十四味，取红参、鹿肉8重量份、淫羊藿8重量份、狗脊8重量份、墨旱莲11重量份、玉竹3重量份、女贞子17重量份、熟地黄2重量份、锁阳6重量份、续断1重量份、白术8重量份、仙鹤草11重量份、党参1重量份、鸡血藤22重量份、粉碎成细粉，过筛混匀；剩余鹿肉加水煎煮4小时，滤过；药渣与剩余淫羊藿等十三味加水煎煮二次，每次4小时，滤过，滤液与鹿肉合并，浓缩至80℃下相对密度为1.32的稠膏，加入上述细粉，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成临床可接受的剂型。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：
本发明的益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，通过TLC法鉴别该中药制剂中的人参皂苷Rg1，解决了现有的红参的TLC鉴别法不适用于鉴别参鹿补片中药材红参中的人参皂苷Rg1的问题，该检测方法快速、全面、针对性强，进一步联合淫羊藿苷的含量测定方法和现有的齐墩果酸的TLC鉴别方法，有利于对该中药制剂的质量进行全面有效控制，有助于提高该药材使用的安全性和稳定性。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1是本发明实验例1中淫羊藿苷对照品溶液的HPLC图；
图2是本发明实验例1中益气养血、补肾壮阳的片剂的供试品溶液的HPLC图；
图3是本发明实验例1中淫羊藿苷对照品溶液的紫外扫描图；
图4是本发明实验例1中淫羊藿的阴性样品溶液的HPLC图；
图5是本发明实验例1中淫羊藿苷的标准曲线图；
图6是本发明实验例2中实施例5的TLC色谱图；
图7是本发明实验例2中对比例1的TLC色谱图。
具体实施方式
实施例1 一种益气养血、补肾壮阳的片剂的制备
本实施例益气养血、补肾壮阳的片剂的原料药组成为：红参20g、鹿肉30g、淫羊藿75g、狗脊75g、墨旱莲100g、玉竹25g、女贞子(酒制)151g、熟地黄100g、锁阳51g、续断50g、白术(炒)75g、仙鹤草100g、党参50g、鸡血藤201g；
按照以下方法进行制备：以上十四味，取红参、鹿肉8g、淫羊藿8g、狗脊8g、墨旱莲11g、玉竹3g、女贞子17g、熟地黄2g、锁阳6g、续断1g、白术8g、仙鹤草11g、党参1g、鸡血藤22g、粉碎成细粉，过筛混匀；剩余鹿肉加水煎煮4小时，滤过；药渣与剩余淫羊藿等十三味加水煎煮二次，每次4小时，滤过，滤液与鹿肉合并，浓缩至相对密度为1.32(80℃)的稠膏，加入上述细粉，混匀，制成颗粒，加入辅料适量，压制成1000片，包薄膜衣，即得。
实施例2 HPLC法测定益气养血、补肾壮阳的片剂中淫羊藿苷的含量
本实施例HPLC法测定益气养血、补肾壮阳的片剂中淫羊藿苷的含量，包括如下步骤：
取待测益气养血、补肾壮阳的片剂，精密称定，研细，取2g，精密称定，置50mL容量瓶中，加入稀乙醇40mL，在功率350W、频率35kHz的条件下超声处理1小时，放冷，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，用稀乙醇制成每1mL中含10μg的溶液，即得对照品溶液；
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为29:71乙腈-水溶液为流动相，检测波长为270nm，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于2000；
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
待测益气养血、补肾壮阳的片剂每片含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H40O15)计，应不得少于50μg。
实施例3 HPLC法测定益气养血、补肾壮阳的片剂中淫羊藿苷的含量
本实施例HPLC法测定益气养血、补肾壮阳的片剂中淫羊藿苷的含量，包括如下步骤：
取待测益气养血、补肾壮阳的片剂，精密称定，研细，取1g，精密称定，置60mL容量瓶中，加入稀乙醇30mL，在功率350W、频率35kHz的条件下超声处理2小时，放冷，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，用稀乙醇制成每1mL中含5μg的溶液，即得对照品溶液；
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为35：65乙腈-水溶液为流动相，检测波长为260nm，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于2000；
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例4 HPLC法测定益气养血、补肾壮阳的片剂中淫羊藿苷的含量
本实施例HPLC法测定益气养血、补肾壮阳的片剂中淫羊藿苷的含量，包括如下步骤：
取待测益气养血、补肾壮阳的片剂，精密称定，研细，取3g，精密称定，置40mL容量瓶中，加入稀乙醇50mL，在功率350W、频率35kHz的条件下超声处理0.5小时，放冷，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，用稀乙醇制成每1mL中含15μg的溶液，即得对照品溶液；
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为25：75乙腈-水溶液为流动相，检测波长为280nm，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于2000；
