CN113495110A - 公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法 - Google Patents

公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113495110A
CN113495110A CN202110895287.9A CN202110895287A CN113495110A CN 113495110 A CN113495110 A CN 113495110A CN 202110895287 A CN202110895287 A CN 202110895287A CN 113495110 A CN113495110 A CN 113495110A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stock solution
standard stock
standard
sample
ethanol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110895287.9A
Other languages
English (en)
Inventor
魏秀丽
张传津
张志民
王尚明
陆庆泉
汪安国
魏茂莲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Feed Veterinary Drug Quality Inspection Center
Shandong Soocom Animal Remedy Co ltd
Original Assignee
Shandong Feed Veterinary Drug Quality Inspection Center
Shandong Soocom Animal Remedy Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Feed Veterinary Drug Quality Inspection Center, Shandong Soocom Animal Remedy Co ltd filed Critical Shandong Feed Veterinary Drug Quality Inspection Center
Priority to CN202110895287.9A priority Critical patent/CN113495110A/zh
Publication of CN113495110A publication Critical patent/CN113495110A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
    • G01N30/52—Physical parameters
    • G01N30/54—Temperature
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法，以70％乙醇为提取溶剂对供试品进行提取，通过液相色谱法同时把四种主要成分一次测定出来，采用278nm、324nm和346nm作为种有效成分的波长，基线波动小，绿原酸和咖啡酸响应值较高，同时顾及了盐酸小檗碱的响应值，本发明方法能同时测定公英青蓝颗粒中绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、盐酸小檗碱四种成分的含量，该方法快速、灵敏、准确、专属性强，通过一次样品处理，即可同时测定四种成分的含量，不仅节省了试剂、时间，还提高了工作效率。

Description

公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法
技术领域
本发明涉及一种公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法，属于兽药中有效成分检测领域。
背景技术
公英青蓝颗粒为中兽药成方制剂，收载于《兽药质量标准》2017年版(中药卷)p97-98，处方为：蒲公英200g，大青叶200g，板蓝根200g，金银花100g，黄芩100g，黄柏100g，甘草100g，藿香50g，石膏50g；以上9味，加水煎煮2次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.28～1.30的清膏。取清膏1份，加糊精1.6份、蔗糖1份制成颗粒，干燥，整粒，制成900g，即得，为黄棕色的颗粒；味苦、微甘。具有清热解毒的功效，辅助治疗鸡传染性法氏囊等病毒性疾病，广泛应用于集约化家禽养殖企业。
公英青蓝颗粒质量标准中有4个薄层鉴别项(咖啡酸、精氨酸、黄芩苷、盐酸小檗碱)及绿原酸含量测定，《兽药质量标准》2017年版(中药卷)的收载的方法中，鉴别方法如下：
(1)取本品研细的粉末8g，加甲醇20ml使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取咖啡酸标准品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为标准品溶液。照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－甲酸－水(7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与标准品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取本品研细的粉末9g，加稀乙醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加稀乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取精氨酸标准品，加稀乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为标准品溶液。