CN115575541A - 一种银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，属于兽药中有效成分检测领域，包括如下步骤：制备含有各标准品的混合对照储备溶液；采用萃取剂对银黄二陈合剂样品进行超声萃取，离心、过滤，得提取液；采用超高效液相色谱法对多种活性成分同时进行检测；色谱柱为WATERS UPLC HSS T3色谱柱；流动相A为乙腈+0.05％磷酸，流动相B为0.05％磷酸水溶液，并对梯度洗脱程序进行了摸索。通过光谱图、保留时间、色谱峰面积等各项参数进行定性或定量检测，方法简便快速、分离效果好，测定精度高，结果重现性好，易于观察，专属性强，色谱峰峰形良好，既达到中国兽药典的要求，又节省时间、试剂。
Description
技术领域
本发明属于兽药中有效成分检测领域，具体涉及一种银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
银黄二陈合剂为中兽药成方制剂，收载于农业农村部公告第158号银黄二陈合剂质量标准。在农业农村部公告第158号银黄二陈合剂质量标准中，对黄芩(黄芩苷)、金银花(绿原酸)、陈皮(橙皮苷)、甘草(甘草苷)进行薄层鉴别，含量测定项主要针对金银花中的绿原酸和黄芩中的黄芩苷进行，测定过程中采用两个色谱系统分别进行定量，操作起来非常繁琐。
进一步的，第158号银黄二陈合剂质量标准中，对黄芩苷、橙皮苷、甘草苷采用的薄层色谱检测方法中，薄层色谱检测前期准备复杂，需要展开晾干、检视查看结果等多个步骤，费时费力；检测结果的荧光斑点受环境温湿度、人为操作、边缘效应等因素的干扰比较大，斑点常常不清晰，结果不易判定，重现性差；而且整个检测过程费时、费试剂，操作繁琐。且在实际检验工作中层析用的展开剂毒性大，例如：正丁醇，乙酸乙酯，甲酸，冰醋酸，甲醇等，对实验人员的伤害比较大。因此，迫切需要一种新的银黄二陈合剂检测方法以克服上述问题。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，包括如下步骤：
(1)分别称取多种活性成分的标准品并用有机溶剂配置成同时含有各标准品的混合对照储备溶液；
(2)采用萃取剂对银黄二陈合剂进行超声萃取，离心、过滤后得待测液；
(3)采用超高效液相色谱仪分别对混合对照储备溶液和待测液进行检测，通过色谱图、保留时间对待测液中的多种活性成分进行定性分析，通过色谱峰面积计算出待测液中多种活性成分的含量；
所述多种活性成分为：新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、菊苣酸、甘草苷、甘草酸、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和橙皮苷；
色谱条件为：流动相A为乙腈+0.05％磷酸，流动相B为0.05％磷酸水溶液，柱温为38-42℃；流动相的流速：0.35mL/min；进样量：0.5-5μL；
检测条件：PDA检测器，检测波长为238nm、251nm、278nm、284nm、327nm。。
本发明的有益效果为：
本发明通过液相色谱法同时把银黄二陈合剂中金银花(新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸等)，甘草(甘草苷、甘草酸)，黄芩(黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素)，陈皮(橙皮苷)等4种中药组分中的多种主要成分一次测定出来，方法简便快速、分离效果好，测定精度高，结果重现性好，易于观察，专属性强，色谱峰峰形良好，既达到中国兽药典的要求，又节省时间、试剂。
本发明的测定方法，选择50％乙醇为提取溶剂，对供试品进行提取，毒性小，化合物的峰面积响应值适中，样品处理简便，使用的溶剂，毒性小、操作安全环保，且对人和环境危害小。
本发明的测定方法使用超高效液相色谱仪配合PDA检测器，以色谱图和光谱图的方式呈现结果，方便快捷，结果直观，容易判断，检测限低，大大缩短了检验时间(从样品处理到上机检测品判定结果，约3-4个小时可以检测完成，而薄层检测方法，一个样品需要约12-18小时)，提升了检验效率、检测灵敏度和检验效果。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中新绿原酸、绿原酸、单咖啡酰酒石酸、咖啡酸、隐绿原酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、菊苣酸、甘草苷、甘草酸、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、橙皮苷混合对照品的光谱图；
图2为本发明实施例1中238nm银黄二陈合剂混合对照色谱图；
图3为本发明实施例1中251nm银黄二陈合剂混合对照色谱图；
图4为本发明实施例1中278nm银黄二陈合剂混合对照色谱图；
图5为本发明实施例1中284nm银黄二陈合剂混合对照色谱图；
图6为本发明实施例1中327nm银黄二陈合剂混合对照色谱图；
图7为本发明实施例1中238nm银黄二陈合剂50％甲醇色谱图；
图8为本发明实施例1中251nm银黄二陈合剂50％甲醇色谱图；
