CN117368372A - 海龙蛤蚧口服液的质量检测方法 - Google Patents

海龙蛤蚧口服液的质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，属于中药成分检测技术领域，其包括采用高效液相色谱‑质谱法对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf与人参皂苷Rb1的含量进行测定的方法和/或对黄岑苷的含量测定方法和/或对何首乌的薄层色谱鉴别方法。本发明提供的海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，采用高效液相色谱‑质谱法对海龙蛤蚧口服液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf与人参皂苷Rb1的含量进行了测定，采用高效液相色谱法对黄岑苷的含量进行了测定，采用薄层色谱法对何首乌进行了鉴别；所提供的检测方法精确性、稳定性、重复性好，能够对海龙蛤蚧口服液的质量进行更加有效、全面的检测、评价和控制，保证产品的质量和临床效果。

Description

海龙蛤蚧口服液的质量检测方法
技术领域
本发明涉及一种海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，属于中药成分检测技术领域。
背景技术
海龙蛤蚧口服液具有温肾壮阳、补益精血的功效，临床用于腰足酸软、面色白，阳痿遗精，宫冷不孕，头目眩晕等症，其处方为：海龙39.1g、蛤蚧0.73g、人参4.68g、羊鞭4.68g、羊外肾4.68g、黄芩4.68g、熟地黄3.1g、菟丝子3.1g、何首乌3.1g、地黄3.1g、陈皮3.1g、当归1.56g、黄芪4.68g、阳起石1.56g、莲须1.56g、甘草1.56g、川芎1.56g、泽泻1.56g、锁阳1.56g、豆蔻1.56g、沉香1.56g、鹿茸1.56g、枸杞子1.56g、肉苁蓉0.78g、炙淫羊藿1.56g、肉桂1.56g、韭菜子1.56g、蛇床子1.56g、花椒0.31g；制法为：以上二十九味，加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，浓缩至相对密度为1.04～1.06(80℃)的清膏，加乙醇二倍量，冷藏12小时，滤过，浓缩，加水，冷藏，滤过；取蔗糖500g加水溶解与上述滤液合并，混匀，加苯甲酸1.7g使溶解，用氢氧化钠调pH值4.6～4.8，调整总量至1000ml，滤过，分装，灭菌，即得。
目前，关于海龙蛤蚧口服液的质量检测主要包括对人参、黄芩、陈皮、黄芪的鉴别以及对淫羊藿苷的含量测定，检测项目少，尤其是对处方中人参的鉴别方法为薄层色谱法，而无法对人参皂苷的含量进行检测，不利于对药品的质量进行更加有效的控制和检测。
需要说明的是，上述内容属于发明人的技术认知范畴，并不必然构成现有技术。
发明内容
本发明为了解决现有技术所存在的问题，提供了一种海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，能够对海龙蛤蚧口服液的质量进行更加有效、全面的检测、评价和控制，保证药品的质量和临床效果。
本发明通过采取以下技术方案实现上述目的：
海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，包括采用高效液相色谱-质谱法对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf与人参皂苷Rb1的含量进行测定的方法和/或对黄岑苷的含量测定方法和/或对何首乌的薄层色谱鉴别方法。
在优选的实施方式中，采用高效液相色谱-质谱法对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf与人参皂苷Rb1的含量进行测定的方法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液以及人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf与人参皂苷Rb1的混合对照品溶液；
(2)确定色谱和质谱条件；
其中，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为40℃，流速为0.3ml/min；以乙腈为流动相A，水为流动相B进行梯度洗脱；
质谱条件为：采用三重四极杆串联质谱仪，离子源为电喷雾离子源，扫描方式为负离子模式，检测方式为多反应监测；
(3)测定：分别取供试品溶液、混合对照品溶液各1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，根据峰面积计算供试品溶液中各对照品的含量。
可选的，步骤(2)中，梯度洗脱程序为：0～12min：19％A，81％B；12～15min：19％→25％A，81％→75％B；15～35min：25％→80％A，75％→20％B。
可选的，步骤(2)中，质谱条件中还包括：
人参皂苷Rg1的定量离子对为m/z799.5→637.4，定性离子对为m/z799.50→475.4；
人参皂苷Re的定量离子对为m/z945.5→637.4，定性离子对为m/z945.55→475.4；
人参皂苷Rf的定量离子对为m/z799.5→637.4，定性离子对为m/z799.50→475.4；
人参皂苷Rb1的定量离子对为m/z1107.6→179.1，定性离子对为m/z1107.6→945.6。
