CN114609291B - 一种中药复方一贯煎的指纹图谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种中药复方一贯煎的指纹图谱检测方法，具体涉及一种中药制剂的检测方法，它是采用超高效液相色谱法检测。包括如下步骤：1.参照物溶液的制备；2.供试品溶液的制备；3.测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，对一贯煎试样溶液进行梯度洗脱。通过方法学考察，该方法具有专属性强、耐用性好、良好的回收率等效果；操作简便、快速、准确可靠，解决了现有技术难以有效对所含物质整体予以控制质量控制的技术问题，对一贯煎的质量控制提供了依据。
Description
技术领域
本发明涉及中药检测技术领域，尤其涉及一种中药复方一贯煎的指纹图谱检测方法。
背景技术
一贯煎处方来源于清代钱敏捷所著的《医方絜度》，方由北沙参、麦冬、当归、枸杞、生地黄、川楝子6味组成；水煎服；具有滋阴疏肝功能，主治肝肾阴虚，肝气不舒证，如胸脘胁痛，吞酸吐苦，咽干口燥，舌红少津，脉细弱或虚弦，并治疝气瘕聚。现代临床应用主要用于胃溃疡、胃炎、慢性肝炎、肋间神经痛、高血压、神经官能症等的治疗。
中药复方一贯煎由多味中药组成，所含的北沙参、麦冬、当归、枸杞、生地和川楝子在药物配伍中均占有较为重要的地位，如果用一两种当归、生地黄等的活性成分来说明中药一贯煎的内在质量，具有一定的片面性，直接影响了中药复方一贯煎的治疗效果，要控制中药一贯煎的功效，只针对其一两个化学成分进行表征和控制是不够的，必须对它的物质群整体予以控制，而中药指纹图谱在现代及未来的中药质量控制中均占有很重要的地位，符合中医中药整体性和模糊性的特点，其可分析中药中有效成分和无效成分的种类和含量分布的信息，随着越来越多的技术不断被应用于中药指纹图谱的研究，中药指纹图谱必在中药质量控制、中药药效成分研究、中药作用机制研究等多方面发挥更加重要的作用。
中国专利申请：CN201811383081.2，公布了一种使用HPLC测定中药一贯煎的指纹图谱方法，包括如下步骤：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂，以乙腈、甲醇中的一种或两种的混合物为流动相A，以甲酸水溶液、乙酸水溶液、磷酸水溶液中的一种为流动相B，对一贯煎试样溶液进行梯度洗脱，然后采用DAD检测器进行检测。其色谱柱内径为4.6mm,色谱柱柱长为250mm；十八烷基硅烷键合硅胶的粒径为2-10μm；优选地，十八烷基硅烷键合硅胶的粒径为5μm；选用乙腈为流动相A；流动相B中，甲酸水溶液的体积浓度为0.01％-1.5％，乙酸水溶液的体积浓度为0.01％-1.5％，磷酸水溶液的体积浓度为0.01％-1.5％；梯度洗脱过程中，流速为0.5-1.5ml/min，柱温为20-40℃；优选地，梯度洗脱过程中，流速为1.0ml/min，柱温为25℃；梯度洗脱过程中，流动相A、流动相B的比例变化为：0-10min，A相2％，B相98％；10-90min，A相12％，B相88％；90-120min，A相15％，B相85％；120-125min，A相35％，B相65％；125-135min，A相65％，B相35％；135-140min，A相95％，B相5％；140-150min，A相2％，B相98％；检测时检测波长为310-320nm；优选地，检测时检测波长为316nm；一贯煎试样溶液的进样量为8-12μl；优选地，一贯煎试样溶液的进样量为10μl；一贯煎试样溶液按以下工艺进行制备：在一贯煎干膏粉中加入甲醇，超声10-20min，放冷，滤过，得到一贯煎试样溶液；优选地，在一贯煎干膏粉中加入甲醇，超声10-20min，放冷，滤过，然后将滤液水浴蒸干，加入体积浓度为75-85％的甲醇水溶液溶解，摇匀滤过，得到一贯煎试样溶液。
上述发明存在不足之处：
1.该方法下检测样品，基线不平稳，各特征峰的峰型整体分离效果较差，个别特征峰还有拖尾；2.该方法洗脱时间为150min，检测时间太长，导致出峰较晚，乙腈耗用量大，成本高；3.该方法不能检测出一贯煎中所含药材北沙参、麦冬、川楝子特征峰，反映的信息不完全，难以有效对所含物质整体予以质量控制。
为了解决上述问题，本发明团队对中药复方一贯煎进行深入研发、考察，建立了一种中药复方一贯煎的指纹图谱检测方法，该方法操作简便、快速、全面、准确可靠，不仅克服了现有技术难以有效对所含物质整体予以质量控制的技术问题，还对一贯煎的质量控制提供了依据。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种中药复方一贯煎的指纹图谱检测方法，该方法操作简便、准确可靠，不仅有效控制中药一贯煎的功效，还能有效对所含物质整体予以控制。
本发明所述中药复方一贯煎的指纹图谱检测方法，其中所述一贯煎的处方由中药材：北沙参5.60g、麦冬5.60g、当归5.60g、枸杞子11.19g、地黄11.19g、川楝子7.46g组成，以上六味加水煎煮两次，第一次加10倍量水浸泡30分钟，煎煮30分钟，煎液过200目筛；第二次加8倍量水，煎煮30分钟，煎液过200目筛，合并煎液，冷冻干燥即得；其特征在于，它是采用超高效液相色谱法检测，包括如下步骤：
