CN115684429B - 一种包含地黄的中药组合物的质量控制方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含地黄的中药复方的检测方法，其包括如下步骤：取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中该中药复方由北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子组成，该对照品为地黄苷D、甜菜碱、阿魏酸、芦丁、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I、焦地黄苯乙醇苷A1、洋川芎内酯H、藁本内酯和/或川楝素，根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或成分及其含量信息。本发明对包含地黄的中药复方的化学成分进行了全面系统地解析，为质量控制和药效物质基础的深入研究提供了理论依据。

Description

一种包含地黄的中药组合物的质量控制方法与应用

技术领域

本发明涉及中药质量鉴定技术领域，具体涉及一种包含地黄的中药组合物的质量控制方法与应用。

背景技术

随着我国中药制剂的快速发展，中药制剂的质量管理问题也受到了人们的广泛关注，其质量的优劣会直接影响到医疗质量和患者生命安危。中药(包括单味中药和中药复方)指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。与指标成分含量测定的质量分析方法相比，指纹图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量，在中药复方制剂有效成分尚未完全阐明的现状下，可实现对中药内在质量的综合评价和对其整理物质的有效控制，是目前中药标准汤剂及其制剂质量控制的有效手段之一。中药指纹图谱的检测方法有色谱法、光谱法、波谱法等。色谱法主要包括薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳、液质联用等，其中高效液相色谱法具有高效、快速、灵敏、重现性好的特点，与紫外检测器(UV)、二极管阵列检测器(DAD)、蒸发光散射检测器(ELSD)和质谱检测器(MS)等对种检测器联用，可用于中药中对多种复杂成分的分析检测。

中药特征图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药制剂及中间体质量的真实性、优良性和稳定性。在目前中药及其制剂的有效成分尚未能完全阐明的情况下，相较于指标成分含量测定，特征图谱能更好的从整体性客观反映中药制剂的质量，是目前中药及其制剂质量有效控制的主流手段之一。

目前，尚未见文献报道对包含地黄的中药复方的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究。

鉴于上述原因，建立准确有效且能整体表征中药复方内在质量的监控手段尤为重要，故对本申请的包含地黄的中药复方的特征图谱进行研究，以方便更加客观的从整体上评价该中药复方的内在质量。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种包含地黄的中药复方成分检测方法及其指纹图谱构建方法。该检测方法测得的图谱能较全面的反映上述中药复方中的化学成分，且各色谱峰分离度较好，峰型好，重复性较好，基线平稳，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量，准确、可靠、稳定、有效，从而对其质量能够进行有效地监控，提高包含地黄的中药复方的质量从而保证疗效。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种包含地黄的中药复方的检测方法，其包括如下步骤：取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中该中药复方由北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子组成，该对照品为地黄苷D、甜菜碱、阿魏酸、芦丁、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I、焦地黄苯乙醇苷A1、洋川芎内酯H、藁本内酯和/或川楝素，该检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶或两性离子型亲水相互作用硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为水溶液、酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，流速为0.6～1.5mL/min，柱温为20～45℃，检测波长为200～350nm；根据检测结果，获得该中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。

进一步地，该信息为根据所记录的该中药复方供试品溶液的色谱图和该对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算该中药复方中以下成分中一种或多种的含量：地黄苷D、甜菜碱、阿魏酸、芦丁、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I、焦地黄苯乙醇苷A1、洋川芎内酯H、藁本内酯和川楝素。进一步地，该中药复方供试品溶液的制备方法包括：称取适量的各味中药颗粒粉末，混合得到中药复方粉末，加入适量的水进行煎煮，加热至沸腾后，调至文火保持微沸30～60min，趁热滤过，得到该中药复方供试品溶液。进一步地，该水与该中药复方粉末的体积与质量(ml/g)之比为5～10，例如约8.5。进一步地，该对照品溶液的制备方法包括：称取适量的地黄苷D、甜菜碱、阿魏酸、芦丁、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I、焦地黄苯乙醇苷A1、洋川芎内酯H、藁本内酯和/或川楝素；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为20～400μg/ml的该对照品溶液。进一步地，该检测的进样量为5～20μl。进一步地，该中药复方供试品溶液和该对照品溶液在该检测之前用0.22μm或0.45μm微孔滤膜过滤。进一步地，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为(0.5～4):(0.5～4):(0.5～4):(1～6):(1～6):(1～6)。进一步地，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为(1～2):(1～2):(1～2):(2～4):(2～4):(1～3)。进一步地，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为(1.425～1.575):(1.425～1.575):(1.425～1.575):(2.85～3.15):(2.85～3.15):(1.9～2.1)。进一步地，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为约1.5:约1.5:约1.5:约3:约3:约2。进一步地，该地黄为生地黄。

进一步地，检测该地黄苷D的色谱条件如下所示：该色谱柱为Waters AtlantisT3，4.6×150mm，3μm色谱柱，该流动相A为甲醇，该流动相B为0.05％～0.2％的磷酸水溶液，该流速为0.6～0.8mL/min，该柱温为25～35℃，该检测波长为200～210nm，梯度洗脱程序为：0～20min，5％～6％A；20～45min，6％A。进一步地，检测该甜菜碱的色谱条件如下所示：该色谱柱为HALO，Penta-Hilic 4.6×250mm，5μm色谱柱，该流动相A为乙腈，该流动相B为0.001～0.01mol/l的pH为3～4的醋酸铵溶液，该流速为0.8～1.2mL/min，该柱温为25～35℃，梯度洗脱程序为：0～20min，88％A，蒸发光散射检测器，灵敏度1.0，漂移管温度105～115℃，气体流量2～3L/min。进一步地，检测该阿魏酸、该芦丁、该毛蕊花糖苷、该洋川芎内酯I、该焦地黄苯乙醇苷A1、该洋川芎内酯H和该藁本内酯的色谱条件如下所示：该色谱柱为HALO 90A AQ-C₁₈4.6×250mm，5μm色谱柱，该流动相A为乙腈，该流动相B为0.05％～0.2％的磷酸水溶液，该流速为0.8～1.2mL/min，该柱温为35～45℃，该洋川芎内酯I与该洋川芎内酯H的检测波长为270～280nm，该阿魏酸、该焦地黄苯乙醇苷A1、该芦丁、该毛蕊花糖苷和该藁本内酯检测波长为320～340nm，梯度洗脱程序为：0～10min，12％A；10～25min，12％～15％A；25～30min，15％～16％A；30～40min，16％～24％A；40～45min，24％～38％A；45～55min，38％～95％A；55～60min，95％A。进一步地，检测该川楝素的色谱条件如下所示：该色谱柱为HALO 90A AQ-C₁₈ 4.6×150mm，2.7μm色谱柱，该流动相A为乙腈，该流动相B为水，该流速为0.6～0.8mL/min，该柱温为25～35℃，梯度洗脱程序为：0～5min，34％A；5～30min，34％～55％A，蒸发光散射检测器，灵敏度1.0，漂移管温度105～115℃，气体流量2.5～3.5L/min。

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含地黄的中药复方的指纹图谱构建方法，其包括以下步骤：供试品溶液的制备：称取适量的各味中药颗粒粉末，混合得到中药复方粉末，加入适量的水进行煎煮，加热至沸腾后，调至文火保持微沸30～60min，趁热滤过，得到该中药复方供试品溶液，其中该中药复方由北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子组成；对照品溶液的制备：称取适量的阿魏酸、芦丁、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I、焦地黄苯乙醇苷A1、洋川芎内酯H、藁本内酯和/或川楝素；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为20～400μg/ml的该对照品溶液；根据高效液相检测该供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶或两性离子型亲水相互作用硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为水溶液、酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，流速为0.6～1.5mL/min，柱温为20～45℃，检测波长为200～350nm。

进一步地，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为(0.5～4):(0.5～4):(0.5～4):(1～6):(1～6):(1～6)。进一步地，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为(1～2):(1～2):(1～2):(2～4):(2～4):(1～3)。进一步地，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为(1.425～1.575):(1.425～1.575):(1.425～1.575):(2.85～3.15):(2.85～3.15):(1.9～2.1)。进一步地，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为约1.5:约1.5:约1.5:约3:约3:约2。进一步地，该地黄为生地黄。