可选的，步骤(1)中，供试品溶液的制备方法为：取海龙蛤蚧口服液100ml，加乙醚80ml，振摇提取，放置，弃去乙醚液，水层用水饱和正丁醇提取3次，每次50ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次50ml，第一次洗涤放置12h，合并2次氨试液，用水饱和正丁醇提取2次，每次25ml，合并2次正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，通过大孔吸附树脂柱，先后用水50ml、20％乙醇50ml和80％乙醇80ml洗脱，收集80％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至5ml，制成供试品溶液；
混合对照品溶液的制备方法为：分别取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rf对照品及人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1ml分别含0.1μg的混合对照品溶液。
在优选的实施方式中，对黄岑苷的含量测定方法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液和黄芩苷对照品溶液：
供试品溶液的制备方法为：取海龙蛤蚧口服液10ml置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，制成供试品溶液；
黄芩苷对照品溶液的制备方法为：取黄芩苷对照品10.23mg，置250ml量瓶中，加60％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，取40ml，置50ml量瓶中，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为31.23μg/ml的黄芩苷对照品溶液；
(2)确定色谱条件：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温25℃，流速为1ml/min，以体积比为47:53的甲醇-0.2％磷酸溶液为流动相进行洗脱，检测波长为280nm；
(3)测定：分别取黄芩苷对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，根据峰面积计算供试品溶液中黄芩苷的含量。
在优选的实施方式中，对何首乌的薄层色谱鉴别方法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液、对照药材溶液、大黄素对照品溶液、阴性对照溶液；
供试品溶液的制备方法为：取海龙蛤蚧口服液50ml，加入质量分数37％的盐酸3ml后，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次加乙酸乙酯30ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成供试品溶液；
对照药材溶液的制备方法为：取何首乌对照药材0.2g，加质量分数37％的盐酸0.5ml后，加乙酸乙酯20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液挥干，残渣浓缩至1ml，制成对照药材溶液；
大黄素对照品溶液的制备方法为：取大黄素对照品5.02mg，加甲醇5ml使溶解，制成大黄素对照品溶液；
阴性对照溶液的制备：取海龙蛤蚧口服液处方中除去何首乌的其他药味，制成缺何首乌阴性对照样品，采用同供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液；
(2)照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10～20μl、对照药材溶液2μl、大黄素对照品溶液1～2μl、阴性对照溶液10～20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15:2:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸混合溶液的上层溶液为展开剂，展开8cm，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材和大黄素对照品相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照在相应位置没有斑点。
本申请的有益效果包括但不限于：
本发明提供的海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，采用高效液相色谱-质谱法对海龙蛤蚧口服液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf与人参皂苷Rb1的含量进行了测定，采用高效液相色谱法对黄岑苷的含量进行了测定，采用薄层色谱法对何首乌进行了鉴别；所提供的检测方法精确性、稳定性、重复性好，能够对海龙蛤蚧口服液的质量进行更加有效、全面的检测、评价和控制，保证药品的质量和临床效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为人参液相色谱图(混合对照品峰由左至右依次为人参皂苷Rg1、Re、Rb1)；
图2为人参皂苷混合对照品MRM质谱图；
图3为海龙蛤蚧口服液样品MRM质谱图；
图4为海龙蛤蚧口服液阴性样品MRM质谱图；
图5为黄芩苷含量测定线性关系图；
图6为黄芩苷含量测定专属性HPLC色谱图；
图7为海龙蛤蚧口服液色谱柱耐用性HPLC色谱图；