S1、参照物溶液的制备：取绿原酸对照品、阿魏酸对照品、毛蕊花糖苷对照品、川楝素对照品、藁本内酯对照品、焦地黄苯乙醇苷A1对照品、洋川芎内酯I对照品、麦冬甲基黄烷酮A对照品、麦冬甲基黄烷酮B对照品加甲醇溶解，即得；
S2、供试品溶液的制备：取本品1.5～2.5g，精密称定，加水20～40ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇提取2～3次，每次35～45ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S3、测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，梯度洗脱程序如下：
优选的，步骤S1所述参照物溶液每1ml各含20μg的绿原酸对照品、阿魏酸对照品、毛蕊花糖苷对照品、川楝素对照品、藁本内酯对照品、焦地黄苯乙醇苷A1对照品、洋川芎内酯I对照品、麦冬甲基黄烷酮A对照品、麦冬甲基黄烷酮B对照品溶液。
优选的，步骤S2所述供试品制备为取本品2g，精密称定，加水30ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
优选的，步骤S2所述提取为振摇提取。
优选的，步骤S2所述蒸干为100℃水浴蒸干或60-80℃旋转蒸发仪减压蒸干。
进一步优选的，步骤S2所述蒸干为80℃旋转蒸发仪减压蒸干。
优选的，步骤S3所述色谱条件中检测波长为0～70分钟、75～90分钟为300nm，70～75分钟为210nm。
优选的，步骤S3所述色谱条件中色谱柱为CORTECS T3，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm。
优选的，步骤S3所述色谱条件中色谱柱柱温为25-30℃，流速为0.20～0.25ml/min，进样量为1μl。
进一步优选的，步骤S3所述色谱条件中色谱柱柱温为30℃，流速为0.25ml/min，进样量为1μl。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、本发明是采用超高效液相色谱法测定一贯煎的指纹图谱检测方法，该方法具有操作简便、快速、全面、准确可靠的优点，适合检测一贯煎水煎煮液的指纹图谱，克服了中药一贯煎质量控制的单一性和片面性，克服了现有技术难以有效对所含物质整体予以质量控制的技术问题，还对一贯煎的质量控制提供了依据。
2、本发明建立的指纹图谱经方法学考察显示，专属性、整体性、仪器精密度、重复性、稳定性良好；不同流速、不同柱温、不同色谱柱、不同仪器条件下测定结果基本一致，色谱图中各共有峰峰型尖锐，对称，分离度良好，相似度均不低于0.90，供试品指纹图谱中呈现主要色谱峰与对照品参照物色谱峰中的特征峰相对应，表明该方法对不同流速、不同柱温、不同仪器耐用性良好；溶液在24小时内稳定性良好。
3、本发明中通过优化测定方法，在210nm和300nm波长处测定，其出峰信息较多，峰形好，能清楚呈现出一贯煎的全部组成成分的专属特征峰，易于鉴别，建立的指纹图谱技术含量高，反映的信息较完全，避免了中药一贯煎质量控制的单一性和片面性，能有效反映中药一贯煎的质量；其中，通过对指纹图谱中北沙参、麦冬、当归、生地黄、枸杞子、川楝子专属峰的有无，可有效对中药一贯煎的质量进行评价，保证药材质量的稳定性以及临床用药的有效性和安全性。
4、本发明通过指纹图谱色谱峰指认，能表征特征色谱峰共15个，指认色谱峰9个，分别为绿原酸(峰3)、阿魏酸(峰5)、焦地黄苯乙醇苷A1(峰7)、洋川芎内酯I(峰9)、毛蕊花糖苷(峰10)、川楝素(峰12)、藁本内酯(峰13)、麦冬甲基黄烷酮A(峰14)、麦冬甲基黄烷酮B(峰15)。
5、本发明通过指纹图谱色谱峰指认，能表征一贯煎方中所有药味，分别为枸杞子、当归、地黄、麦冬、北沙参、川楝子，可表征枸杞子药味5个特征峰；当归药味6个特征峰；地黄药味7个特征峰；麦冬药味3个特征峰；北沙参药味3个特征峰；川楝子药味1个特征峰；其中峰1、峰2、峰3、峰4、峰8归属于枸杞子药味；峰2、峰3、峰4、峰5、峰9、峰13归属于当归药味；峰2、峰3、峰5、峰6、峰7、峰10、峰11归属于地黄药味；峰4、峰14、峰15归属于麦冬药味；峰2、峰3、峰5归属于北沙参药味；峰12归属于川楝子药味。
附图说明
图1为一贯煎基准样品指纹图谱流动相考察图；
图2为一贯煎基准样品全波段扫描光谱图；
图3为一贯煎基准样品提取溶剂用量考察指纹图谱；
图4为一贯煎基准样品蒸干方式考察指纹图谱；
图5为一贯煎基准样品蒸干温度考察指纹图谱；
图6为专属性考察指纹图谱；
图7为整体性考察指纹图谱；
图8为色谱柱：InfinityLab Poroshell 120EC-C18指纹图谱；
图9为色谱柱：CORTECS UPLC T3指纹图谱；
图10为色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18指纹图谱；
图11为色谱柱：Luna Omega C18指纹图谱；
图12为色谱柱：Endeavorsil C18指纹图谱；
图13为不同柱温耐用性指纹图谱对比图；