进一步地，检测该阿魏酸、该芦丁、该毛蕊花糖苷、该洋川芎内酯I、该焦地黄苯乙醇苷A1、该洋川芎内酯H和该藁本内酯的色谱条件如下所示：该色谱柱为Waters AtlantisT3，4.6×150mm，3μm色谱柱，该流动相A为乙腈，该流动相B为0.05％～0.2％的磷酸水溶液，该流速为0.8～1.2mL/min，该柱温为35～45℃，该洋川芎内酯I与该洋川芎内酯H的检测波长为270～280nm，该阿魏酸、该焦地黄苯乙醇苷A1、该芦丁、该毛蕊花糖苷和该藁本内酯检测波长为320～340nm，梯度洗脱程序为：0～10min，12％A；10～25min，12％～15％A；25～30min，15％～16％A；30～40min，16％～24％A；40～45min，24％～38％A；45～55min，38％～95％A；55～60min，95％A。进一步地，检测该川楝素和麦冬特征成分的色谱条件如下所示：该色谱柱为HALO 90A AQ-C₁₈ 4.6×150mm，2.7μm色谱柱，该流动相A为乙腈，该流动相B为水，该流速为0.6～0.8mL/min，该柱温为25～35℃，梯度洗脱程序为：0～5min，34％A；5～30min，34％～55％A，蒸发光散射检测器，灵敏度1.0，漂移管温度105～115℃，气体流量2.5～3.5L/min。

进一步地，检测该阿魏酸、该芦丁、该毛蕊花糖苷、该洋川芎内酯I、该焦地黄苯乙醇苷A1、该洋川芎内酯H和该藁本内酯所获得的指纹图谱包括1-7号峰，其中，5号峰为洋川芎内酯I作为参照峰，1号峰为阿魏酸、2号峰为焦地黄苯乙醇苷A1、3号峰为芦丁，4号峰为毛蕊花糖苷，6号峰为洋川芎内酯H，7号峰为藁本内酯。进一步地，1-7号峰的保留时间分别为16.5～17.5min、19.0～20.0min、22.5～23.5min、26.0～27.0min、29.0～30.0min、33.0～34.0min、53.0～54.0min。进一步地，1号峰为当归药材和枸杞药材共有峰，2号峰、4号峰来自地黄药材，3号峰来自枸杞药材，5号峰、6号峰和7号峰来自当归药材。进一步地，以洋川芎内酯I的5号色谱峰作为参照峰，其他6个峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.58±0.05、2号色谱峰0.66±0.05、3号色谱峰0.79±0.05、4号色谱峰0.91±0.05、6号色谱峰1.15±0.05、7号色谱峰1.83±0.05。进一步地，检测该川楝素和麦冬特征成分所获得的指纹图谱包括1-5号峰，其中1号峰和2号峰为川楝素，3号峰和4号峰为麦冬特征成分，5号峰来自川楝子药材，其保留时间分别为10.5～11.5min、13.0～14.0min、17.0～18.0min、18.0～19.0min、28.0～29.0min。进一步地，1号峰为川楝素的异构体1的色谱峰，2号峰为川楝素的异构体2的色谱峰。进一步地，1号峰来自川楝子药材，2号峰来自川楝子药材，3号峰来自麦冬药材，4号峰来自麦冬药材，5号峰来自川楝子药材。进一步地，以川楝素的1号峰作为参照峰，其他4个峰的相对保留时间依次为2号色谱峰1.21±0.05、3号色谱峰1.56±0.05、4号色谱峰1.67±0.05、5号色谱峰2.56±0.05。

根据本发明的另一个方面，提供了一种上述检测方法或上述构建方法在包含地黄的中药复方的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。

本发明的有益效果：

本发明的方法专属性强；经专属性、精密度、重复性、稳定性、加样回收试验考察，证明该方法适合本申请的中药复方的特征图谱的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。

图1为空白溶剂(A)、地黄苷D对照品(B)、地黄单煎液(C)、中药复方供试品溶液(D)、中药复方缺地黄阴性对照溶液(E)的HPLC色谱图。其中峰1为地黄苷D。

图2为空白溶剂(A)、甜菜碱对照品(B)、枸杞子单煎液(C)、中药复方供试品溶液(D)、中药复方缺枸杞子阴性对照溶液(E)的HPLC色谱图。

图3为空白溶剂(A)、当归单煎液(B)、中药复方缺当归阴性煎液(C)、中药复方煎液(D)、混合对照品(E)的HPLC色谱图(278nm)。其中，1、阿魏酸；2、焦地黄苯乙醇苷A1；3、芦丁；4、毛蕊花糖苷；5、洋川芎内酯I；6、洋川芎内酯H；7、藁本内酯。

图4为空白溶剂(A)、地黄单煎液(B)、中药复方缺地黄阴性煎液(C)、中药复方煎液(D)、混合对照品(E)的HPLC色谱图(330nm)。其中，1、阿魏酸；2、焦地黄苯乙醇苷A1；3、芦丁；4、毛蕊花糖苷；7、藁本内酯。

图5为空白溶剂(A)、枸杞子单煎液(B)、中药复方缺枸杞子阴性煎液(C)、中药复方煎液(D)、混合对照品(E)的HPLC色谱图(278nm)。其中，1、阿魏酸；2、焦地黄苯乙醇苷A1；3、芦丁；4、毛蕊花糖苷；7、藁本内酯。

图6为空白溶剂(A)、川楝素对照溶液(B)、中药复方供试品溶液(C)、川楝子单煎液(D)、中药复方缺川楝子阴性对照溶液(E)HPLC色谱图。其中川楝素峰1、峰2来源于川楝子。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。

除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。

在本发明中，术语“包括”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、药材、组分、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、药材、组分、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

在本发明中，比例、当量、浓度、波长、温度、流速、重量份或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围例如“200～350”、“20～45”或“0.6～1.5”时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约8.5”包括8.5的±5％，即从8.075到8.925；“约1.5”包括1.5的±5％，即从1.425到1.575；“约3”包括3的±5％，即从2.85到3.15；“约2”包括2的±5％，即从1.9到2.1。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

实施例

1仪器、试剂、对照品与饮片

高效液相色谱仪(Waters 2695-2996)；高效液相色谱仪(Agilent 1260InfinityⅡ)；ELSD检测器(AllChrom，ELSD-6100)；空气压缩机(XWK-Ⅲ，天津市津分分析仪器制造有限公司)；高效液相色谱柱(Kromasil100-5-NH₂，4.6×250mm，5μm)；高效液相色谱柱(Waters Atlantis-T34.6×150mm，3μm)；高效液相色谱柱(HALO 90A AQ-C₁₈，4.6×250mm，5μm)；高效液相色谱柱(HALO，90A AQ-C₁₈，4.6×150mm，2.7μm)；高效液相色谱柱(HALOPenta-Hilic，4.6×250mm，5μm)；紫外可见分光光度计(型号：752，厂家：上海菁华科技有限公司)；电子分析天平(MS105DU，梅特勒·托利多)；电子分析天平(BSA224S，赛多利斯)；电子分析天平(BSA124S，赛多利斯)酸度计(PHS-3E，上海仪电科学仪器股份有限公司)；煎药壶(康亚顺，1L)；调温加热板(KDMB，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(型号：DZKW-S-6，厂家：北京市永光明医疗仪器有限公司)；药品阴凉冷藏柜(型号：艾士奇SCLG5-800F，厂家：山东三九电器有限公司)；煎药壶(康亚顺，1L)。