图8为何首乌鉴别的薄层色谱图(温度：25℃，相对湿度：50％；薄层板：Merck公司，批号：HX72325726；1.缺何首乌阴性对照；2.样品2203011；3.样品2203012；4.样品2203013；5.样品2203014；6.样品2203015；7.何首乌对照药材；8.大黄素对照品；9.样品2203016；11.样品2202015；13.样品2006002；10.样品2203017；12.样品2011001)；
图9为何首乌鉴别的薄层色谱图(温度：25℃，相对湿度：50％，烟台化学工业研究所，批号：20210625；1.缺何首乌阴性对照；2.样品2203011；3.样品2203012；4.样品2203013；5.样品2203014；6.样品2203015；7.何首乌对照药材；8.大黄素对照品；9.样品2203016；10.样品2203017；11.样品2202015；12.样品2011001；13.样品2006002)；
图10为何首乌鉴别的薄层色谱图(温度：4℃，相对湿度：35％，烟台化学工业研究所，批号：20210625；1.缺何首乌阴性对照；2.样品2203011；3.样品2203012；4.样品2203013；5.样品2203014；6.样品2203015；7.何首乌对照药材；8.大黄素对照品；9.样品2203016；10.样品2203017；11.样品2202015；12.样品2011001；13.样品2006002)；
图11为何首乌鉴别方法中点样量考察的薄层色谱图(温度：20℃，相对湿度：45％烟台化学工业研究所，批号：20210625；1.何首乌对照药材；2.大黄素对照品；3～7：样品2203017，点样量由左至右依次为5，10，15，20，25μl)。
具体实施方式
在以下内容中将会对本发明进行进一步的详细描述。但是需要指出的是，以下的具体实施方式仅仅以示例性的方式给出本发明的具体操作实例，但是本发明的保护范围不仅限于此。本发明的保护范围仅仅由权利要求书所限定。本领域技术人员能够显而易见地想到，可以在本发明权利要求书限定的保护范围之内对本发明所述的实施方式进行各种其它的改良和替换，并且仍然能够实现相同的技术效果，达到本发明的最终技术目的。
一、仪器与材料：
1.1仪器：
岛津8050高效液相色谱-质谱联用仪，AB SCIEX Triple Quad 6500高效液相色谱-质谱联用仪，Mettler Toledo XSE205电子天平。
1.2材料：
对照品：人参皂苷Rg1对照品(中检院，批号：110703-202034)、人参皂苷Re对照品(中检院，批号：110754-202028)、人参皂苷Rf对照品(中检院，批号：111719-201806)、人参皂苷Rb1对照品(中检院，批号：110704-202129)。
试剂：乙腈，甲醇为色谱纯，水为Millipore制备纯化水，其他试剂均为分析纯。
海龙蛤蚧口服液，由山东宏济堂制药集团股份有限公司生产，样品批号2203011、2203012、2203013、2203014、2203015、2203016、2203017、2202015、2011001、2006002。
二、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf与人参皂苷Rb1的含量测定
2.1测定方法：
本发明中，采用高效液相色谱-质谱法对海龙蛤蚧口服液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf与人参皂苷Rb1的含量进行测定，测定方法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液以及人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf与人参皂苷Rb1的混合对照品溶液；
其中，供试品溶液的制备方法为：取海龙蛤蚧口服液100ml，加乙醚80ml，振摇，放置，弃去乙醚液，加水饱和正丁醇提取3次，每次50ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次50ml，第一次洗涤放置12h，合并2次氨试液，用水饱和正丁醇反洗2次，每次25ml，合并2次正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为12cm)，先后用水50ml、20％乙醇50ml和80％乙醇80ml洗脱，收集80％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
混合对照品溶液的制备方法为：取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1ml各含0.1μg的混合对照品溶液。
(2)确定色谱和质谱条件；
色谱条件：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径2.1mm)；以乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱；柱温为40℃；流速为0.3ml/min。
表1梯度洗脱程序
质谱条件：
采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾负离子模式(ESI﹣)，多反应监测(MRM)，接口温度：300℃，脱溶剂气温度：526℃，加热气流量：10L/min。理论板数按人参皂苷Rg1算应不低于4000。
监测离子对见下表2。
表2监测离子对
监测成分 离子对 CE(V)
人参皂苷Rg1 799.5→637.4* 26
799.50→475.4 38
人参皂苷Re 945.5→637.4* 20
945.55→475.4 32
人参皂苷Rf 799.5→637.4* 30
799.50→475.4 28