照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇－冰醋酸－水(19：5：5)为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与标准品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(3)取本品研细的粉末18g，加甲醇20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芩苷标准品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为标准品溶液。照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一含4％醋酸钠的羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水(5：3：1：1)为展开剂，预平衡30分钟，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与标准品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(4)取本品研细的粉末5g，加甲醇5ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱标准品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为标准品溶液。照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯－乙酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液(6：3：1.5：1.5：0.5)为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与标准品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
《兽药质量标准》2017年版(中药卷)的收载的方法中，绿原酸含量测定方法如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈－0.4％磷酸溶液(8：92)为流动相；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000。
标准品溶液的制备：取绿原酸标准品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含25μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品2.0g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法：别精密吸取标准品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每1g含金银花以绿原酸(C16H1809)计，不得少于0.50mg。
上述标准方法中，三个薄层鉴别分别是咖啡酸、黄芩苷和盐酸小檗碱，前处理方法各不相同，所用溶剂繁多，毒性较大：苯－乙酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液－丁酮－甲酸正丁醇－冰醋酸等，对实验人员的伤害比较大。另外本方案薄层色谱前期准备复杂，有的需要预饱和，展开，晾干，喷色，检视查看结果等多个步骤，费时费力，而且受环境温湿度等因素的干扰比较大，边缘效应等，薄层斑点有时方法难以判别，重现性差；因此薄层鉴别斑点受环境温湿度和人为操作的影响非常大，斑点常常不清晰，结果不易判定，而且费时，费试剂。
标准中仅仅对绿原酸一个成分进行含量测定，无法同时检测其他有效成分。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法。
该方法能同时测定公英青蓝颗粒中绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、盐酸小檗碱四种成分的含量，该方法快速、灵敏、准确、专属性强，通过一次样品处理，即可同时测定四种成分的含量，不仅节省了试剂、时间，还提高了工作效率。
为实现以上目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法，所述的4种有效成分为绿原酸、咖啡酸、盐酸小檗碱、黄芩苷，测定方法包括如下步骤：
a、制备标准储备液和混合标准储备溶液
取绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、盐酸小檗碱标准品，用甲醇溶解并定容，分别配制成绿原酸标准储备液、咖啡酸标准储备液、黄芩苷标准储备液、盐酸小檗碱标准储备液；将各标准储备液混合，得到混合标准储备溶液；
b、制备待测样品溶液：取供试品，置于25mL容量瓶中，用65-75％乙醇溶解并定容至刻度，超声提取、离心、过滤，滤液供液相色谱测定；
c、所用仪器为超高效液相色谱仪，检测器为光电二极管阵列检测器，色谱柱为T3色谱柱，柱温为30-40℃，选择217nm、278nm、228nm、324nm、346nm作为种有效成分的检测波长，流动相A为甲醇，流动相B为0.4％磷酸，A、B两项的混合液作为洗脱液；洗脱梯度程序:0～10min，20％A；10～15min，20％A线性变化到25％A；15～16min，25％A；16～20min，25％A线性变化到36％A；20～35min，36％A；35～40min，36％A线性变化到55％A；40～48min，55％A；48～50min，55％A线性变化到70％A；50～55min，70％A；40～48min，55％A；55～57min，70％A线性变化到20％A；57～58min，20％A；流速：1.0mL/min；进样量：0.2～5μL；