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例5 TLC法鉴别益气养血、补肾壮阳的片剂中人参皂苷Rg1
本实施例TLC法鉴别益气养血、补肾壮阳的片剂中人参皂苷Rg1的方法包括以下步骤：
取待测益气养血、补肾壮阳的片剂，研细，加甲醇40mL，水浴回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水30mL使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水50mL洗涤，弃去水洗液，正丁醇蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
另取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1mL中含1mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5-10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
待测益气养血、补肾壮阳的片剂的供试品色谱中，应在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例6 TLC法鉴别益气养血、补肾壮阳的片剂中人参皂苷Rg1
本实施例TLC法鉴别益气养血、补肾壮阳的片剂中人参皂苷Rg1的方法包括以下步骤：
取待测益气养血、补肾壮阳的片剂，研细，加甲醇30mL，水浴回流2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水60mL洗涤，弃去水洗液，正丁醇蒸干，残渣加甲醇0.5mL使溶解，作为供试品溶液；
另取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1mL中含2mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以15％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
实施例7 TLC法鉴别益气养血、补肾壮阳的片剂中人参皂苷Rg1
本实施例TLC法鉴别益气养血、补肾壮阳的片剂中人参皂苷Rg1的方法包括以下步骤：
取待测益气养血、补肾壮阳的片剂，研细，加甲醇50mL，水浴回流0.5小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40mL使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取1次，每次40mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水40mL洗涤，弃去水洗液，正丁醇蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；
另取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1mL中含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
实施例8 TLC法鉴别益气养血、补肾壮阳的片剂中齐墩果酸
本实施例TLC法鉴别益气养血、补肾壮阳的片剂中齐墩果酸的方法包括以下步骤：
取待测药物制剂，研细，加2％的氢氧化钠溶液30mL，超声处理30分钟，以3000转/分钟的速度离心5分钟，上清液用盐酸调pH 2-3，用乙醚振摇提取2次，每次30mL，合并乙醚提取液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
另取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5-10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为20：4：0.5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
待测益气养血、补肾壮阳的片剂的供试品色谱中，应在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
对比例1
本对比例TLC法鉴别益气养血、补肾壮阳的片剂中人参皂苷Rg1的方法包括以下步骤：
取待测药物制剂，研细，精密称取30g，置500mL圆底烧瓶中，加甲醇200mL，置85℃水浴中回流l h，放冷，滤过取滤液250mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加热水50mL使溶解，转移至250mL分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3次(50mL，50mL，50mL)，合并正丁醇液，用氨试液洗2次(50mL，50mL)，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲2mL使溶解，作为供试品溶液。吸取上述供试品溶液20μL，对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿一甲醇一水(13：7：2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。
实验例1 HPLC法测定益气养血、补肾壮阳的片剂中淫羊藿苷的含量的方法学验证