甲醇(色谱纯，Sigma-Aldrich，批号：WXBD5925V、WXBD6984V)；乙腈(色谱纯，Sigma-Aldrich，批号：WXBD5861V、WXBD6581V)；无水乙醇(分析纯，厂家：国药集团化学试剂有限公司，批号：20211201)；正丁醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20211026)；氨水(色谱纯，GENARAL-REAGENT，Lot：P1985467)；磷酸(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司，批号：20210303)；乙酸铵(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司，批号：20210506)；冰醋酸(色谱纯，天津市化学试剂研究所，批号：20201115)；苯酚(分析纯，厂家：国药集团化学试剂有限公司，批号：20201012)；纯净水(蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司，批号：20220215C)。

地黄苷D(批号：112063-202103，中国食品药品检定研究院，含量以94.2％计)；甜菜碱(中国食品药品检定研究院，批号：110894-201604，含量以99.2％计)；阿魏酸(批号110773-201915，中国食品药品检定研究院，含量以99.4％计)；芦丁(批号100080-202010，中国食品药品检定研究院，含量以91.6％计)；毛蕊花糖苷(批号111530-201914，中国食品药品检定研究院，含量以95.1％计)；洋川芎内酯I(批号112071-202101，中国食品药品检定研究院，含量以95.1％计)；焦地黄苯乙醇苷A1(批号AF20050114，成都埃法生物科技有限公司，含量：HPLC≥98％)；洋川芎内酯H(批号AF1041204，成都埃法生物科技有限公司，含量：HPLC≥98％)；藁本内酯(批号：111737-201910，中国食品药品检定研究院，)；川楝素(中国食品药品检定研究院，批号：111842-202105，含量以93.9％计)。

北沙参饮片(批号：ZA13421053109，产地：河北保定博野县)；麦冬饮片(批号：ZA03221053108，产地：四川绵阳梓潼县)；当归饮片(批号：ZA00321031808，产地甘肃定西岷县)；地黄饮片(ZA03421053108，河南焦作武陟县)；枸杞子饮片(ZA13321053114，甘肃白银景泰县)；川楝子饮片(ZA13221053115，重庆涪陵区)。为保证取样均匀性，将饮片均粉碎至全部能通过1号筛无法通过2号筛大小粗颗粒。

2中药复方煎液制备方法

精密称取北沙参粗颗粒5.6g，麦冬粗颗粒5.6g，当归粗颗粒5.6g，地黄粗颗粒11.19g，枸杞子粗颗粒11.19g，川楝子粗颗粒7.46g，量取400ml水，置于1L陶瓷煎药壶中，将加热板调至武火加热至沸腾(约9min)后，调至文火保持微沸45min，趁热滤过200目尼龙滤网，即得。

中药复方缺北沙参阴性对照煎液：按中药复方缺北沙参药味制备方式制备其阴性对照煎液；中药复方缺麦冬阴性对照煎液：按中药复方缺麦冬药味制备方式制备其阴性对照煎液；中药复方缺当归阴性对照煎液：按中药复方缺当归药味制备方式制备其阴性对照煎液；中药复方缺枸杞子阴性对照煎液：按中药复方缺枸杞子药味制备方式制备其阴性对照煎液；中药复方缺地黄阴性对照煎液：按中药复方缺地黄药味制备方式制备其阴性对照煎液；中药复方缺川楝子阴性对照煎液：按中药复方缺川楝子药味制备方式制备其阴性对照煎液；北沙参单煎液：称取5.6g北沙参粗颗粒，按复方煎液制备方法，即得；麦冬单煎液：称取5.6g麦冬粗颗粒，按复方煎液制备方法，即得；当归单煎液：称取5.6g当归粗颗粒，按复方煎液制备方法，即得；枸杞子单煎液：称取11.19g枸杞子粗颗粒，按复方煎液制备方法，即得；地黄单煎液：称取11.19g地黄粗颗粒，按复方煎液制备方法，即得；川楝子单煎液：称取7.46g川楝子粗颗粒，按复方煎液制备方法，即得。

3HPLC各指标含量测定方法的建立

3.1中药复方煎液地黄中地黄苷D含量测定方法的建立

3.1.1色谱条件的建立

3.1.1.1色谱柱的选择

地黄苷D为《中国药典》2020年版中在地黄药材、饮片含量测定项下引入的指标。根据前期地黄药材、饮片含量检测经验，地黄苷D含量测定方法其普适性较差，如采用规格为4.6×250mm，5μm色谱柱保留时间差异巨大，不同品牌与型号色谱柱，其保留时间从30min至110min不等，而本方法仅对地黄苷D进行含量测定，从经济效益与方法开发角度进行分析，故拟采用更小粒径、更短色谱柱进行色谱条件开发，故拟采用适宜分析环烯醚萜类成分的T3色谱柱，根据预实验结果拟定采用Waters Atlantis T3色谱柱，规格为4.6×150mm，3μm。

3.1.1.2检测波长的选择

《中国药典》2020年版中在地黄药材、饮片含量测定项下地黄苷D的检测波长为203nm，地黄苷D类环烯醚萜成分为末端吸收，故本研究也采用203nm作为检测波长。

3.1.1.3色谱条件的考察

(1)采用等度洗脱考察

采用《中国药典》2020年版中地黄药材、饮片项下含量测定色谱条件，甲醇∶0.1％磷酸溶液(5∶95)。结果显示，该色谱条件下，中药复方煎液中地黄苷D色谱峰左侧有一较小干扰峰，分离度为1.36，无法达到含量测定要求。因等度洗脱下再延长相应各峰保留时间，分析时间过久，故考虑尝试梯度洗脱进行分析。

(2)采用梯度洗脱考察

以甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按以下进行洗脱：0～45min，4％～6％。结果显示，该色谱条件下，复方煎液中地黄苷D色谱峰左侧已无明显干扰，而右侧出现干扰峰，分离度为1.23，也无法达到含量测定要求。

经以上实验考察发现，采用梯度洗脱的过程中，中药复方煎液中地黄苷D与其左侧峰分离情况较好，其保留在色谱行为表现上，更容易在梯度环境下洗脱，而在药典所采用的等度条件下，地黄苷D与其右侧峰分离情况较好，故以表1中的规定进行梯度洗脱。

表1地黄苷D梯度洗脱条件

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～20	5→6	95→94
20～45	6	94

结果显示，该色谱条件下，复方煎液中地黄苷D色谱峰左侧已无明显干扰，分离度为2.53，而右侧也无明显干扰，分离度为2.36，满足含量测定要求。

故拟定色谱条件为：

采用Waters Atlantis T3，4.6×150mm，3μm色谱柱；以甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟0.7ml；柱温30℃；检测波长为203nm。

测定法精密吸取供试品溶液20μl，注入，即得。

3.1.2方法学验证

专属性：取供中药复方供试品溶液、中药复方缺地黄阴性对照溶液、地黄单煎液、地黄苷D对照品溶液和空白溶剂对照溶液，按确定的色谱条件进样分析，记录色谱图，结果见图1。结果表明，阴性对照无干扰，地黄苷D来源于地黄药味，地黄苷D在中药复方供试品溶液中分离度为2.15，符合高效液相色谱法含量测定的要求，专属性良好。

检测限、定量限与线性试验：精密称取地黄苷D对照品10.57mg，置25ml容量瓶中，加25％甲醇溶液，制成浓度为0.3983mg/ml的储备液。分别将储备液稀释制成不同浓度对照品溶液，精密吸取以上不同浓度的对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，分别以地黄苷D的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，地黄苷D线性回归方程为Y＝17,274,690.2900X-10,680.9333，相关系数r为0.9999，说明地黄苷D在0.0020～0.3983mg/ml范围内线性关系良好。实验测得能被可靠地检测出地黄苷D最低量为0.0010mg/ml，其信噪比为5.06。实验测得能被可靠地定量的地黄苷D最低量为0.0020mg/ml，其信噪比为12.82。

精密度试验：取三个不同浓度对照品溶液，按以上确定色谱条件，连续进样6次，测定地黄苷D色谱峰峰面积并计算RSD％。将三个不同浓度对照品溶液连续进样6针均值作为第一日测定值，按色谱条件，于第二日、第三日各进样1次，测定地黄苷D色谱峰峰面积并计算RSD％。结果表明，地黄苷D日内精密度和日间精密度峰面积RSD均小于2.0％，说明其日内精密度及连续三日内日间精密度良好。