人参皂苷Rb1 1107.6→179.1 34
1107.6→945.6* 36
*表示定量离子对。
(3)测定：分别取供试品溶液、混合对照品溶液各1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，根据峰面积计算供试品溶液中各对照品的含量。
测定结果：
按2.1中确定的方法和条件，对10批海龙蛤蚧口服液样品进行测定，结果见表3。
表3海龙蛤蚧口服液样品中人参测定结果
海龙蛤蚧口服液每1ml含人参皂苷Rg1(C42H72O14)不得少于5ng/ml、人参皂苷Re(C48H82O18)不得少于5ng/ml、人参皂苷Rf(C42H72O14)不得少于5ng/ml，人参皂苷Rb1(C54H92O23)不得少于5ng/ml。
进一步的，本发明申请人还对人参皂苷的液相色谱图进行了探索，具体方法为：
混合对照品溶液1的制备：取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rb1对照品加甲醇制成每1ml各含1mg的混合对照品溶液1。
取2.1中的供试品溶液和混合对照品溶液1各1μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图见图1。液相检测结果表明，供试品溶液在与混合对照品溶液色谱保留时间相同的位置上无相应色谱峰。
2.2供试品溶液制备方式考察
2.2.1是否用乙醚洗涤考察：
样品1：取海龙蛤蚧口服液样品100ml，直接用水饱和正丁醇提取3次，后续步骤同
2.1中供试品溶液制备方法。
经检测，样品1中人参皂苷检测存在色谱峰干扰，确定需采用乙醚洗涤供试品溶液。
2.2.2萃取溶剂种类考察：
样品2：取海龙蛤蚧口服液各100ml，加入乙醚80ml，振摇提取，放置，弃去乙醚液，水层采用乙酸乙酯萃取3次，每次50ml，后续步骤同2.1中供试品溶液制备方法。结果表明，采用乙酸乙酯无法萃取完全，确定采用正丁醇进行萃取。
2.2.3是否采用氨试液洗涤考察：
样品3：取海龙蛤蚧口服液100ml，加乙醚80ml，振摇提取，放置，弃去乙醚液，水层用水饱和正丁醇提取3次，每次50ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为12cm)，用80％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至5ml，作为样品3。
样品4：取海龙蛤蚧口服液100ml，加乙醚80ml，振摇提取，放置，弃去乙醚液，水层用水饱和正丁醇提取3次，每次50ml，合并正丁醇液，用50ml氨试液洗涤1次，放置6h，用水饱和正丁醇提取2次，每次25ml，合并2次正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为12cm)，用80％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至5ml，作为样品4。经检测，样品3和样品4所检测人参皂苷含量偏低，确定用50ml氨试液洗涤2次(第一次放置12h)。
2.2.4是否采用D101大孔树脂纯化考察：
样品5：取海龙蛤蚧口服液100ml，不采用D101大孔树脂纯化，其余步骤同2.1中供试品溶液制备方法。结果表明，样品5人参皂苷检测存在干扰，确定采用D101大孔树脂纯化。
2.3方法学考察：
2.3.1专属性试验
按照2.1中方法制备供试品溶液和混合对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：取海龙蛤蚧口服液处方中除去人参的其他药味，按处方比例制成缺人参阴性对照样品，同2.1中供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
测定：分别精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液、阴性对照溶液各5μl，注入高效液相色谱-质谱仪，采用2.1中色谱和质谱条件，测定，结果见图2-图4。
在图3所示的供试品离子流色谱中，同时呈现与图2人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rf对照品和人参皂苷Rb1混合对照品色谱保留时间一致的色谱峰。图4阴性对照溶液中未出现与各对照品提取离子流色谱相应的色谱峰，表明阴性对照无干扰，方法专属性良好。
2.3.2线性关系考察
制备不同浓度的对照品溶液，按2.1中条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标(y)，对照品进样浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，各成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系，见表4。
表4线性关系及线性范围
2.3.3仪器精密度试验
取对照品溶液，按2.1中的色谱质谱条件，重复进样6次，结果人参皂苷、Rg1、Re、Rf、Rb1的峰面积RSD分别为2.5％，3.6％，3.0％，2.9％，表明仪器精密度良好。
2.3.4重复性试验
取海龙蛤蚧口服液，按2.1中方法平行制备供试品溶液6份，按2.1中的色谱质谱条件测定，结果人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1的含量RSD分别为3.4％，3.5％，2.9％，3.9％，表明方法重复性良好。