图14为不同流速耐用性指纹图谱对比图；
图15为仪器：Agilent 1290耐用性指纹图谱；
图16为仪器：WatersH-class耐用性指纹图谱；
图17为一贯煎基准样品归属指纹图谱；
图18为当归单煎指纹图谱；
图19为地黄单煎指纹图谱；
图20为川楝子单煎指纹图谱；
图21为麦冬单煎指纹图谱；
图22为枸杞子单煎指纹图谱；
图23为北沙参单煎指纹图谱；
图24为空白溶剂(甲醇)指纹图谱；
图25为阿魏酸、毛蕊花糖苷指纹图谱；
图26为绿原酸指纹图谱；
图27为焦地黄苯乙醇苷A1指纹图谱；
图28为洋川芎内酯I指纹图谱；
图29为川楝素指纹图谱；
图30为藁本内酯指纹图谱；
图31为麦冬甲基黄烷酮A指纹图谱；
图32为麦冬甲基黄烷酮B指纹图谱；
图33为一贯煎15批基准样品水煎液指纹图谱叠加图。
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1
本发明提出的一种中药复方一贯煎的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：
(1)参照物溶液的制备：取绿原酸对照品、阿魏酸对照品、毛蕊花糖苷对照品、川楝素对照品、藁本内酯对照品、焦地黄苯乙醇苷A1对照品、洋川芎内酯I对照品、麦冬甲基黄烷酮A对照品、麦冬甲基黄烷酮B对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：取本品2g，精密称定，加水30ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，用旋转蒸发仪减压蒸干(80℃)，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；色谱条件如下：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱为CORTECS T3，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.25ml/min；柱温为30℃；检测波长：0～70分钟、75～90分钟为300nm，70～75分钟为210nm；进样量为1μl；理论塔板数按阿魏酸峰计算应不低于5000；
实施例2
本发明提出的一种中药复方一贯煎的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：
(1)参照物溶液的制备：取绿原酸对照品、阿魏酸对照品、毛蕊花糖苷对照品、川楝素对照品、藁本内酯对照品、焦地黄苯乙醇苷A1对照品、洋川芎内酯I对照品、麦冬甲基黄烷酮A对照品、麦冬甲基黄烷酮B对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为参照物溶液；
(2)供试品溶液的制备：取本品2g，精密称定，加水30ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，用水浴(100℃)蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，即得；色谱条件如下：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为CORTECS T3，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.25ml/min；柱温为30℃；检测波长：0～70分钟、75～90分钟为300nm，70～75分钟为210nm；进样量为1μl；理论塔板数按阿魏酸峰计算应不低于5000；
实施例3
本发明提出的一种中药复方一贯煎的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：
(1)参照物溶液的制备：取绿原酸对照品、阿魏酸对照品、毛蕊花糖苷对照品、川楝素对照品、藁本内酯对照品、焦地黄苯乙醇苷A1对照品、洋川芎内酯I对照品、麦冬甲基黄烷酮A对照品、麦冬甲基黄烷酮B对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为参照物溶液；
(2)供试品溶液的制备：取本品2.5g，精密称定，加水40ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次45ml，合并正丁醇液，用旋转蒸发仪减压蒸干(80℃)，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；色谱条件如下：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为CORTECS T3，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.20ml/min；柱温为28℃；检测波长：0～70分钟、75～90分钟为300nm，70～75分钟为210nm；进样量为1μl；理论塔板数按阿魏酸峰计算应不低于5000；
实施例4