重复性试验：按供试品制备方法制备6份中药复方供试品溶液，转移至250ml容量瓶中，加水至刻度线，照上述确定色谱条件测定每份供试品溶液中地黄苷D的占地黄饮片含量并计算其RSD％。结果表明，重复性试验中6份供试品溶液的地黄苷D占地黄中含量RSD为1.23％，小于2.0％，故该方法重复性良好。

稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24、36和48小时进样，测定峰面积，以考察溶液的稳定性。结果表明，在室温条件下，48小时内，地黄苷D色谱峰的峰面积RSD小于2.0％，供试品溶液在室温条件下48小时内基本稳定，符合测定要求。

加样回收试验：取同一份中药复方供试品溶液，根据线性回归方程计算其浓度，分别按高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比为1.5:1，1:1，0.5:1，每种比例分别制备3份进行测定，计算地黄苷D加样回收率。结果表明，供试品溶液中地黄苷D加样回收率(％)在94.47～103.70，RSD为1.17％，因此该方法准确度良好。

经以上方法学验证相关试验，证明该方法检测中药复方中生地黄的地黄苷D含量准确、可靠、稳定、有效。

3.2中药复方煎液枸杞子中甜菜碱含量测定方法的建立

3.2.1含量测定方法的建立

3.2.1.1检测器的考察

据文献报道与预实验研究结果，甜菜碱最大吸收波长为末端吸收，其在蒸发光散射检测器下检测，灵敏度较高，响应较好；在安徽省与江苏省配方颗粒标准中，均采用蒸发光散射检测器进行检测。本研究采用DAD-ELSD串联对甜菜碱进行了测定。结果如表2所示。

表2甜菜碱195nm(紫外检测器)与ELSD下峰参数对比

检测器	峰面积	高度	对称因子	USP理论塔板数
					195nm	538742	9655	1.17	4389
ELSD	3489813461	63414808	1.21	5080

在甜菜碱保留时间位置，蒸发光散射检测器响应远高于紫外下吸收。故选择本研究拟采用蒸发光散射检测器作为中药复方中枸杞子甜菜碱含量测定的检测器。

3.2.1.2色谱柱的考察

在《中国药典》2020年版中，枸杞子含量测定项下所用色谱柱为氨基键合硅胶为填充剂(氨基柱)，本研究采用氨基柱(Kromasil 100-5-NH₂，4.6×250mm，5μm)对甜菜碱进行了试验。结果显示，甜菜碱保留时间、峰形均尚可，但是由于氨基柱其柱材在洗脱过程中容易流失，在ELSD检测器下，流失的柱材容易造成基线较高的屏蔽效应，图中所示基线位于250mV处，主要因柱材流失影响，造成过高屏蔽效应，且基线不平坦，不宜于进行定量分析，故本研究试验不选用氨基柱。

在安徽省与江苏省枸杞子配方颗粒标准中，其含量测定项所使用填充剂为十八烷基硅烷硅烷键合硅胶(C₁₈柱)。本研究采用了C₁₈(HALO90A AQ-C₁₈，4.6×250mm，5μm)柱进行了相关试验。结果显示，基线平坦，峰形较好，响应值高，但是目前所用C₁₈柱对甜菜碱几乎无保留作用，于1min即洗脱，无法重现其色谱结果进行定量分析，认为其所选用色谱柱在甜菜碱的含量测定上缺乏一定普适性，故在本研究中亦不选用C₁₈柱进行试验。

参考安徽省与江苏省枸杞子配方颗粒标准中特征图谱的测定方法，其特征图谱建立中，甜菜碱作为其指认特征成分之一，具有较好响应值与分离度，所采用色谱柱为两性离子型亲水相互作用硅胶为填充剂(HILIC柱)，在本研究预实验中采用HILIC(HALO，Penta-Hilic 4.6×250mm，5μm)柱进行试验。结果显示，甜菜碱保留时间在流速1ml/min时保留时间约为14min，保留时间适宜，响应较好，基线平坦，无类似氨基柱柱材流失产生的高基线屏蔽效应。故本研究拟采用HILIC柱进行试验。

3.2.1.3流动相缓冲盐的考察

甜菜碱化学名为N,N,N-三甲基甘氨酸，化学结构与氨基酸相似，属季铵碱类物质，根据前期预实验研究经验，甜菜碱极性较大，在高效液相色谱分析中，其分离度常较为难以达到含量测定要求。在《中国药典》2020年版中，枸杞子含量测定项下所用流动相为乙腈-水溶液，而其供试品制备过程较为复杂；在安徽省与江苏省枸杞子配方颗粒标准中，其含量测定所用流动相为乙腈-醋酸铵溶液(0.02mol/l醋酸铵溶液用冰醋酸调pH至2.5)，故结合前期预实验结果推断醋酸铵针对枸杞子中甜菜碱的分离度具有一定改善功能。因高浓度的缓冲盐对色谱系统与色谱柱寿命都具有一定影响，且不同浓度醋酸铵溶液pH值均趋于中性，故本研究拟采用乙腈-水、乙腈-0.005mol/L醋酸铵溶液、乙腈-0.01mol/L醋酸铵溶液、乙腈-0.02mol/L醋酸铵溶液分别进行试验。

结果显示，在不加缓冲盐的情况下，甜菜碱峰峰形较差，且该峰前端有较为接近干扰成分，不宜对其进行含量测定分析。随着冲盐浓度的提高，所示各成分保留时间整体提高，但其他成分相较甜菜碱峰对醋酸铵浓度更为敏感，保留时间提高程度更显著，在浓度为0.02mol/L时，严重影响甜菜碱分离度。在醋酸铵浓度分别为0.005mol/L、0.01mol/L时，甜菜碱峰分离度情况良好，峰形较好，基于缓冲盐对色谱柱寿命影响等因素，故本研究拟采用较低浓度0.005mol/L醋酸铵溶液作为其流动相缓冲盐。

3.2.1.4流动相中pH的考察

甜菜碱为季铵碱类物质，在高效液相色谱分析中，生物碱类物质峰各参数常对流动相pH值较为敏感。在安徽省与江苏省枸杞子配方颗粒标准中，其流动相0.02mol/L醋酸铵溶液，通过醋酸将其调节pH至2.5进行含量测定分析。故在本研究中，在确定缓冲盐醋酸铵浓度为0.005mol/L的条件下，分别通过冰醋酸调节醋酸铵缓冲盐pH至为3.5、4、5、6.43。

结果显示，未添加冰醋酸时，缓冲盐溶液pH为6.43；pH为3.5时已达到缓冲盐有效调节范围下限。结果表明，pH在4、5、6.43条件下，供试品甜菜碱峰峰形较差，且峰拖尾严重，有一个未能完全分离的小峰干扰。pH在3.5条件下，峰分离度好，基线平坦，目标峰附近无干扰，峰形最佳。

3.2.2中药复方中枸杞子甜菜碱含量测定方法确定

色谱条件与系统适用性：以两性离子型亲水相互作用硅胶为填充剂；以乙腈：醋酸铵溶液(0.005mol/l醋酸铵溶液用冰醋酸调pH至3.5)(88：12)为流动相；柱温30℃；每1分钟流速1.0ml；蒸发光散射检测器，灵敏度1.0，漂移管温度110℃，气体流量2.5L/min。

对照品溶液的制备：取甜菜碱对照品适量，精密称定，加25％甲醇制成每1ml含甜菜碱0.2mg的溶液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液5、10μl，精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

3.2.3方法学验证

专属性试验：取中药复方供试品溶液、中药复方缺枸杞子阴性对照溶液、枸杞子单煎液、甜菜碱对照品溶液和空白溶剂对照溶液，按确定的色谱条件进样分析，记录色谱图，结果如图2所示。结果表明，阴性对照无干扰，甜菜碱来源于枸杞子药味，甜菜碱在中药复方供试品溶液中分离度为4.249，符合高效液相色谱法含量测定的要求，专属性良好。