2.3.5稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24h按2.1中的色谱质谱条件测定，结果人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1峰面积RSD分别为3.2％、3.9％、2.7％、3.3％，表明样品在24h内稳定性良好。
2.3.6加样回收率试验
精密量取海龙蛤蚧口服液50ml，按相对于海龙蛤蚧口服液的100％添加人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1混合对照品溶液，按2.1中的方法制备，并按2.1中的色谱质谱条件测定，计算回收率。人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1的平均回收率分别为89％、82％、86％、85％，符合分析要求。
三、黄芩苷的含量测定：
3.1测定方法：
(1)制备供试品溶液和黄芩苷对照品溶液：
供试品溶液的制备方法为：取海龙蛤蚧口服液10ml置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，制成供试品溶液；
黄芩苷对照品溶液的制备方法为：取黄芩苷对照品10.23mg，置250ml量瓶中，加60％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，取40ml，置50ml量瓶中，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为31.23μg/ml的黄芩苷对照品溶液；
(2)确定色谱条件：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温25℃，流速为1ml/min，以体积比为47:53的甲醇-0.2％磷酸溶液为流动相进行洗脱，检测波长为280nm，理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2000；
(3)测定：分别取黄芩苷对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，根据峰面积计算黄芩苷的含量。
测定结果：
按3.1中的方法和条件，对10批海龙蛤蚧口服液样品进行测定，结果见表5。
表5黄芩苷含量测定结果
3.2方法学考察
3.2.1线性关系的考察
分别精密吸取3.1中的黄芩苷对照品溶液(31.23μg/ml)1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值。以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程：y＝3754.9x+323.47，相关系数r＝1.0000。试验结果表明，黄芩苷进样量在0.03123～0.62460μg之间进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系，测定结果见表6，线性关系见图5。
表6黄芩苷线性关系考察结果
3.2.2仪器精密度试验
精密吸取黄芩苷对照品溶液(31.23μg/ml)10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，测其峰面积积分值，结果见表7。
试验结果表明，仪器精密度良好。
3.2.3样品稳定性试验
取海龙蛤蚧口服液(批号：2203011)，照3.1中供试品溶液的制备方法制成供试品溶液。每隔一定时间进样一次，每次10μl，测定黄芩苷峰面积积分值，共考察24小时，以观察供试品溶液在检测过程中待测成分的稳定性，结果见表8。
表8稳定性试验结果
试验结果表明，供试品溶液在24小时内稳定性良好，能够满足测定需要。
3.2.4方法重复性考察
取海龙蛤蚧口服液(批号：2203011)，照3.1中供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，平行制备6份。
分别精密吸取3.1中的对照品溶液、上述供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，结果见表9。
表9重复性考察结果
试验结果表明，该含量测定方法的重复性良好。
3.2.5加样回收率试验
黄芩苷对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品10.23mg，置250ml量瓶中精密称定，加60％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密量取40ml，置50ml量瓶中，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度为31.23μg/ml的黄芩苷对照品溶液。
供试品溶液的制备：取已测知含量的海龙蛤蚧口服液5ml(批号：2203011，黄芩苷含量为0.0693mg/ml)，置25ml量瓶中，精密加入上述黄芩苷对照品溶液10ml，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，平行制备6份。
分别精密吸取上述黄芩苷对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，结果见表10。
表10加样回收率考察结果
试验结果表明，该含量测定方法的回收率良好。
3.2.6专属性试验
阴性对照溶液的制备：取海龙蛤蚧口服液处方中除去黄芩的其他药味，按处方比例制成缺黄芩阴性对照样品，照3.1中供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。