本发明提出的一种中药复方一贯煎的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：
(1)参照物溶液的制备：取绿原酸对照品、阿魏酸对照品、毛蕊花糖苷对照品、川楝素对照品、藁本内酯对照品、焦地黄苯乙醇苷A1对照品、洋川芎内酯I对照品、麦冬甲基黄烷酮A对照品、麦冬甲基黄烷酮B对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为参照物溶液；
(2)供试品溶液的制备：取本品1.5g，精密称定，加水20ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，用旋转蒸发仪减压蒸干(70℃)，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得：色谱条件如下：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为CORTECS T3，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.20ml/min；柱温为25℃；检测波长：0～70分钟、75～90分钟为300nm，70～75分钟为210nm；进样量为1μl；理论塔板数按阿魏酸峰计算应不低于5000；
实施例5
本发明提出的一种中药复方一贯煎的指纹图谱检测方法，包括如下步骤：
(1)参照物溶液的制备：取绿原酸对照品、阿魏酸对照品、毛蕊花糖苷对照品、川楝素对照品、藁本内酯对照品、焦地黄苯乙醇苷A1对照品、洋川芎内酯I对照品、麦冬甲基黄烷酮A对照品、麦冬甲基黄烷酮B对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：取本品2g，精密称定，加水30ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，用旋转蒸发仪减压蒸干(60℃)，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；色谱条件如下：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱为CORTECS T3，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.25ml/min；柱温为28℃；检测波长：0～70分钟、75～90分钟为300nm，70～75分钟为210nm；进样量为1μl；理论塔板数按阿魏酸峰计算应不低于5000；
为了进一步验证本发明的可行性，发明人进行了一系列的试验，具体如下：
指纹图谱方法摸索试验
中药一贯煎总共有六味药材组成，每味药材均起到重要作用，若一两种当归、生地黄等的活性成分来说明中药一贯煎的内在质量，具有一定的单一性和片面性，直接影响了中药复方一贯煎的治疗效果，要控制中药一贯煎的功效，只针对其一两个化学成分进行表征和控制是不够的，必须对它的物质群整体予以控制，因而物质基准质量控制以指纹图谱为整体质量控制。
1、仪器、试剂与试药
仪器：Waters ACQUITY H-Class UPLC超高效液相色谱仪(Waters公司)；Empower3工作站(Waters公司)；ME204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；MS105DU微量天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ-600DB超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；电控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)；超纯水系统(上海和泰超纯水机)；
试剂：乙腈(色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司)；磷酸(ACS级试剂，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；其它试剂均为分析纯；
试药：绿原酸对照品、阿魏酸对照品、毛蕊花糖苷对照品、川楝素对照品、藁本内酯对照品均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-201817、110773-201614、111530-201713、111842-201804、111737-201608；洋川芎内酯I对照品、麦冬甲基黄烷酮A对照品、麦冬甲基黄烷酮B对照品、焦地黄苯乙醇苷A1对照品购自成都德思特生物技术有限公司，批号分别为DST180723-009、DST190426-022、DST180601-001、DST190222-070；一贯煎基准样品冻干粉由本单位制备提供，批号为：YGJ210712-01DGF。
2、色谱条件
2.1流动相的考察
分别考察流动相为乙腈-水、乙腈-0.05％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.1％醋酸水。通过考察不同流动相的基线情况、色谱峰分离效果、峰纯度、色谱峰个数等情况，筛选色谱条件方法。结果见图1。