图9为本发明实施例1中278nm银黄二陈合剂50％甲醇色谱图；
图10为本发明实施例1中284nm银黄二陈合剂50％甲醇色谱图；
图11为本发明实施例1中327nm银黄二陈合剂50％甲醇色谱图；
图12为本发明实施例1中238nm银黄二陈合剂50％乙醇色谱图；
图13为本发明实施例1中251nm银黄二陈合剂50％乙醇色谱图；
图14为本发明实施例1中278nm银黄二陈合剂50％乙醇色谱图；
图15为本发明实施例1中284nm银黄二陈合剂50％乙醇色谱图；
图16为本发明实施例1中327nm银黄二陈合剂50％乙醇色谱图；
图17为本发明实施例1中238nm银黄二陈合剂25％乙醇50％甲醇色谱图；
图18为本发明实施例1中251nm银黄二陈合剂25％乙醇50％甲醇色谱图；
图19为本发明实施例1中278nm银黄二陈合剂25％乙醇50％甲醇色谱图；
图20为本发明实施例1中284nm银黄二陈合剂25％乙醇50％甲醇色谱图；
图21为本发明实施例1中327nm银黄二陈合剂25％乙醇50％甲醇色谱图；
图22为本发明实施例1中238nm银黄二陈合剂100％乙醇色谱图；
图23为本发明实施例1中251nm银黄二陈合剂100％乙醇色谱图；
图24为本发明实施例1中278nm银黄二陈合剂100％乙醇色谱图；
图25为本发明实施例1中284nm银黄二陈合剂100％乙醇色谱图；
图26为本发明实施例1中327nm银黄二陈合剂100％乙醇色谱图；
其中图2-26中色谱图的进样量均为1μL。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
银黄二陈合剂为中兽药成方制剂，收载于农业农村部公告第158号银黄二陈合剂质量标准。
【处方】：黄芩180g，金银花180g，姜半夏180g，陈皮180g，茯苓180g，甘草100g。
【制法】：除黄芩外，以上5味，加处方量的8倍水，加热至沸腾后加入黄芩，回流提取2次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.05～1.06(60℃)，静置12小时，滤过，滤液加3g苯甲酸钠，充分混匀，调整总量至1000ml，灌装，灭菌，即得。
【性状】本品为红棕色液体，久置后有少量沉淀；味甘，微苦。
【鉴别】(1)取本品1ml，加75％乙醇5ml，摇匀，静置，取上清液，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1.0mg的溶液；取绿原酸对照品，加75％乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。再取黄芩、金银花对照药材各0.2g，分别加水20ml，加热回流2次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至1ml，自“加75％乙醇5ml”起同法制成黄芩对照药材溶液和金银花对照药材溶液。吸取上述五种溶液各1～2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取本品2ml，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液，吸取上述两种溶液各2～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100:17:13)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铝乙醇溶液，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(3)取本品2ml，用乙醚提取2次，每次3ml，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇提取3次，每次3ml，合并正丁醇液，用水洗2次，每次10ml，分取正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。再取甘草对照药材0.2g，加水30ml，回流1小时，滤过，滤液浓缩至2ml，自“用乙醚提取2次”起，同法制成对照药材溶液。吸取上述三种溶液各2～4μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1.3:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【含量测定】黄芩
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-冰醋酸(50:50:1)为流动相；检测波长274nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于1500。
对照品溶液的制备取黄芩苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含0.16mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量取本品1ml，置50ml量瓶中，加50％甲醇适量，超声处理20分钟，放置至室温，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计，每1ml不得少于7.0mg。