d、标准曲线的绘制：将混合标准储备溶液注入高效液相色谱仪中，在步骤c的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据进样量所测峰面积的大小与其进样量的对应关系绘制标准曲线；
e、结果分析：取步骤b中滤液注入高效液相色谱仪中，在步骤c的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，测得滤液中各目标物的峰面积，以保留时间定性，根据步骤d中制作的标准曲线定量，计算出供试品中有效成分的含量。
根据本发明优选的，步骤a中，
绿原酸标准储备液的浓度为180-200μg/ml。
咖啡酸标准储备液的浓度为320-340μg/ml。
黄芩苷标准储备液的浓度为220-240μg/ml。
盐酸小檗碱标准储备液的浓度为180-200μg/ml。
根据本发明优选的，步骤a中，
绿原酸标准储备液、咖啡酸标准储备液、黄芩苷标准储备液、盐酸小檗碱标准储备液混合的体积比为：(1.4-1.6)：1：(1.8-2.4)：(1.1-1.6)。
根据本发明优选的，步骤b中，乙醇的质量浓度为70％。
根据本发明优选的，步骤b中，供试品与乙醇的质量体积比：(1-2)：(20-50)，单位，g/mL；
进一步优选的，步骤b中，供试品与乙醇的质量体积比：1：(20-30)，单位，g/mL。
进一步优选的，步骤b中，供试品与乙醇的质量体积比：1：25，单位，g/mL。
根据本发明优选的，步骤b中，超声提取时的超声功率为35-50KHz，超声提取时间为20-40min。
根据本发明优选的，步骤b中，离心转速为8000-15000rpm/min，离心时间为3-8min。
根据本发明优选的，步骤c中，所述色谱柱规格为长(150-250)mm×内径4.6mm，填料颗粒粒径5μm。
根据本发明优选的，步骤c中，有效成分的检测波长为324nm。
由于绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、盐酸小檗碱检测最高吸收波长各有不同，本发明选择波长扫描范围190-400nm，选择217nm、278nm、228nm、324nm、346nm多检测波长对有效成分进行了比较，其中278nm、324nm和346nm作为种有效成分的波长，基线波动小，绿原酸和咖啡酸响应值较高，同时顾及了盐酸小檗碱的响应值，尤其是检测波长为324nm，绿原酸和咖啡酸在324nm处响应值较高，同时顾及了盐酸小檗碱的响应值，由于其黄芩苷的含量较高，在324nm处响应较小，不容易超载，峰形较好，可以简单、准确、同时测定4种有效成分含量。
优选的，步骤c中，流动相梯度洗脱程序如表1所示：
表1
Figure BDA0003197595010000041
根据本发明优选的，步骤d中，所述标准曲线系数不小于0.999。
结果判定：根据色谱图，供试品色谱中，在与4种标准品色谱相应的位置上，出现相同的色谱峰，表明可检出金银花、蒲公英、黄柏、黄芩。
本发明与现有技术相比具有以下技术特点和优点：
1、本发明中通过液相色谱法同时把四种主要成分一次测定出来，方法简便快速、分离效果好，测定精度高，结果重现性好，易于观察，专属性强，色谱峰峰形良好，既达到中国兽药典的要求，又节省时间、试剂，可以进行准确而快速的测定，为制定2025年国家兽药典质量标准，打下了坚实的基础；而现有2017年版国家兽药质量标准中薄层测定很难控制公英青蓝颗粒的质量，含量测定仅仅对绿原酸一个成分进行含量测定，无法同时检测其他有效成分。
2、本发明的测定方法，以70％乙醇为提取溶剂对供试品进行提取，毒性小，化合物的峰面积响应值适中，样品处理简便、省试剂、省时间，使用的溶剂，毒性小，操作安全环保，对人和环境危害小；而公英青蓝颗粒原标准对黄芩、黄柏、绿原酸的薄层测定，处理时间长，采用的多种试剂：苯、丁酮、乙酸乙酯、异丙醇、正丁醇、浓氨溶液等，且苯属于一类致癌物，所用试剂毒性大，斑点有时候不清晰，受环境温湿度和人员操作等的影响较大，有时斑点结果不易判断。
3、本发明的测定方法使用高效液相色谱仪，以色谱图的方式呈现结果，方便快捷，结果直观，容易判断，检测限低，大大缩短了检验时间，提升了检验效率、检测灵敏度和检验效果。
4、本发明的方法一个样品从样品处理到上机检测品判定结果，约2个小时可以检测完成；而现有国家标准，不同的薄层检测时样品前处理非常复杂，需要多个展开缸，多种展开剂，需要预饱和、展开，晾干，喷色等多个步骤，一个样品约需要8个小时，本发明大大缩短了检测时间，提高了检验效率。
附图说明
图1为绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、盐酸小檗碱标准品的光谱图；其中，a为15.33min绿原酸，b为18.42min咖啡酸，c为34.98min盐酸小檗碱，d为43.55min黄芩苷；
图2为混合标准储备溶液在波长346nm色谱图；
图3为混合标准储备溶液在波长217nm色谱图；
图4为混合标准储备溶液在波长278nm色谱图；
图5为混合标准储备溶液在波长228nm色谱图；
图6为混合标准储备溶液在波长324nm色谱图；
图7为公英青蓝颗粒324nm色谱图，70％乙醇处理；
图8为公英青蓝颗粒324nm色谱图，(甲醇：盐酸＝100:1)：水＝1:1处理；
图9为公英青蓝颗粒324nm色谱图，(70％乙醇：盐酸)＝100:0.5处理；
图10为公英青蓝颗粒324nm色谱图，(70％乙醇：盐酸)＝100:0.5处理；