通过比较不同流动相发现，甲酸乙酸在末端存在吸收干扰测定，使得峰型波动较大，而以乙腈-0.1％磷酸溶液作为流动相洗脱时，基线平稳，各特征峰的峰型整体分离效果较好，无明显拖尾，保留值适宜，最终优选乙腈-0.1％磷酸为流动相。
2.2检测波长的确定
取一贯煎基准样品(批号YGJ210712-01DGF)2g，精密称定，加水30ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，用旋转蒸发仪减压蒸干(80℃)，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，精密吸取样品溶液1μl注入液相色谱，按色谱条件以PDA检测器记录190～400nm范围内的吸收光谱。结果见图2。
根据全波长扫描的光谱图结果，在300nm出一贯煎基准样品溶液可以检测到色谱峰较多，且色谱峰的响应值较好，在70～75分钟内于210nm出响应值最高。故优选指纹图谱方法的最佳检测波长为0～70分钟、75～90分钟为300nm，70～75分钟为210nm。
2.3色谱条件的确定
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.25ml；柱温为30℃；检测波长：0～70分钟、75～90分钟为300nm，70～75分钟为210nm；进样量为1μl。
表1梯度洗脱表
3、参照物溶液的制备
取绿原酸对照品、阿魏酸对照品、毛蕊花糖苷对照品、川楝素对照品、藁本内酯对照品、焦地黄苯乙醇苷A1对照品、洋川芎内酯I对照品、麦冬甲基黄烷酮A对照品、麦冬甲基黄烷酮B对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
4、供试品溶液制备方法考察
采用确定的色谱条件，以色谱峰个数、总峰面积、峰高、分离度和纯度等为评价指标，对提取溶剂用量和供试品溶液蒸干方式、蒸干温度进行考察。同时分析各含量测定指标成分是否已提取完全，判断指纹图谱方法是否可以用于指标成分的含量测定。考察结果如下：
4.1提取溶剂用量考察
取一贯煎基准样品(批号：YGJ210712-01DGF)2g平行3组，精密称定，加水30ml，振摇使溶解，分别用水饱和正丁醇振摇提取3次，第一组每次30ml、第二组每次40ml、第三组每次50ml，合并正丁醇液于旋转蒸发仪内80℃蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，精密吸取样品溶液1μl注入液相色谱，考察特征峰的峰型和分离度，并计算特征峰的“总峰面积/称样量”，实验结果见图3、表2。
表2提取溶剂用量考察
结果表明：通过考察90ml、120ml、150ml提取溶剂提取所得的峰面积与取样量的比值，发现提取溶剂过少会提取不完全，提取溶剂过多造成蒸干时间过长，使藁本内酯峰面积降低，故优选提取溶剂用量为“120ml”。
4.2供试品溶液蒸干方式考察
取一贯煎基准样品(批号：YGJ210712-01DGF)2g平行2组，精密称定，加水30ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，分别用水浴蒸干和旋蒸仪蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，精密吸取样品溶液1μl注入液相色谱，考察特征峰的峰型和分离度，实验结果见图4。
结果表明：通过比较80℃旋蒸和100℃水浴蒸干的峰型，发现旋蒸的样品1、2、3号峰和藁本内酯的峰响应值更高，故最优选蒸干方式为“旋蒸仪蒸干”。
4.3供试品溶液蒸干温度考察
取一贯煎基准样品(批号YGJ210712-01DGF)2g，精密称定，加水30ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，平均分成3组于旋转蒸发仪内分别用60℃、70℃、80℃蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，精密吸取样品溶液1 μl注入液相色谱，考察特征峰的峰型和分离度，并比较特征峰的总峰面积，实验结果见图5、表3。
表3蒸干温度考察
结果表明：通过比较60℃、70℃、80℃旋蒸的峰型，发现80℃旋蒸的样品特征峰的总峰面积最高，故优选旋蒸蒸干温度为“80℃”。
4.4供试品溶液制备方法的确定
最终确定供试品溶液的制备方法为：取本品2g，精密称定，加水30ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，用旋转蒸发仪减压蒸干(80℃)，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5、方法的初步确定
照高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验色谱条件以CORTECS T3(2.1×150mm，1.6μm)为色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按表4中的规定进行梯度洗脱；检测波长：0～70分钟、75～90分钟为300nm，70～75分钟为210nm，柱温30℃，流速为0.25mL/min，进样量为1μl。