1、实验目的
对HPLC法测定益气养血、补肾壮阳的片剂中淫羊藿苷的含量进行方法学验证。
2、实验方法
2.1仪器、药品与试剂
高效液相色谱仪(安捷仑1200)，高效液相色谱仪(岛津LC-20AD)，包括在线脱气机，全自动进样器，紫外可变波长检测器；Diamonsil(钻石1代)C18 4.6i250mm 5μm色谱柱，Diamonsil(2)C18 4.6l250mm 5μm色谱柱，Spurisil C18 4.6紫250mm 5μm色谱柱，Sartorius BS电子天平(CP224S CP225D)；色谱纯乙腈，其它试剂均为分析纯；淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所提供，编号为110737-200415),实施例1制备的益气养血、补肾壮阳的片剂(即：参鹿补片，江西药都仁和制药有限期公司生产，批号见文内)。
2.2实验步骤
按照实施例2的方法进行测定。
2.3重复性实验
照上述条件分析，取淫羊藿苷对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积，具体实验结果如表1所示。
表1重复性实验的实验结果
由表1可知，HPLC法测定益气养血、补肾壮阳的片剂中淫羊藿苷的含量的重复性试验结果RSD为0.72％，这表明其重复性良好；且分离度均大于1.5，理论板数按淫羊藿苷峰计算均大于2000。
淫羊藿苷对照品溶液HPLC图如图1所示，益气养血、补肾壮阳的片剂的供试品溶液HPLC图如图2所示。
由图1和图2可知，淫羊藿苷对照品的和制剂中的其它组分均能达到基线分离。
2.4波长选择
取淫羊藿苷对照品一定量，加稀乙醇溶液使溶解，置UV-2450(岛津)紫外仪内扫描，结果淫羊藿苷在270nm处有一吸收峰，淫羊藿苷对照品溶液紫外扫描图如图3所示。故结合《中国药典》2010年版一部淫羊藿药材【含量测定】项下条件，选择淫羊藿苷270nm为检测波长。
2.5溶剂的选择
曾取淫羊藿苷对照品14.86mg，置100mL量瓶中，加无水乙醇70mL，超声，结果溶液一直呈混浊状态，不能完全溶解，再加入20mL水后超声，则能溶解，溶液呈澄清、透明状态。故参照《中国药典》2010年版一部淫羊藿药材【含量测定】项下条件以稀乙醇为溶剂。
2.6预试验
参照《中国药典》2010年版一部淫羊藿药材【含量测定】项下条件进行试验：淫羊藿苷对照品溶液约14.06μg/mL，供试品取样量分别为1g、2g，稀释倍数为50mL，进样量为10μL，结果取样量为2g的供试品溶液峰面积比对照品溶液峰面积还稍小，故拟定淫羊藿苷浓度应配制成10μg/mL、供试品取样量约为2g，稀释倍数为50，进样量为10μL。
2.7供试品溶液制备的条件考察
参考中国药典2010年版淫羊藿药材项下条件，采用稀乙醇作为溶剂，比较不同的超声提取时间(超声处理20、40、60、80分钟)对含量结果的影响，结果见表2。
表2不同的超声提取时间对含量结果的影响
样品编号 超声时间(分钟) 淫羊藿苷含量(mg/g)
1 20 55.8
2 40 62.9
3 60 70.2
4 80 70.1
由表2可知，超声处理60分钟比超声处理40分钟的含量高，超声处理60分钟与超声处理80分钟效果一样，故选择超声处理60分钟可以充分提取出供试品中的淫羊藿苷。
2.8专属性试验
按处方取不含淫羊藿的其它药材，按制法制成阴性样品，再按正文供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。淫羊藿的阴性样品溶液HPLC图如图4所示。
分别吸取淫羊藿苷对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10μL，分别注入液色谱仪，测定。
由图1、2和4可知，供试品色谱中，在与淫羊藿苷对照品溶液色谱相同保留时间处，有相应的色谱峰，且与其它组分均能达到基线分离；而阴性样品溶液色谱中，在与淫羊藿苷对照品色谱相同保留时间处无特征峰，证明阴性无干扰，本法具有专属性。
2.9线性关系的考察
精密称取淫羊藿苷对照品11.92mg，置100mL的量瓶中，加稀乙醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀,得母液(119.2μg/mL)，再分别精密吸取1.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL、9.0mL，分别置50mL量瓶中，用加稀乙醇稀释成不同浓度的对照品溶液：2.384μg/mL、7.152μg/mL、11.92μg/mL、16.688μg/mL、21.456μg/mL。分别精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按标准正文中色谱条件分析，测定峰面积，结果见表3。
表3线性关系考察结果
以淫羊藿苷的浓度(μg/mL)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，结果如图5所示。进行线性回归，得回归方程y＝20.274x–0.8025，相关系数r2＝1，表明淫羊藿苷在2.384～21.456μg/mL(进样量为10μL)范围内线性良好，呈一条直线，且几乎通过原点，可以用单点外标面积法测定并计算含量。
2.10精密度试验
取淫羊藿苷对照品溶液(浓度为11.92μg/mL)，连续进样6次，测定峰面积，结果见表4。
表4精密度试验结果
由表4可知，淫羊藿苷峰面积积分值的相对标准偏差为0.33％，小于2％，表明此法精密度良好。
2.11稳定性试验