分别精密吸取黄芩苷对照品溶液、重复性试验项下的供试品溶液及阴性对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，进行测定，结果见图6。供试品色谱中，在与对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，而阴性对照色谱中无相应色谱峰，说明处方中其他药味对测定结果无干扰。
3.2.7色谱柱耐用性试验
分别使用三种不同品牌色谱柱，按3.1中色谱条件进行测试，结果显示黄芩苷色谱峰均峰型较好，与相邻色谱峰均可以达到基线分离，表明不同品牌的同类型色谱柱对黄芩苷的检测无显著影响，该试验条件适用范围广。
色谱柱的具体信息见表11，色谱图见图7。
表11不同色谱柱耐用性试验结果
四、对何首乌的薄层色谱鉴别方法：
4.1鉴别方法：
(1)制备供试品溶液、对照药材溶液、大黄素对照品溶液、阴性对照溶液；
供试品溶液的制备方法为：取海龙蛤蚧口服液50ml，加入质量分数37％的盐酸3ml后，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次加乙酸乙酯30ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成供试品溶液；点样量：10～20μl。
对照药材溶液的制备方法为：取何首乌对照药材0.2g，加质量分数37％的盐酸0.5ml后，加乙酸乙酯20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液挥干，残渣浓缩至1ml，制成对照药材溶液；点样量：2μl。
大黄素对照品溶液的制备方法为：取大黄素对照品5.02mg，加甲醇5ml使溶解，制成大黄素对照品溶液；点样量：1～2μl。
阴性对照溶液的制备：取海龙蛤蚧口服液处方中除去何首乌的其他药味，制成缺何首乌阴性对照样品，采用同供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液；点样量：10～20μl。
(2)照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10～20μl、对照药材溶液2μl、大黄素对照品溶液1～2μl、阴性对照溶液10～20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15:2:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸混合溶液的上层溶液为展开剂，展开8cm，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。
结果：供试品色谱中，在与对照药材和大黄素对照品相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照在相应位置没有斑点，表明阴性对照无干扰。
4.2方法考察：
采用不同品牌的薄层板及不同的温湿度条件进行试验，薄层照片见图8-图10，色谱图中均斑点清晰、分离效果较好。
对供试品溶液点样量(5～25μl)进行考察，结果见图11，最终确定点样量为10～20μl。
需要说明的是，本发明提供的质量检测方法中，色谱条件、质谱条件等测定条件为推荐条件，实际应用时可根据所配置仪器的具体情况作适当调整。样品注入检测仪器测定时，采用常规方法绘制标准曲线，并根据供试品溶液中各成分各自的色谱峰面积以及已建立的各指标成分的标准曲线计算待测成分含量即可。
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。

Claims (7)

1.海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，其特征在于，包括采用高效液相色谱-质谱法对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf与人参皂苷Rb1的含量进行测定的方法和/或对黄岑苷的含量测定方法和/或对何首乌的薄层色谱鉴别方法。
2.根据权利要求1所述的海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱-质谱法对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf与人参皂苷Rb1的含量进行测定的方法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液以及人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf与人参皂苷Rb1的混合对照品溶液；
(2)确定色谱和质谱条件；
其中，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为40℃，流速为0.3ml/min；以乙腈为流动相A，水为流动相B进行梯度洗脱；
质谱条件为：采用三重四极杆串联质谱仪，离子源为电喷雾离子源，扫描方式为负离子模式，检测方式为多反应监测；
(3)测定：分别取供试品溶液、混合对照品溶液各1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，根据峰面积计算供试品溶液中各对照品的含量。
3.根据权利要求2所述的海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，其特征在于，步骤(2)中，梯度洗脱程序为：0～12min：19％A，81％B；12～15min：19％→25％A，81％→75％B；15～35min：25％→80％A，75％→20％B。