表4梯度洗脱表
参照物溶液的制备取绿原酸对照品、阿魏酸对照品、毛蕊花糖苷对照品、川楝素对照品、藁本内酯对照品、焦地黄苯乙醇苷A1对照品、洋川芎内酯I对照品、麦冬甲基黄烷酮A对照品、麦冬甲基黄烷酮B对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品2g，精密称定，加水30ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，用旋转蒸发仪减压蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
6、方法学考察
6.1专属性考察
结果显示，通过专属性试验考察，溶剂对一贯煎基准样品的测定没有干扰，表明该方法专属性良好；在延长一倍时间内没有色谱峰，整体性良好。具体见图6。
6.2整体性考察
在确定的色谱条件上，保持最高流动相比例，延长洗脱一倍时间，色谱条件见下表5，取专属性下基准样品进样分析特征图谱，结果见图7。
表5梯度洗脱表
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结果显示，通过整体性试验考察，在延长一倍时间后无色谱峰，表明该色谱条件基本满足信息最大的原则。
6.3精密度试验
取一贯煎基准样品2.0g(批号：YGJ210712-DGF)，精密称定，按“5、方法的初步确定”项下供试品溶液的制备和测定法操作，连续进样6次，以阿魏酸色谱峰为参照峰S1，以毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰S2，计算各特征峰与S峰的相对保留时间、相似度(相对峰面积)，测定结果见表6和表7。
表6指纹图谱精密度试验相对保留时间结果(n＝6)
表7指纹图谱仪器精密度试验相对峰面积结果(n＝6)
结果显示，同一份供试品溶液连续进样6次，以阿魏酸色谱峰为参照峰S1，以毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰S2，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD值在0.0％～0.4％范围内，小于5.0％，表明仪器精密度良好。
6.4重复性试验
取本品(批号：YGJ210712-DGF)约2.0g，平行6份，精密称定，按“5、方法的初步确定”项下供试品溶液的制备和测定法操作，以阿魏酸色谱峰为参照峰S1，以毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰S2，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，测定结果见表8和表9。
表8重复性试验相对保留时间结果(n＝6)
表9重复性试验相对峰面积结果(n＝6)
结果显示，同一批样品重复测定6次，以阿魏酸色谱峰为参照峰S1，以毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰S2，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD值在0.0％～0.5％范围内，表明该方法重复性良好。
6.5中间精密度考察
由不同的分析人员在不同时间于不同的仪器上操作，取一贯煎基准样品(批号：YGJ210712-DGF)约2.0g，平行6份，精密称定，按“5、方法的初步确定”项下方法制备6份供试品溶液，按“5、方法的初步确定”项下色谱条件进样分析，以阿魏酸色谱峰为参照峰S1，以毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰S2，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，实验结果见表10和表11。
表10中间精密度考察结果(相对保留时间)
表11中间精密度考察结果(相对峰面积)
人员1：张一赘：操作时间：2021/11/16；色谱仪：WatersACQUITYHclass：设备编码：Z-05094
人员2：马索娟：操作时间：2021/11/18：色谱仪：WatersACQUITITYHclass：设备编码：Z-05-080
结果显示，由不同的分析人员在不同时间于不同的仪器上操作，同一批样品重复测定6次，以阿魏酸色谱峰为参照峰S1，以毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰S2，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD值在0.0％～0.5％范围内。相对保留时间与重复性试验6个数据的RSD值在0.0％～0.8％范围内。表明各特征峰的相对保留时间中间精密度良好。
6.6稳定性试验