取本品(批号为120801)，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，同时取淫羊藿苷对照品溶液(11.92μg/mL)，分别在放置0、2、4、6、8、10、12、24小时后，依法测定峰面积，计算含量，结果见表5。
表5稳定性试验结果
由表5可知，在放置24小时内的淫羊藿苷对照品峰面积、供试品峰面积以及两者峰面积比值、淫羊藿苷的含量的RSD均小于2％，稳定性良好。
2.12重复性试验
取本品(批号为110801)各6份，按正文中含量测定项下方法试验，测定淫羊藿苷的含量，结果见表6。
表6重复性试验结果
由表6可知，样品中淫羊藿苷含量的相对标准偏差均小于2％，表明此法重复性良好。
2.13加样回收试验
采用加样回收法，取本品(批号为120801，已知淫羊藿苷含量为232.03μg/g)1g共6份；精密称定，分别定量加入淫羊藿苷对照品适量，按正文中含量测定项下方法测定淫羊藿苷的含量，结果见表7。
表7回收率试验结果
由表7可知，淫羊藿苷平均回收率99.46％，相对标准偏差0.63％；表明此法回收率良好。
2.14耐用性试验
不同时间，不同人员分别采用不同的高效液相色谱仪及不同的色谱柱，在色谱条件如温度、流速、流动相比例稍改变的情况下，对同一批样品(110801)中淫羊藿苷的含量进行测定，结果见表8。
表8耐用性试验结果
由表8可知，不同时间，不同人员分别采用不同的高效液相色谱仪及不同的色谱柱，在色谱条件如温度、流速、流动相比例稍改变的情况下，对同一批样品(110801)中淫羊藿苷的含量进行测定，平均含量为232.08μg/g，RSD为1.66％，结果精密度良好，表明作为测定本品中的淫羊藿苷的含量方法，耐用性良好。
2.15样品测定
取本品6批，按正文中含量测定项下方法测定淫羊藿苷的含量，结果见表9。
表9参鹿补片中淫羊藿苷含量测定结果
批号 淫羊藿苷含量(μg/片)
130201 70.6
130202 71.2
130203 70.9
150301 71
150302 71
150303 71
结合上述6批样品的含量测定结果，拟定本品每片含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H40O15)计，不得少于50μg。
结论：以上试验结果表明，所建立的参鹿补片中淫羊藿苷的含量测定方法科学、简便，能有效地控制参鹿补片中淫羊藿苷的含量。
实验例2 TLC法鉴别益气养血、补肾壮阳的片剂中人参皂苷Rg1的方法学验证
按照实施例5的方法对实施例1制备的益气养血、补肾壮阳的片剂(即：参鹿补片，江西药都仁和制药有限期公司生产，批号120901、120902、1220903)三批各10片中人参皂苷Rg1进行鉴别，所得TLC色谱图见图6，其中：1表示的为阴性对照品，2表示的为人参皂苷Rg1对照品，3、4、5均表示的为参鹿补片。
由图6可知，人参皂苷Rg1的Rf约0.60，各供试品色谱中，在与人参皂苷Rg1对品色谱相应位置上，均显相同颜色的斑点，斑点清晰、圆整、分离理想，而阴性对照中却没有相应的斑点，证明方法可行，可用于本品中人参皂苷Rg1的检识。
对比例1的TLC色谱图如图7所示，其中，1表示的为阴性对照品，2表示的人参皂苷Rg1对照品，3、4、5均表示的为参鹿补片。
由图7可知，尽管供试品色谱中的色带较深，但是在与对照品色谱相应位置上的斑点比较淡。原因可能如下：采用氨试液洗涤会造成提取中人参皂苷Rg1的损失。因此，对比例1的方法并不适用于鉴别益气养血、补肾壮阳的片剂中人参皂苷Rg1。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，该药物制剂的原料药组成为：红参18～22重量份、鹿肉27～33重量份、淫羊藿67.5～82.5重量份、狗脊67.5～82.5重量份、墨旱莲90～110重量份、玉竹22.5～27.5重量份、女贞子136～166重量份、熟地黄90～110重量份、锁阳46～56重量份、续断45～55重量份、白术67.5～82.5重量份、仙鹤草90～110重量份、党参45～55重量份、鸡血藤180～221重量份；
所述药物制剂的制备方法为：
以上十四味，取红参、鹿肉7.2～8.8重量份、淫羊藿7.2～8.8重量份、狗脊7.2～8.8重量份、墨旱莲9.9～12.1重量份、玉竹2.7～3.3重量份、女贞子15.3～18.7重量份、熟地黄1.8～2.2重量份、锁阳5.4～6.6重量份、续断0.9～1.1重量份、白术7.2～8.8重量份、仙鹤草9.9～12.1重量份、党参0.9～1.1重量份、鸡血藤19.8～24.2重量份、粉碎成细粉，过筛混匀；剩余鹿肉加水煎煮2～6小时，滤过；药渣与剩余淫羊藿等十三味加水煎煮二次，每次2～6小时，滤过，滤液与鹿肉合并，浓缩至80℃下相对密度为1.25～1.40的稠膏，加入上述细粉，混匀，加入常规辅料、按照常规工艺制成临床可接受的剂型；
该检测方法包括如下对人参皂苷Rg1的鉴别方法：
取待测药物制剂，研细，加甲醇40mL，水浴回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水30mL使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水50mL洗涤，弃去水洗液，正丁醇蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
另取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1mL中含1mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以15％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；