图11为公英青蓝颗粒324nm色谱图，(70％乙醇：盐酸)＝100:0.5处理；
图12为公英青蓝颗粒324nm色谱图，(甲醇：盐酸＝100:1)：水＝1:1处理；
图13为公英青蓝颗粒324nm色谱图，70％乙醇处理；
图14为公英青蓝颗粒324nm色谱图，100％甲醇处理；
图15为公英青蓝颗粒324nm色谱图，5％甲醇处理；
图16为公英青蓝颗粒324nm色谱图，100％乙醇处理；
图17为公英青蓝颗粒324nm色谱图，50％乙醇处理；
图18为公英青蓝颗粒324nm色谱图，70％乙醇处理；
图19为公英青蓝颗粒324nm色谱图，50％甲醇处理；
图20为公英青蓝颗粒324nm色谱图，(甲醇：盐酸＝100:5)：水＝1:1处理；
图21为公英青蓝颗粒324nm色谱图，甲醇：盐酸＝100:1处理；
图22为公英青蓝颗粒324nm色谱图，水处理；
图23为黄芩苷标准曲线图；
图24为咖啡酸标准曲线图；
图25为绿原酸标准曲线图；
图26为盐酸小檗碱标准曲线图；
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例中，供试品：为自制样品，自制样品，为严格按照药典处方本实验进行生产的样品。
无水乙醇、盐酸均为分析纯，磷酸为优级纯，甲醇色谱纯，标准品来源见表2所示。
表2标准品来源表
标准品名称 来源 含量 批号
绿原酸 中国兽医药品监察所 0.98 z0261702
咖啡酸 中国食品药品检定研究院 0.997 110885-201703
盐酸小檗碱 中国食品药品检定研究院 0.927 110713-2017134
黄芩苷 中国食品药品检定研究院 0.933 110715-201318
所用仪器；BP211D分析天平(赛多利斯，德国)；Waters超高效液相色谱仪，PDA检测器，T3色谱柱(waters，4.6*25.00mm，5μm)。
实施例1
公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法，所述的4种有效成分为绿原酸、咖啡酸、盐酸小檗碱、黄芩苷，测定方法包括如下步骤：
a、制备标准储备液和混合标准储备溶液
取绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、盐酸小檗碱标准品，用甲醇溶解并定容，分别配制成绿原酸标准储备液、咖啡酸标准储备液、黄芩苷标准储备液、盐酸小檗碱标准储备液；将各标准储备液混合，得到混合标准储备溶液，具体见下表3：
表3
Figure BDA0003197595010000071
b、制备待测样品溶液：精密称取公英青蓝颗粒供试品1.0g，置于25mL容量瓶中，用70％乙醇溶解并定容至刻度，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，滤液供液相色谱测定；
c、所用仪器为超高效液相色谱仪，检测器为光电二极管阵列检测器，色谱柱为T3色谱柱，柱温为30-40℃，选择324nm作为种有效成分的检测波长，流动相A为甲醇，流动相B为0.4％磷酸，A、B两项的混合液为洗脱液；流速：1.0mL/min；进样量：1～20μL；
选择PDA检测器可以同时进行多个波长的采集，通过多通道扫描的方式，选择217nm，228nm，278nm，324nm，346nm，等通道，检测波长经过比较，4种化合物在324nm处，线性关系良好，分离度良好。
流动相梯度洗脱程序如表1所示：
表1
Figure BDA0003197595010000072
Figure BDA0003197595010000081
d、标准曲线的绘制：将混合标准储备溶液取1μl、2μl、5μl、8μl、10μl、12μl、15μl、20μl注入高效液相色谱仪中，在步骤c的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据进样量所测峰面积的大小与其进样量的对应关系绘制标准曲线；标准品进样量和峰面积等色谱参数信息见表4-1到表4-4所示：
表4-1黄芩苷
Figure BDA0003197595010000082
Figure BDA0003197595010000091
表4-2咖啡酸
Figure BDA0003197595010000092
Figure BDA0003197595010000101
表4-3绿原酸
Figure BDA0003197595010000102
表4-4盐酸小檗碱
Figure BDA0003197595010000103
结果计算表明：黄芩苷在81.77-1226.55ng范围内线性良好，y＝2329.5x-50000.7，R2＝0.9999；咖啡酸在55.63-834.45ng范围内线性良好，y＝5593.3x-31795，R2＝0.9997；绿原酸在48.36-725.0.4ng范围内线性良好，y＝2132.5x+4431.1，R2＝0.9992；盐酸小檗碱在45.81-687.15ng范围内线性良好，y＝3486.7x-8801.4，R2＝0.9998。
e、结果分析：取步骤b中滤液注入高效液相色谱仪中，在步骤c的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，测得滤液中各目标物的峰面积，以保留时间定性，根据步骤d中制作的标准曲线定量，计算出供试品中有效成分的含量。根据色谱图，供试品阳性样品色谱图中，在与4种标准品色谱相应的位置上，出现相同的色谱峰，峰形良好，分离度达标，表明可检出目标药材。
实施例2
同实施例1所述的公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法，不同之处在于：
步骤b中，制备待测样品溶液：精密称取公英青蓝颗粒供试品2.0g，置于50mL容量瓶中，用70％乙醇溶解并定容至刻度，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，滤液供液相色谱测定；其他条件及步骤同实施例1。