金银花
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4％磷酸(10:90)为流动相；检测波长327nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1500。
对照品溶液的制备取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得(10℃以下保存)。
供试品溶液的制备精密量取本品1ml，置50ml棕色量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每1ml含金银花以绿原酸(C16H18O9)计，不得少于1.2mg。
【功能】清热解毒，燥湿化痰。
【主治】瘟热咳嗽，鸡传染性喉气管炎见上述证候者。
鉴于中国兽药典中对银黄二陈合剂中活性成分的鉴定及含量测定过程中存在的费时、费试剂，结果重现性差，影响检测人员的安全等问题，本发明提出了一种银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，包括如下步骤：
(1)分别称取多种活性成分的标准品并用有机溶剂配置成同时含有各标准品的混合对照储备溶液；
(2)采用萃取剂对银黄二陈合剂进行超声萃取，离心、过滤后得待测液；
(3)采用超高效液相色谱仪分别对混合对照储备溶液和待测液进行检测，通过色谱图、保留时间对待测液中的多种活性成分进行定性分析，通过色谱峰面积计算出待测液中多种活性成分的含量；
所述多种活性成分为：新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、菊苣酸、甘草苷、甘草酸、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和橙皮苷；
色谱条件为：流动相A为乙腈+0.05％磷酸，流动相B为0.05％磷酸水溶液，柱温为38-42℃；流动相的流速：0.35mL/min；进样量：0.5-5μL；
检测条件：PDA检测器，检测波长为238nm、251nm、278nm、284nm、327nm。
流动相A为乙腈+0.05％磷酸，流动相B为0.05％磷酸，水相和有机相中均含有等量的磷酸，流动相不管比例如何改变，pH稳定，色谱基线比较平稳，更容易提高检测过程的稳定性和检测的准确性。
该实施方式的一些实施例中，检测波长为238nm。
超高效液相色谱的检测波长为238nm、251nm、278nm、284nm、327nm，3D扫描范围：190-400nm，查看光谱图，帮助进行定性检测，确定检测波长为238nm原因为：251nm甘草酸色谱响应较高但橙皮苷无响应；278nm黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草苷、橙皮苷色谱响应较高，酚酸类化合物响应极低；284nm橙皮苷色谱响应较高；327nm绿原酸等酚酸类化合物、甘草苷等色谱响应较高；为寻找共同检测波长，尝试在238nm处，观察所有目标化合物色谱均有响应，其他杂峰干扰相对小，而且色谱响应相对较好。
该实施方式的一些实施例中，萃取剂包括无水乙醇、50％甲醇、50％乙醇中的一种或两种的混合物。
该实施方式的一些实施例中，萃取剂为50％乙醇。
由于银黄二陈合剂中含有的物质种类庞杂，对待测物质的干扰严重，难以直接检测。经过反复试验发现，不同浓度的乙醇和甲醇都可以较完全、且较好选择性地萃取银黄二陈合剂样品中的多种成分；在实施例中，所述萃取剂最终优化为50％乙醇，甲醇提取效率也可以，但是由于甲醇毒性大，为保证检测人员的安全，将其淘汰。
该实施方式的一些实施例中，银黄二陈合剂与萃取剂的体积比为1:25-100。
该实施方式的一些实施例中，超声萃取的时间为10-20min。采用超声萃取的方式可以有效提高萃取效率和萃取效果。
该实施方式的一些实施例中，离心条件为：转速9000-12000rpm/min，离心时间为5-15min；优选的，离心的转速为10000rpm/min，离心时间为8-12min。
该实施方式的一些实施例中，柱温为40℃。
该实施方式的一些实施例中，进样量为1-2μL。
该实施方式的一些实施例中，色谱柱为waters UPLC HSS T3色谱柱。
该实施方式的一些实施例中，梯度洗脱程序为0-8min，流动相A的体积分数维持在5％；8-12min，流动相A的体积分数由5％变为8％；12-15min，流动相A的体积分数由8％变为12％；15-18min，流动相A的体积分维持在12％；18-20min，流动相A的体积分数由12％变为18％；20-25min，流动相A的体积分维持在18％；25-30min，流动相A的体积分数由18％变为25％；30-40min，流动相A的体积分数维持在25％；40-42min，流动相A的体积分数由25％变为35％；42-46min，流动相A的体积分数由35％变为40％；46-52min，流动相A的体积分数维持在40％；52-53min，流动相A的体积分数由40％变为5％；53-55min，流动相A的体积分数维持在5％。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一种银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法