检测限、定量限与线性试验：精密称取甜菜碱对照品27.91mg，置10ml容量瓶中，加25％甲醇溶液，制成浓度为2.7687mg/ml的储备液。分别将储备液稀释制成不同浓度对照品溶液，精密吸取以上不同浓度的对照品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，分别以甜菜碱的进样量g以10为底取对数为横坐标，峰面积以10为底取对数为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，甜菜碱线性回归方程为Y＝1.5423X+2.8610，相关系数r为0.9995，说明甜菜碱在0.0138mg/ml～1.3843mg/ml范围内线性关系良好。实验测得能被可靠地检测出甜菜碱最低量为0.0055mg/ml，其信噪比为3.908。实验测得能被可靠地定量的甜菜碱最低量为0.0138mg/ml，其信噪比为8.341。

精密度试验：取三个不同浓度对照品溶液，按以上确定色谱条件，连续进样6次，测定甜菜碱色谱峰峰面积并计算RSD％。将三个不同浓度对照品溶液连续进样6针均值作为第一日测定值，按色谱条件，于第二日、第三日各进样1次，测定甜菜碱色谱峰峰面积(×10⁶)并计算RSD％。结果表明，甜菜碱日内精密度和日间精密度峰面积RSD均小于5.0％，说明其日内精密度及连续三日内日间精密度良好。

重复性试验：按供试品制备方法制备6份中药复方供试品溶液，转移至250ml容量瓶中，定容至刻度，照上述确定色谱条件测定每份供试品溶液中甜菜碱的占枸杞子饮片含量并计算其RSD％。结果表明，重复性试验中6份供试品溶液的甜菜碱占枸杞子中含量RSD为2.87％，小于5.0％，故该方法重复性良好。

稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24、36和48小时进样，测定峰面积，以考察溶液的稳定性。结果表明，在室温条件下，48小时内，甜菜碱色谱峰的峰面积RSD小于5.0％，供试品溶液在室温条件下48小时内基本稳定，符合测定要求。

加样回收试验：取同一份中药复方溶液，根据线性回归方程计算其浓度，分别按高、中、低浓度对照品加人量与所取供试品中待测定成分量之比为1.5:1，1:1，0.5:1，每种比例分别制备3份进行测定，计算甜菜碱加样回收率。结果表明，供试品溶液中甜菜碱加样回收率(％)在94.47～103.70，RSD为2.50％，因此该方法准确度良好。

经以上方法学验证相关试验，证明该方法检测中药复方中枸杞子甜菜碱含量准确、可靠、稳定、有效。

3.3中药复方煎液当归、枸杞子、地黄多指标含量测定方法的建立

3.3.1色谱条件的考察

根据国家发布的地黄、当归配方颗粒特征图谱方法，综合建立初步的色谱条件，该色谱条件如下所示：

采用HALO 90A AQ-C₁₈ 4.6×250mm，5μm色谱柱；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱；柱温35℃；流速每1分钟1.0ml；检测波长为278nm和330nm。其中洋川芎内酯I与洋川芎内酯H检测波长为278nm，阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、芦丁、毛蕊花糖苷、藁本内酯检测波长为330nm。

测定法精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

表3当归、枸杞子、地黄多指标含量梯度洗脱条件

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～10	5→13	95→87
10～13	13	87
			13～30	13→17	87→83
30～40	17→45	83→55
			40～50	45→95	55→5
45～55	95	5

结果显示，该色谱条件下，20分钟以前，色谱峰较多，与单味药进行比较，其主要来源于枸杞子药味，但是因其成分复杂，吸收波长不一，无法明确成分，且缺少专属性，分离较为困难。30～40分钟基线明显有一定漂移，主要因其成分较多，导致基线超载。故拟针对该部分进行调整。

调整后的色谱条件如下所示：

采用HALO 90A AQ-C₁₈ 4.6×250mm，5μm色谱柱；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按表4中的规定进行梯度洗脱；柱温35℃；流速每1分钟1.0ml；检测波长为278nm和330nm。其中洋川芎内酯I与洋川芎内酯H检测波长为278nm，阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、芦丁、毛蕊花糖苷、藁本内酯检测波长为330nm。

测定法精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

表4当归、枸杞子、地黄多指标含量梯度洗脱条件

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～10	12	88
10～25	12→15	88→85
			25～30	15→18	85→82
30～40	18→30	82→70
			40～45	30→45	70→55
45～55	45→95	55→5
			55～60	95	5

结果显示，该色谱条件下，30～40分钟基线漂移有了明显改善，而从20～50分钟中，较为显著的峰经指认主要来源于当归，为阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯，与地黄中的苯乙醇苷类成分，而苯乙醇苷类成分在该色谱条件下分离度较差，而苯乙醇苷类成分相较其他成分，其色谱行为对温度更敏感，故采用40℃为分析温度。并在此基础上进行进一步调整。

调整后的确定的色谱条件如下所示：

采用HALO 90A AQ-C₁₈ 4.6×250mm，5μm色谱柱；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按表5中的规定进行梯度洗脱；柱温40℃；流速每1分钟1.0ml；检测波长为278nm和330nm。其中洋川芎内酯I与洋川芎内酯H检测波长为278nm，阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、芦丁、毛蕊花糖苷、藁本内酯检测波长为330nm。

测定法精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

表5当归、枸杞子、地黄多指标含量梯度洗脱条件

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～10	12	88
10～25	12→15	88→85
			25～30	15→16	85→84
30～40	16→24	84→76
			40～45	24→38	76→62
45～55	38→95	62→5
			55～60	95	5

因洋川芎内酯I、洋川芎内脂H在278nm有显著较强吸收，其他波长下吸收较弱；苯乙醇苷类成分最大吸收波长为328nm，焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷在278nm下吸收较弱，且易因基线波动范围造成检测误差；阿魏酸最大吸收波长为322nm，其中3号峰芦丁在353nm下也有较强吸收，藁本内酯在327nm下有较强吸收，故本方法拟同时采用278nm与330nm进行检测，其中278nm进行洋川芎内酯I含量测定，330nm下进行阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、藁本内酯含量测定。

3.3.2方法学验证

专属性试验：取中药复方供试品溶液、各单味煎液供试品溶液、各阴性对照煎液供试品溶液按确定的色谱条件进样分析，记录色谱图，结果图3～图5所示。结果表明，洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯为当归药味专属性成份，阿魏酸峰主要贡献度来源于当归、枸杞子药味，焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷为地黄药味专属性成份，芦丁主要贡献度来源于枸杞子药味，洋川芎内酯I峰与前锋分离度为6.63，洋川芎内酯H峰与前峰分离度为7.21，阿魏酸峰与前峰分离度为5.18，焦地黄苯乙醇苷A1峰与前峰分离度为6.07，芦丁峰与前峰分离度为3.79，毛蕊花糖苷峰与前峰分离度为2.05，藁本内酯峰与前峰分离度为87.37。符合高效液相色谱法含量测定的要求。