取本品(批号：YGJ210712-DGF)约2.0g，精密称定，按“5、方法的初步确定”项下供试品溶液的制备和测定法操作，分别在制备后放置0、2、4、8、12、18、24小时后进样测定，以阿魏酸特征峰为参照峰S1，以毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰S2，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，测定结果见表12和表13。
表12稳定性考察结果试验相对保留时间结果(n＝6)
表13稳定性考察结果试验相对峰面积结果(n＝6)
结果显示，同一份供试品溶液分别在0，2，4，8，16，24小时进样分析，以阿魏酸色谱峰为参照峰S1，以毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰S2，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD值在0.0％～0.8％范围内，表明供试品溶液在24小时内相对稳定。
6.7耐用性试验
考察了不同色谱柱、不同柱温、不同流速、不同仪器对本色谱条件的耐用性，谱采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行结果分析，计算相似度，测定结果见图8-16。
6.7.1不同色谱柱考察
比较不同色谱柱对一贯煎基准样品指纹图谱中各色谱峰分离度的影响，本次考察了5种色谱柱，分别是InfinityLab Poroshell 120 EC-C18，2.1*150mm*2.7mm，(S.N.USCGB05486)、COR TECS UPLC T3，2.1*150mm*1.6mm，(S.N.01173022515405)、ACQUITY UPLC BEH Shield RP 18，2.1*150mm*1.7mm，(S.N.01913104618568)、Luna OmegaC18，2.1*150mm*1.6mm，(S.N.H21-052462)、Endeavorsil C18，2.1*150mm*1.8mm，(S.N4103593)，结果见图8-12。
结果显示，不同型号不同填料的色谱柱耐用性较差，通过比较各色谱峰的分离度，故优选色谱柱为CORTECS UPLC T3，(2.1×150mm，1.6μm)。
6.7.2不同柱温的考察
采用CORTECS T3(2.1×150mm，1.6μm)色谱柱，取一贯煎基准样品(批号YGJ210712-DGF)2g，精密称定，按“5、方法的初步确定”项下方法制备供试品溶液，除柱温分别为25℃、28℃、30℃外，其他色谱条件按“方法的初步确定”项下的规定进样分析，分别考察柱温为25℃、28℃、30℃时样品的分离效果，实验结果见图13。
结果表明，通过比较25℃、28℃和30℃主要指征峰的分离度，发现30℃时S峰的分离度最好，25℃和28℃相比在峰型一致的情况下存在包峰现象，故柱温优选为30℃。
6.7.3不同流速的考察
采用CORTECS T3(2.1×150mm，1.6μm)色谱柱，取一贯煎基准样品(批号YGJ210712-01DGF)2g，精密称定，按“5、方法的初步确定”项下方法制备供试品溶液，分别考察流速为0.2ml/min、0.25ml/min时样品的分离效果，结果见图14。
结果表明，通过比较流速为0.2ml/min、0.25ml/min主要指征峰的分离度，发现流速为0.25ml/min的分离度最好，故流速优选为0.25ml/min。
6.7.4不同仪器的考察
采用CORTECS T3(2.1×150mm，1.6μm)色谱柱，取一贯煎基准样品(批号YGJ210712-DGF)2g，精密称定，按“5、方法的初步确定”项下方法制备供试品溶液，按“方法的初步确定”项下色谱条件分别在Agilent 1290和Waters H-class色谱仪进样分析，考察样品的分离效果。以阿魏酸特征峰为参照峰S1，毛蕊花糖苷特征峰为S2，计算各特征峰于S峰的相对保留时间以及相对峰面积，并计算RSD值。实验结果见表14，见图15-16。
表14仪器对分离效果的影响(相对保留时间)
结果显示，不同仪器对各特征峰与S峰的相对保留时间影响较小，相对保留时间均在规定值的±10％之内，耐用性较好。
6.7.5耐用性小结
耐用性考察结果表明，该特征图谱方法对不同品牌的色谱柱耐用性较差。采用CORTECS T3色谱柱各特征峰的峰型整体分离效果较好。因此，建议在特征图谱的色谱条件下，优选的固定色谱柱为CORTECS T3色谱柱，以阿魏酸为参照峰S1，毛蕊花糖苷为参照峰S2，特征峰与S峰的相对保留时间受柱温、流速、色谱柱型号及仪器型号影响较小。而相对峰面积对柱温、流速、色谱柱型号及仪器型号耐用性很差，因此在标准的制定中只对各特征峰的相对保留时间做出规定，对相对峰面积不作要求。
6.8色谱峰的指认和归属
一贯煎基准样品制备：取本品2g，精密称定，加水30ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，用旋转蒸发仪减压蒸干(80℃)，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