供试品：为企业报批样品，该实施例中的供试品分别由山东迅达康兽药有限公司供给。
磷酸为优级纯，乙醇、甲醇色谱纯，对照品主要购自于中国兽医药品监察所、中国食品药品检定研究院、中国生物制品研究所。
所用仪器：BP211D分析天平(赛多利斯，德国)；Waters AcquityTM超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，PDA检测器，色谱柱:waters UPLC HSS T3色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)。
一种银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，所述多种活性成分为：新绿原酸、绿原酸、单咖啡酰酒石酸、咖啡酸、隐绿原酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、菊苣酸、甘草苷、甘草酸、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和橙皮苷。测定方法包括如下步骤：
a、制备对照储备液和混合对照储备溶液
分别取新绿原酸、绿原酸、单咖啡酰酒石酸、咖啡酸、隐绿原酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、菊苣酸、甘草苷、甘草酸、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和橙皮苷对照品，用适宜浓度的乙醇或甲醇等适宜溶剂溶解并定容，分别配制成各自的对照储备液；将各对照储备液取适当体积混合，得到混合对照储备溶液，具体见下表1。
表1对照品配置信息
b、制备待测样品溶液：精密量取银黄二陈合剂供试品0.5～2mL，置于50mL容量瓶中，用适当溶剂溶解并定容至刻度，称重，超声提取15min，称重，用适当溶剂补足减少的重量，从中精密量取5mL，10000rpm/min离心10min，过滤，滤液供液相色谱测定；
c、所用仪器为超高效液相色谱仪，检测器为光电二极管阵列检测器，色谱柱为waters UPLC HSS T3色谱柱，柱温为38-42℃，最优选择238nm作为11种有效成分的检测波长，流动相A为乙腈(含0.05％磷酸)，流动相B为0.05％磷酸水溶液；流速：0.35mL/min；进样量：0.5-5μL；
选择PDA检测器可以同时进行多个波长的采集，通过多通道扫描的方式，选择238nm、251nm、278nm、284nm、327nm等通道，检测波长经过比较，11种化合物在238nm处，色谱峰响应良好，分离度良好。
流动相梯度洗脱程序如表2所示：
表2
| 时间 | A％ | B％ | 曲线 |
| 初始 | 5 | 95 | 初始 |
| 8 | 5 | 95 | 6 |
| 12 | 8 | 92 | 6 |
| 15 | 12 | 88 | 6 |
| 18 | 12 | 88 | 6 |
| 20 | 18 | 82 | 6 |
| 25 | 18 | 82 | 6 |
| 30 | 25 | 75 | 6 |
| 40 | 25 | 75 | 6 |
| 42 | 35 | 65 | 6 |
| 46 | 40 | 60 | 6 |
| 52 | 40 | 60 | 6 |
| 53 | 5 | 95 | 6 |
| 55 | 5 | 95 | 6 |
d、不同进样量的比较：将混合对照储备溶液取0.5μL、1μL、2μL注入高效液相色谱仪中，在步骤c的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间和光谱图定性鉴别；对照品进样量、峰面积，分离度等色谱参数信息见表3到表11。
表3混合对照品色谱数据表1μL 238nm
表4混合对照品色谱数据表1μL 251nm
表5混合对照品色谱数据表1μL 278nm
表6混合对照品色谱数据表1μL 284nm
表7混合对照品色谱数据表1μL 327nm
表8银黄二陈合剂样品色谱数据表50％甲醇提取(1/50)238nm
表9银黄二陈合剂样品色谱数据表25％乙醇50％甲醇提取(1/100)238nm
表10银黄二陈合剂样品色谱数据表50％乙醇提取(1/25)238nm
表11银黄二陈合剂样品色谱数据表无水乙醇提取(1/50)238nm
备注：1/25表示样品50倍稀释；1/50表示样品50倍稀释；1/100表示样品100倍稀释。
由不同溶剂提取的数据可以看出，色谱峰检出数量和色谱峰峰面积，都有差异。使用50％甲醇、50％乙醇、100％乙醇、含有50％甲醇、25％乙醇分别作为溶剂进行提取，通过数据可以看出，不同的溶剂合剂中单咖啡酰酒石酸量极少，无色谱响应；100％的乙醇，甘草酸很难提取出来；50％甲醇的各化合物的提取量从峰面积来看，比50％乙醇的高一些，但甲醇毒性比乙醇大，可以优先选择50％乙醇作为提取剂。