检测限、定量限与线性试验：阿魏酸对照品溶液配制：精密称取阿魏酸对照品10.36mg，置20ml量瓶中，加70％甲醇溶液，制成浓度为0.51489mg/ml的储备液。焦地黄苯乙醇苷A1对照品溶液配制：精密称取焦地黄苯乙醇苷A1对照品10.87mg，置20ml量瓶中，加70％甲醇溶液，制成浓度为0.53263mg/ml的储备液。芦丁对照品溶液配制：精密称取芦丁对照品11.48mg，置20ml量瓶中，加70％甲醇溶液，制成浓度为0.52578mg/ml的储备液。毛蕊花糖苷对照品溶液配制：精密称取毛蕊花糖苷对照品10.55mg，置20ml量瓶，加70％甲醇溶液，制成浓度为0.50123mg/ml的储备液。洋川芎内酯I对照品溶液配制：精密称取洋川芎内酯I对照品10.50mg，置20ml量瓶，加70％甲醇溶液，制成浓度为0.52080mg/ml的储备液。洋川芎内酯H对照品溶液配制：精密称取洋川芎内酯H对照品10.29mg，置20ml量瓶，加70％甲醇溶液，制成浓度为0.50421mg/ml的储备液。藁本内酯对照品溶液配制：精密称取藁本内酯对照品13.62mg，置20ml量瓶，加70％甲醇溶液，制成浓度为0.68100mg/ml的储备液。分别将阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、芦丁、毛蕊花糖苷、藁本内酯、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H储备液稀释程不同浓度对照品溶液，精密吸取以上不同浓度的对照品20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，阿魏酸线性归回方程Y＝101140450.9000X+30434.849，相关系数r为1.0000，说明阿魏酸在0.00026mg/ml～0.25745mg/ml范围内线性关系良好。焦地黄苯乙醇苷A1线性归回方程27323001.5000X-25076.4559，相关系数r为0.9995，说明焦地黄苯乙醇苷A1在0.00133mg/ml～0.10653mg/ml范围内线性关系良好。芦丁线性归回方程Y＝25604955.0500X+7607.4932，相关系数r为0.9999说明芦丁在0.00053mg/ml～0.52578mg/ml范围内线性关系良好。毛蕊花糖苷线性归回方程Y＝36831537.8600X+1814.0972，相关系数r为1.0000说明毛蕊花糖苷在0.00050mg/ml～0.25061mg/ml范围内线性关系良好。藁本内酯线性归回方程Y＝80049152.9300X+2344.3110，相关系数r为1.0000说明藁本内酯在0.00007mg/ml～0.06810mg/ml范围内线性关系良好。洋川芎内酯I线性归回方程Y＝99564468.6500X+472.4401，相关系数r为1.0000说明洋川芎内酯I在0.00010mg/ml～0.05208mg/ml范围内线性关系良好。洋川芎内酯H线性归回方程Y＝102388976.3000X+888.9112，相关系数r为1.0000说明洋川芎内酯H在0.00010mg/ml～0.05042mg/ml范围内线性关系良好。实验测得能被可靠地检测出阿魏酸最低量为0.00005mg/ml，其信噪比为4.65；焦地黄苯乙醇苷A1最低量为0.00107mg/ml，其信噪比为4.16；芦丁最低量为0.00011mg/ml，其信噪比为3.54；毛蕊花糖苷最低量为0.00025mg/ml，其信噪比为4.51；藁本内酯最低量为0.00002mg/ml，其信噪比为4.84；洋川芎内酯I最低量为0.00005mg/ml，其信噪比为4.81；洋川芎内酯H最低量为0.00005mg/ml，其信噪比为5.07。实验测得能被可靠地定量的阿魏酸最低量为0.00026mg/ml，其信噪比为9.69；焦地黄苯乙醇苷A1最低量为0.00133mg/ml，其信噪比为10.86；芦丁最低量为0.00053mg/ml，其信噪比为12.51；毛蕊花糖苷最低量为0.00050mg/ml，其信噪比为10.76；藁本内酯最低量为0.00007mg/ml，其信噪比为10.26；洋川芎内酯I最低量为0.00010mg/ml，其信噪比为10.17；洋川芎内酯H最低量为0.00010mg/ml，其信噪比为11.55。

精密度试验：取一份中药复方煎液按以上确定色谱条件，连续进样6次，测定阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、芦丁、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H，藁本内酯色谱峰峰面积并计算RSD％。结果表明，阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、芦丁、藁本内酯、洋川芎内酯I、洋川芎内酯精密度峰面积RSD均小于3.0％，说明该仪器精密度良好。

重复性试验：按供试品制备方法制备6份中药复方供试品溶液，照上述确定色谱条件测定每份供试品溶液中，阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、芦丁、藁本内酯、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H占饮片含量并计算其RSD％。结果表明，重复性试验中6份供试品溶液的阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、芦丁、藁本内酯、洋川芎内酯I、洋川芎内酯RSD范围在0.32～4.94％，除藁本内酯为挥发油类成份，故该方法重复性良好。

稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别在0、8、16、24、36、48小时进样，测定峰面积，以考察溶液的稳定性。结果表明，在室温条件下，48小时内，洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、芦丁、毛蕊花糖苷、藁本内酯色谱峰的峰面积RSD均小于4.0％，供试品溶液在室温条件下48小时内稳定性情况良好

加样回收试验：取中药复方煎液，根据线性回归方程以重复性均值计算本底各成分含量，分别按各成分均值高、中、低浓度对照品加入与所取供试品中带测定成分之比1.5:1，1:1，0.5:1，每种比例分别制备3份进行测定，计算各成分加样回收率。结果表明，供试品溶液中，阿魏酸加样回收率(％)为99.36～101.58，RSD为0.71％，焦地黄苯乙醇苷A1加样回收率(％)为94.26～104.20，RSD值为3.69％，芦丁加样回收率(％)为98.37～103.93，RSD值为2.08％，毛蕊花糖苷加样回收率(％)为94.40～100.17，RSD值为1.90％，洋川芎内酯I加样回收率(％)为99.75～102.82，RSD值为1.14％，洋川芎内酯H加样回收率(％)为94.75～99.31，RSD值为1.51％，藁本内酯加样回收率(％)为96.96～103.10，RSD值为2.35％。因此，可判断该方法准确度良好。

经以上方法学验证相关试验，证明该方法检测本申请的中药复方中，当归中阿魏酸、杨川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯；地黄中焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷；枸杞子中芦丁含量，准确、可靠、稳定、有效。

3.4中药复方煎液川楝素含量测定方法的建立

3.4.1色谱条件的确立

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(HALO 90A AQ-C₁₈ 4.6×150mm，2.7μm)；乙腈为流动相A，水为流动相B，按表6中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.7ml，柱温30℃，进样量为10μl。蒸发光散射检测器，漂移管温度110℃，气流量3.0L/min，灵敏度级别为1。

表6川楝素梯度洗脱条件

3.4.2供试品溶液制备方式考察

3.4.2.1萃取次数考察

精密移取中药复方煎液150ml至分液漏斗，加入50ml正丁醇振摇提取，分别提取1、2、3次，合并正丁醇，加入氨试液25ml洗脱2次，收集正丁醇，蒸干，残渣加70％甲醇溶解转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。考察结果如表7所示。

表7不同萃取次数川楝素含量考察结果

萃取次数	川楝素含量(mg/g)
		1	0.0087
2	0.0142
		3	0.0156
4	0.0152

由结果可知，当采用水饱和正丁醇萃取3次时，川楝素提取较为完全，故确定萃取次数为3次。

3.4.2.2氨试液洗脱次数考察

精密吸取中药复方煎液150ml置分液漏斗，加入25ml正丁醇，振摇提取3次，合并正丁醇液，加入25ml氨试液洗脱，分别洗脱1、2、3次，收集正丁醇液，蒸干，残渣加70％甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，即得。按以上确定色谱条件进样分析，考察氨试液洗脱次数对川楝素含量及麦冬特征峰峰面积的影响，确定氨试液洗脱次数，考察结果如表8所示。

表8氨试液洗脱次数对川楝素含量考察结果

根据以上实验结果，确定川楝素含量的供试品溶液制备方法为：精密移取中药复方供试品液150ml至分液漏斗，加入水饱和正丁醇振摇提取3次，每次50ml，合并正丁醇液部分，加入氨试液洗脱2次，每次25ml，收集正丁醇液，蒸干，残渣加70％甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，加70％甲醇至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得。

3.4.3方法学验证

专属性试验：取中药复方供试品溶液、川楝子单煎液供试品溶液、中药复方缺川楝子阴性对照供试品溶液、川楝素对照品溶液和空白溶剂对照溶液按确定的色谱条件进样分析，记录色谱图，结果如图6所示。