4.根据权利要求2所述的海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，其特征在于，步骤(2)中，质谱条件中还包括：
人参皂苷Rg1的定量离子对为m/z799.5→637.4，定性离子对为m/z799.50→475.4；
人参皂苷Re的定量离子对为m/z945.5→637.4，定性离子对为m/z945.55→475.4；
人参皂苷Rf的定量离子对为m/z799.5→637.4，定性离子对为m/z799.50→475.4；
人参皂苷Rb1的定量离子对为m/z1107.6→179.1，定性离子对为m/z1107.6→945.6。
5.根据权利要求2所述的海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，供试品溶液的制备方法为：取海龙蛤蚧口服液100ml，加乙醚80ml，振摇提取，放置，弃去乙醚液，水层用水饱和正丁醇提取3次，每次50ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次50ml，第一次洗涤放置12h，合并2次氨试液，用水饱和正丁醇提取2次，每次25ml，合并2次正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，通过大孔吸附树脂柱，先后用水50ml、20％乙醇50ml和80％乙醇80ml洗脱，收集80％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至5ml，制成供试品溶液；
混合对照品溶液的制备方法为：分别取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rf对照品及人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1ml分别含0.1μg的混合对照品溶液。
6.根据权利要求1所述的海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，其特征在于，对黄岑苷的含量测定方法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液和黄芩苷对照品溶液：
供试品溶液的制备方法为：取海龙蛤蚧口服液10ml置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，制成供试品溶液；
黄芩苷对照品溶液的制备方法为：取黄芩苷对照品10.23mg，置250ml量瓶中，加60％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，取40ml，置50ml量瓶中，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为31.23μg/ml的黄芩苷对照品溶液；
(2)确定色谱条件：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温25℃，流速为1ml/min，以体积比为47:53的甲醇-0.2％磷酸溶液为流动相进行洗脱，检测波长为280nm；
(3)测定：分别取黄芩苷对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，根据峰面积计算供试品溶液中黄芩苷的含量。
7.根据权利要求1所述的海龙蛤蚧口服液的质量检测方法，其特征在于，对何首乌的薄层色谱鉴别方法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液、对照药材溶液、大黄素对照品溶液、阴性对照溶液；
供试品溶液的制备方法为：取海龙蛤蚧口服液50ml，加入质量分数37％的盐酸3ml后，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次加乙酸乙酯30ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成供试品溶液；
对照药材溶液的制备方法为：取何首乌对照药材0.2g，加质量分数37％的盐酸0.5ml后，加乙酸乙酯20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液挥干，残渣浓缩至1ml，制成对照药材溶液；
大黄素对照品溶液的制备方法为：取大黄素对照品5.02mg，加甲醇5ml使溶解，制成大黄素对照品溶液；
阴性对照溶液的制备：取海龙蛤蚧口服液处方中除去何首乌的其他药味，制成缺何首乌阴性对照样品，采用同供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液；
(2)照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10～20μl、对照药材溶液2μl、大黄素对照品溶液1～2μl、阴性对照溶液10～20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为15:2:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸混合溶液的上层溶液为展开剂，展开8cm，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材和大黄素对照品相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照在相应位置没有斑点。
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