e、结果分析：取步骤b中滤液注入高效液相色谱仪中，在步骤c的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，测得滤液中各目标物的峰面积，以保留时间和光谱图定性。根据色谱图，供试品阳性样品色谱图中，在与12种对照品(单咖啡酰酒石酸除外)色谱相应的位置上，出现相同的色谱峰，如图7-26所示，峰形良好，分离度可以，表明可检出目标药材。
实施例2
色谱柱耐受性试验
采用不同温度和流速做微小的改变，测试其混合对照溶液保留时间和分离的稳定性。采用0.35mL/min的流速不变，以39℃、41℃柱温，或保持柱温40℃不变，流速改变以0.348mL/min、0.352mL/min进行采样。保留时间上下不超过0.6min，分离度良好，满足实验需求。
在现有的2017年版国家兽药质量标准下，薄层测定很难控制银黄二陈合剂的质量，使用本发明，可以进行准确而快速的测定，为制定2025年国家兽药典质量标准，打下了坚实的基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，采用不同品牌的液相仪器，不同品牌相似填料的色谱柱，针对梯度洗脱、流速、柱温等稍作调整所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)分别称取多种活性成分的标准品并用有机溶剂配置成同时含有各标准品的混合对照储备溶液；
(2)采用萃取剂对银黄二陈合剂进行超声萃取，离心、过滤后得待测液；
(3)采用超高效液相色谱仪分别对混合对照储备溶液和待测液进行检测，通过色谱图、保留时间对待测液中的多种活性成分进行定性分析，通过色谱峰面积计算出待测液中多种活性成分的含量；
所述多种活性成分为：新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、菊苣酸、甘草苷、甘草酸、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和橙皮苷；
色谱条件为：流动相A为乙腈+0.05％磷酸，流动相B为0.05％磷酸水溶液，柱温为38-42℃；流动相的流速：0.35mL/min；进样量：0.5-5μL；
检测条件：PDA检测器，检测波长为238nm、251nm、278nm、284nm、327nm。
2.根据权利要求1所述银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，其特征在于：检测波长为238nm。
3.根据权利要求1所述银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，其特征在于：所述萃取剂包括无水乙醇、50％甲醇、50％乙醇中的一种或两种的混合物。
4.根据权利要求3所述银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，其特征在于：所述萃取剂为50％乙醇。
5.根据权利要求1所述银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，其特征在于：银黄二陈合剂与萃取剂的体积比为1:25-100。
6.根据权利要求1所述银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，其特征在于：所述超声萃取的时间为10-20min。
7.根据权利要求1所述银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，其特征在于：所述柱温为40℃。
8.根据权利要求1所述银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，其特征在于：所述进样量为1-2μL。
9.根据权利要求1所述银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，其特征在于：所述色谱柱为waters UPLC HSS T3色谱柱。
10.根据权利要求1所述银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法，其特征在于：梯度洗脱程序为0-8min，流动相A的体积分数维持在5％；8-12min，流动相A的体积分数由5％变为8％；12-15min，流动相A的体积分数由8％变为12％；15-18min，流动相A的体积分维持在12％；18-20min，流动相A的体积分数由12％变为18％；20-25min，流动相A的体积分维持在18％；25-30min，流动相A的体积分数由18％变为25％；30-40min，流动相A的体积分数维持在25％；40-42min，流动相A的体积分数由25％变为35％；42-46min，流动相A的体积分数由35％变为40％；46-52min，流动相A的体积分数维持在40％；52-53min，流动相A的体积分数由40％变为5％；53-55min，流动相A的体积分数维持在5％。
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