结果表明，川楝素峰1、峰2来源于川楝子，整体专属性良好。

检测限、定量限与线性试验：取川楝素对照品溶液，稀释成不同浓度对照品溶液，精密吸取以上不同浓度对照品溶液，注入液相色谱仪，按确定的色谱条件测定峰面积，分别以川楝素的进样质量以10为底，取对数为横坐标，峰面积以10为底取对数为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，川楝素线性回归方程为Y＝1.5890X+2.8283，相关系数r为0.9997，说明川楝素在0.003mg/ml～0.566mg/ml范围内线性关系良好。实验测得能被可靠地检测出川楝素最低量为0.001mg/ml，其信噪比为2.97。实验测得能被可靠地定量的川楝素最低量为0.003mg/ml，其信噪比为12.70。

精密度试验：取三个不同浓度对照品溶液，注入液相色谱仪，按确定的色谱条件连续进样6次，测定川楝素色谱峰峰面积并计算RSD％。将三个不同浓度对照品溶液按色谱条件，于第一日、第二日、第三日、第四日各进样1次，测定川楝素色谱峰峰面积并计算RSD％。结果表明，川楝素日内精密度和日间精密度峰面积RSD均小于5.0％，说明其日内精密度及连续四日内日间精密度良好。

重复性试验：按供试品制备方法制备6份供试品溶液，照上述确定色谱条件测定每份供试品溶液中川楝素占川楝子饮片含量并计算其RSD％。结果表明，重复性试验中6份供试品溶液的川楝素占川楝子中含量RSD为0.85％，小于5.0％，故该方法重复性良好。

稳定性试验：取同一份供试品，分别在0、2、4、8、16、24、48小时进样，按确定色谱条件进行检测，记录川楝素峰面积，并计算RSD％。结果表明，48小时内，川楝素峰面积RSD小于5.0％，符合规定，供试品在48小时内稳定。

加样回收试验：取同一份中药复方供试品溶液，根据线性回归方程计算其浓度，分别按高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比为1.5:1，1:1，0.5:1，每种比例分别制备3份进行测定，计算川楝素加样回收率。结果表明，供试品溶液中川楝素加样回收率(％)在97.00～106.88，RSD为3.42％，因此该方法准确度良好。

经以上方法学验证相关试验，证明该方法检测中药复方中川楝子川楝素含量，准确、可靠、稳定、有效。

4指纹图谱表征方法的建立

4.1复方煎液当归、枸杞子、地黄指纹图谱方法的建立

4.1.1色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按表5中的规定进行梯度洗脱，该梯度洗脱条件与当归、枸杞子、地黄中指标成分含量测定的梯度洗脱条件相同；柱温40℃；流速每分钟1.0ml；检测波长为278nm。

测定法精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

4.1.2方法学验证

专属性试验：同含量测定。

精密度试验：取中药复方煎液按以上确定色谱条件，连续进样6次，记录阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、芦丁、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H，藁本内酯色谱峰峰面积及保留时间，计算其RSD％，并按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算各色谱图的相似度。结果表明，洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、芦丁、毛蕊花糖苷、藁本内酯峰面积RSD均小于3.0％，保留时间RSD小于1.0％，该仪器精密度良好。

重复性试验：按供试品制备方法制备6份中药复方供试品溶液，照上述确定色谱条件测定，记录阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、芦丁、藁本内酯、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H峰面积及保留时间，计算其RSD％，并按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算各色谱图的相似度计算相似度。结果表明，重复性试验中6份供试品溶液中，除藁本内酯为挥发油类成份，阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、芦丁、洋川芎内酯I、洋川芎内酯RSD小于3.0％，保留时间RSD均小于1.0％，按中药色谱图指纹图谱相似度评价系统，供试品色谱图相似度均在0.95以上。

稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别在0、8、16、24、48h进样，记录峰面积及保留时间，计算其RSD％，并按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算各色谱图的相似度计算相似度。结果表明，在室温条件下，48小时内，洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、芦丁、毛蕊花糖苷、藁本内酯色谱峰的峰面积RSD均小于3.0％，保留时间RSD均小于1.0％，按中药色谱图指纹图谱相似度评价系统，供试品色谱图相似度均在0.95以上，供试品溶液在室温条件下48小时内稳定性情况良好。

经以上方法学验证相关试验，证明该方法检测中药复方中当归、地黄、枸杞子的特指纹图谱准确、可靠、稳定、有效。

4.2中药复方煎液川楝子-麦冬指纹图谱方法的建立

4.2.1色谱条件的确立

麦冬中富含薯芋皂苷类成分，在皂苷供试品制备方法中，采用正丁醇进行相应萃取，并用氨试液进行了洗脱，其富集与萃取过程与川楝素富集过程类似。

为达到较好分离效果，故将洗脱梯度进行适当调整，最终确定的色谱条件如下所示：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(HALO 90A AQ-C₁₈ 4.6×150mm，2.7μm)；乙腈为流动相A，水为流动相B，按表6中的规定进行梯度洗脱，该梯度洗脱条件与川楝素含量测定的梯度洗脱条件相同。流速为每分钟0.7ml，柱温30℃，进样量为10μl。蒸发光散射检测器，漂移管温度110℃，气流量3.0L/min，灵敏度级别1。

4.2.2供试品溶液制备方式考察

同含量测定。

4.2.3方法学验证

专属性试验：取中药复方供试品溶液、麦冬单煎液供试品溶液、中药复方缺麦冬阴性对照供试品溶液、川楝子单煎液供试品溶液、中药复方缺川楝子阴性对照供试品溶液和空白溶剂对照溶液按确定的色谱条件进样分析，记录色谱图。结果表明，川楝素(峰1、峰2)及峰5来源于川楝子，峰3、峰4来源于麦冬，整体专属性良好。

精密度试验：取同一份供试品溶液，注入液相色谱仪，按确定的色谱条件连续进样6次，测定川楝素及麦冬特征峰的保留时间和峰面积，并计算RSD％。结果表明，连续进样5次，各监测的特征峰面积RSD小于5.0％，保留时间及相对保留时间RSD小于1.0％，符合规定。

重复性试验：按供试品制备方法制备6份供试品溶液，照上述确定色谱条件测定每份供试品溶液中川楝素及麦冬特征峰的保留时间和峰面积，并计算RSD％。结果表明，重复性试验中6份供试品溶液的特征峰相对峰面积RSD小于5.0％，相对保留时间RSD小于1.0％，故该方法重复性良好。

稳定性试验：取同一份供试品，分别在0、2、4、8、16、24、48小时进样，按确定色谱条件进行检测，记录川楝素及麦冬特征峰的保留时间及峰面积，并计算RSD％。结果表明，48小时内，川楝素峰面积RSD小于5.0％，川楝素、麦冬特征峰峰面积RSD小于5.0％，保留时间及相对保留时间RSD小于1.0％，符合规定，供试品在48小时内稳定。

经以上方法学验证相关试验，证明该方法检测中药复方中川楝子及麦冬指纹/特征图谱，准确、可靠、稳定、有效。

以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (27)

1.一种包含地黄的中药复方的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

取中药复方供试品溶液和对照品溶液进行检测，其中所述中药复方由北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子组成，所述对照品为地黄苷D、甜菜碱、阿魏酸、芦丁、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I、焦地黄苯乙醇苷A1、洋川芎内酯H、藁本内酯和川楝素，

检测所述地黄苷D的色谱条件如下所示：

色谱柱为Waters Atlantis T3，4.6×150mm，3μm色谱柱，流动相A为甲醇，流动相B为0.05％～0.2％的磷酸水溶液，流速为0.6～0.8mL/min，柱温为25～35℃，检测波长为200～210nm，梯度洗脱程序为：0～20min，5％～6％A；20～45min，6％A；

检测所述甜菜碱的色谱条件如下所示：

色谱柱为HALO，Penta-Hilic 4.6×250mm，5μm色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.001～0.01mol/l的pH为3～4的醋酸铵溶液，流速为0.8～1.2mL/min，柱温为25～35℃，梯度洗脱程序为：0～20min，88％A，蒸发光散射检测器，灵敏度1.0，漂移管温度105～115℃，气体流量2～3L/min；