还包括如下对齐墩果酸的鉴别方法：
取待测药物制剂，研细，加2％的氢氧化钠溶液30mL，超声处理30分钟，离心，上清液用盐酸调pH 2-3，用乙醚振摇提取2次，每次30mL，合并乙醚提取液,蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
另取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1mL含0.5～1.5mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5-10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为20：4：0.5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
2.根据权利要求1所述的益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，其特征在于，
所述对人参皂苷Rg1的鉴别方法如下：
取待测药物制剂，研细，加甲醇40mL，水浴回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水30mL使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的水50mL洗涤，弃去水洗液，正丁醇蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
另取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1mL中含1mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5-10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为13：7：2的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
3.根据权利要求1或2所述的益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，其特征在于，还包括如下对淫羊藿苷的含量测定方法：
取待测药物制剂，精密称定，研细，取1～3g，精密称定，置40～60mL容量瓶中，加入稀乙醇30～50mL，超声处理0.5～2小时，放冷，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，用稀乙醇制成每1mL中含5～15μg的溶液，即得对照品溶液；
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为25～35：65～75乙腈-水溶液为流动相，检测波长为260～280nm，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于2000；
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～15μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
4.根据权利要求3所述的益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述对淫羊藿苷的含量测定方法具体如下：
取待测药物制剂，精密称定，研细，取2g，精密称定，置50mL容量瓶中，加入稀乙醇40mL，超声处理1小时，放冷，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，用稀乙醇制成每1mL中含10μg的溶液，即得对照品溶液；
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为29:71乙腈-水溶液为流动相，检测波长为270nm，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于2000；
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.根据权利要求3所述的益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述超声处理的条件为：功率350W，频率35kHz。
6.根据权利要求3所述的益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述对齐墩果酸的鉴别方法具体如下：
取待测药物制剂，研细，加2％的氢氧化钠溶液30mL，超声处理30分钟，离心，上清液用盐酸调pH 2-3，用乙醚振摇提取2次，每次30mL，合并乙醚提取液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
另取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5-10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以体积比为20：4：0.5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
7.根据权利要求6所述的益气养血、补肾壮阳的药物制剂的检测方法，其特征在于，所述离心的条件为：以3000转/分钟的速度离心5分钟。
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