当归单煎、地黄单煎、川楝子单煎、麦冬单煎、北沙参单煎、枸杞子单煎按上述一贯煎样品的制备方法制备，作为供试品溶液，按已确定色谱条件进样分析，同时将绿原酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、川楝素、藁本内酯、焦地黄苯乙醇苷A1、洋川芎内酯I、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。以表、图形式提供指纹图谱方法的色谱峰指认和归属结果，并详细分析色谱峰个数、色谱峰指认、色谱峰归属、表征的药味等结果。色谱峰归属结果见表15和图17-32。
表15-贯煎基准样品药味特征峰归属表
结果显示：本方法能表征特征色谱峰共15个，指认色谱峰9个，分别为绿原酸(峰3)、阿魏酸(峰5)、焦地黄苯乙醇苷A1(峰7)、洋川芎内酯I(峰9)、毛蕊花糖苷(峰10)、川楝素(峰12)、藁本内酯(峰13)、麦冬甲基黄烷酮A(峰14)、麦冬甲基黄烷酮B(峰15)；本方法能表征一贯煎方中所有药味，分别为枸杞子、当归、地黄、麦冬、北沙参、川楝子，可表征枸杞子药味5个特征峰；当归药味6个特征峰；地黄药味7个特征峰；麦冬药味3个特征峰；北沙参药味3个特征峰；川楝子药味1个特征峰；峰1、峰2、峰3、峰4、峰8归属于枸杞子药味；峰2、峰3、峰4、峰5、峰9、峰13归属于当归药味；峰2、峰3、峰5、峰6、峰7、峰10、峰11归属于地黄药味；峰4、峰14、峰15归属于麦冬药味；峰2、峰3、峰5归属于北沙参药味；峰12归属于川楝子药味。
6.9不同批次对应实物的确认
分别取15批一贯煎基准样品各2g，按“5、方法的初步确认”项下方法制备供试品溶液和进样分析，以阿魏酸色谱峰为参照峰S1，以毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰S2，分析不同批次对应实物的色谱峰个数和分离效果，分析指纹图谱方法的可行性和适用性。计算各特征峰与S峰的相对保留时间，并计算RSD值，分析不同批次对应实物的相似度计算结果，分析共有峰个数。实验结果见表16至表17。
表1615批基准样品冻干粉指纹图谱(相对保留时间)
表17 15批基准样品冻干粉指纹图谱(相对峰面积)
结果表明：不同批次对应实物的特征峰基本一致，色谱峰的分离效果均较理想。
6.1015批不同样品的相似度评价
将15批一贯煎基准样品的特征图谱采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行结果分析，叠加图见图31，相似度计算结果见表18。
表18一贯煎15批基准样品水煎液指纹图谱相似度结果
结果表明：15批一贯煎基准样品冻干粉的指纹图谱相似度均大于0.9，相似度较高；含共有峰15个；指纹图谱方法具有可行性和适用性。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域或技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种中药复方一贯煎的指纹图谱检测方法，其中所述一贯煎的处方由中药材：北沙参5.60g、麦冬5.60g、当归5.60g、枸杞子11.19g、地黄11.19g、川楝子7.46g组成，以上六味加水煎煮两次，第一次加10倍量水浸泡30分钟，煎煮30分钟，煎液过200目筛；第二次加8倍量水，煎煮30分钟，煎液过200目筛，合并煎液，冷冻干燥即得；其特征在于，它是采用超高效液相色谱法检测，包括如下步骤：
S1、参照物溶液的制备：取绿原酸对照品、阿魏酸对照品、毛蕊花糖苷对照品、川楝素对照品、藁本内酯对照品、焦地黄苯乙醇苷A1对照品、洋川芎内酯I对照品、麦冬甲基黄烷酮A对照品、麦冬甲基黄烷酮B对照品加甲醇溶解，制成每1ml各含20μg的溶液，即得；
S2、供试品溶液的制备：取本品2g，精密称定，加水30ml，振摇使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次40ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至3ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S3、测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得；色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱为CORTECS T3，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm；检测波长为0～70分钟、75～90分钟为300nm，70～75分钟为210nm；柱温为30℃，流速为0.25ml/min，进样量为1μl；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，梯度洗脱程序如下：
。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S2所述蒸干为80℃旋转蒸发仪减压蒸干。
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