检测所述阿魏酸、所述芦丁、所述毛蕊花糖苷、所述洋川芎内酯I、所述焦地黄苯乙醇苷A1、所述洋川芎内酯H和所述藁本内酯的色谱条件如下所示：

色谱柱为HALO 90A AQ-C₁₈ 4.6×250mm，5μm色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％～0.2％的磷酸水溶液，流速为0.8～1.2mL/min，柱温为35～45℃，洋川芎内酯I与洋川芎内酯H的检测波长为270～280nm，阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、芦丁、毛蕊花糖苷和藁本内酯检测波长为320～340nm，梯度洗脱程序为：0～10min，12％A；10～25min，12％～15％A；25～30min，15％～16％A；30～40min，16％～24％A；40～45min，24％～38％A；45～55min，38％～95％A；55～60min，95％A；

检测所述川楝素的色谱条件如下所示：

色谱柱为HALO 90A AQ-C₁₈ 4.6×150mm，2.7μm色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水，流速为0.6～0.8mL/min，柱温为25～35℃，梯度洗脱程序为：0～5min，34％A；5～30min，34％～55％A，蒸发光散射检测器，灵敏度1.0，漂移管温度105～115℃，气体流量2.5～3.5L/min；

根据检测结果，获得所述中药复方的成分信息，或者成分信息和含量信息。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，根据所记录的所述中药复方供试品溶液的色谱图和所述对照品溶液的色谱图中的相应峰面积，按照外标法计算所述中药复方中以下成分的含量：地黄苷D、甜菜碱、阿魏酸、芦丁、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I、焦地黄苯乙醇苷A1、洋川芎内酯H、藁本内酯和川楝素。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述中药复方供试品溶液的制备方法包括：称取适量的各味中药颗粒粉末，混合得到中药复方粉末，加入适量的水进行煎煮，加热至沸腾后，调至文火保持微沸30～60min，趁热滤过，得到所述中药复方供试品溶液。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述水与所述中药复方粉末的体积与质量(ml/g)之比为5～10。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述水与所述中药复方粉末的体积与质量(ml/g)之比为约8.5。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法包括：称取适量的地黄苷D、甜菜碱、阿魏酸、芦丁、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I、焦地黄苯乙醇苷A1、洋川芎内酯H、藁本内酯和川楝素；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为20～400μg/ml的所述对照品溶液。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述中药复方供试品溶液和所述对照品溶液在所述检测之前用0.22μm或0.45μm微孔滤膜过滤。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为(0.5～4):(0.5～4):(0.5～4):(1～6):(1～6):(1～6)。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为(1～2):(1～2):(1～2):(2～4):(2～4):(1～3)。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为(1.425～1.575):(1.425～1.575):(1.425～1.575):(2.85～3.15):(2.85～3.15):(1.9～2.1)。

11.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为约1.5:约1.5:约1.5:约3:约3:约2。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述地黄为生地黄。

13.一种包含地黄的中药复方的指纹图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

供试品溶液的制备：称取适量的各味中药颗粒粉末，混合得到中药复方粉末，加入适量的水进行煎煮，加热至沸腾后，调至文火保持微沸30～60min，趁热滤过，得到所述中药复方供试品溶液，其中所述中药复方由北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子组成；

对照品溶液的制备：称取适量的阿魏酸、芦丁、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I、焦地黄苯乙醇苷A1、洋川芎内酯H、藁本内酯和川楝素；以及添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇水溶液制成含各成分浓度为20～400μg/ml的所述对照品溶液；

根据高效液相检测所述供试品溶液和所述对照品溶液的结果，获得中药复方指纹图谱；

检测所述阿魏酸、所述芦丁、所述毛蕊花糖苷、所述洋川芎内酯I、所述焦地黄苯乙醇苷A1、所述洋川芎内酯H和所述藁本内酯的色谱条件如下所示：

色谱柱为Waters Atlantis T3，4.6×150mm，3μm色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％～0.2％的磷酸水溶液，流速为0.8～1.2mL/min，柱温为35～45℃，洋川芎内酯I与洋川芎内酯H的检测波长为270～280nm，阿魏酸、焦地黄苯乙醇苷A1、芦丁、毛蕊花糖苷和藁本内酯检测波长为320～340nm，梯度洗脱程序为：0～10min，12％A；10～25min，12％～15％A；25～30min，15％～16％A；30～40min，16％～24％A；40～45min，24％～38％A；45～55min，38％～95％A；55～60min，95％A；

检测所述川楝素和麦冬特征成分的色谱条件如下所示：

色谱柱为HALO 90A AQ-C18 4.6×150mm，2.7μm色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为水，流速为0.6～0.8mL/min，柱温为25～35℃，梯度洗脱程序为：0～5min，34％A；5～30min，34％～55％A，蒸发光散射检测器，灵敏度1.0，漂移管温度105～115℃，气体流量2.5～3.5L/min。

14.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为(0.5～4):(0.5～4):(0.5～4):(1～6):(1～6):(1～6)。

15.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为(1～2):(1～2):(1～2):(2～4):(2～4):(1～3)。

16.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为(1.425～1.575):(1.425～1.575):(1.425～1.575):(2.85～3.15):(2.85～3.15):(1.9～2.1)。

17.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于，北沙参、麦冬、当归、枸杞、地黄和川楝子之间的质量之比为约1.5:约1.5:约1.5:约3:约3:约2。

18.根据权利要求13至17中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述地黄为生地黄。

19.根据权利要求13至17中任一项所述的构建方法，其特征在于，检测所述阿魏酸、所述芦丁、所述毛蕊花糖苷、所述洋川芎内酯I、所述焦地黄苯乙醇苷A1、所述洋川芎内酯H和所述藁本内酯所获得的指纹图谱包括1-7号峰，其中，5号峰为洋川芎内酯I作为参照峰，1号峰为阿魏酸、2号峰为焦地黄苯乙醇苷A1、3号峰为芦丁，4号峰为毛蕊花糖苷，6号峰为洋川芎内酯H，7号峰为藁本内酯。

20.根据权利要求19所述的构建方法，其特征在于，1-7号峰的保留时间分别为16.5～17.5min、19.0～20.0min、22.5～23.5min、26.0～27.0min、29.0～30.0min、33.0～34.0min、53.0～54.0min。

21.根据权利要求19所述的构建方法，其特征在于，1号峰为当归药材和枸杞药材共有峰，2号峰、4号峰来自地黄药材，3号峰来自枸杞药材，5号峰、6号峰和7号峰来自当归药材。

22.根据权利要求19所述的构建方法，其特征在于，以洋川芎内酯I的5号色谱峰作为参照峰，其他6个峰的相对保留时间依次为1号色谱峰0.58±0.05、2号色谱峰0.66±0.05、3号色谱峰0.79±0.05、4号色谱峰0.91±0.05、6号色谱峰1.15±0.05、7号色谱峰1.83±0.05。

23.根据权利要求19所述的构建方法，其特征在于，检测所述川楝素和麦冬特征成分所获得的指纹图谱包括1-5号峰，其中1号峰和2号峰为川楝素，3号峰和4号峰为麦冬特征成分，5号峰来自川楝子药材，其保留时间分别为10.5～11.5min、13.0～14.0min、17.0～18.0min、18.0～19.0min、28.0～29.0min。

24.根据权利要求23所述的构建方法，其特征在于，1号峰为川楝素的异构体1的色谱峰，2号峰为川楝素的异构体2的色谱峰。

25.根据权利要求23所述的构建方法，其特征在于，1号峰来自川楝子药材，2号峰来自川楝子药材，3号峰来自麦冬药材，4号峰来自麦冬药材，5号峰来自川楝子药材。

26.根据权利要求23所述的构建方法，其特征在于，以川楝素的1号峰作为参照峰，其他4个峰的相对保留时间依次为2号色谱峰1.21±0.05、3号色谱峰1.56±0.05、4号色谱峰1.67±0.05、5号色谱峰2.56±0.05。

27.根据权利要求1至12中任一项所述的检测方法或根据权利要求13至26中任一项所述的构建方法在包含地黄的中药复方的质量检测或质量评价或质量控制中的用途。

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