实验例：
1、不同溶剂处理方法对检测结果的影响
比较不同溶剂处理方法对检测结果的影响，步骤b中，制备待测样品溶液选自表5中方法A、方法B或方法C，方法D，方法E，方法F，方法G，方法H，方法，方法I，方法J。
表5
序号 方法 不同溶剂处理方法
1 方法A 70％乙醇：盐酸＝100:0.5
2 方法B 水
3 方法C 50％甲醇
4 方法D (100甲醇:1盐酸)：水＝1:1
5 方法E 5％甲醇
6 方法F 50％乙醇
7 方法G (100甲醇:5盐酸)：水＝1:1
8 方法H 无水乙醇
9 方法I 甲醇
10 方法J 甲醇：盐酸＝100:1
11 方法K 70％乙醇
具体的：
方法A为：精密称取供试品1.0g，加70％乙醇：盐酸＝100:0.5至25.0ml容量瓶，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，作为供试品溶液。
方法B为：精密称取供试品1.0g，加水至25.0ml容量瓶，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，作为供试品溶液。
方法C为：精密称取供试品1.0g，加50％甲醇至25.0ml容量瓶，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，作为供试品溶液。
方法D为：精密称取供试品1.0g，加(100甲醇:1盐酸)：水＝1:1至25.0ml容量瓶，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，作为供试品溶液。
方法E为：精密称取供试品1.0g，加5％甲醇至25.0ml容量瓶，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，作为供试品溶液。
方法F为：精密称取供试品1.0g，加50％乙醇至25.0ml容量瓶，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，作为供试品溶液。
方法G为：精密称取供试品1.0g，加(100甲醇:5盐酸)：水＝1:1至25.0ml容量瓶，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，作为供试品溶液。
方法H为：精密称取供试品1.0g，加无水乙醇至25.0ml容量瓶，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，作为供试品溶液。
方法I为：精密称取供试品1.0g，加甲醇至25.0ml容量瓶，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，作为供试品溶液。
方法J为：精密称取供试品1.0g，加甲醇：盐酸＝100:1至25.0ml容量瓶，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，作为供试品溶液。
方法K为：精密称取供试品1.0g，加70％乙醇至25.0ml容量瓶，超声提取30min，从中取出10ml，10000rpm/min离心5min，过滤，作为供试品溶液。
不同提取方式结果比较见表6所示，光谱图可以辅助对化合物进行定性，色谱图谱见附图2-22，标准曲线见图23-26，可以通过保留时间和峰面积进一步进行化合物的定性和定量测定。样品不同提取方式的结果比较(进样量5μl)，见下表6所示：
表6样品不同提取方式的结果比较
Figure BDA0003197595010000121
Figure BDA0003197595010000131
Figure BDA0003197595010000141
Figure BDA0003197595010000151
通过表6可以看出，以70％乙醇为提取溶剂，毒性小，化合物的峰面积响应值适中，适合定量检验。
2、提取方法的准确性试验
对同一份公英青蓝颗粒样品，以70％乙醇为提取溶剂，重复提取6次，计算含量平均值和RSD，见表7。
表7提取方法的准确性
Figure BDA0003197595010000152
Figure BDA0003197595010000161
3、重复性试验
取标准品，进样5μl，重复配置6次，计算4种成分的峰面积和保留时间的平均值和RSD，满足检测需求，见表8：
表8复性试验的峰面积和保留时间
Figure BDA0003197595010000162
Figure BDA0003197595010000171
4、精密度试验
取1份标准品，进样5μl，重复进样6次，计算4种成分的峰面积和保留时间的平均值和RSD，满足检测需求，见表9：
表9精密度试验的峰面积和保留时间
Figure BDA0003197595010000172
Figure BDA0003197595010000181
5、测定方法稳定性试验
取混合对照溶液，在室温放置1、3、6、12、24h，各进样5μL，计算4种主成分各自的峰面积RSD。黄芩苷，绿原酸，咖啡酸，盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为0.40％，0.38％，0.19％，0.34％见表10，通过表10可以看出，本发明的测定方法稳定性强。
表10测定方法稳定性
化合物名称 黄芩苷 咖啡酸 绿原酸 盐酸小檗碱
1h 949271 1522332 518245 792753
3h 940008 1534369 519772 785207
6h 948509 1519878 520364 789562
12h 948691 1523695 520569 789968
24h 946839 1528967 518999 789899
峰面积平均值 946663.6 1525.0848.2 519589.8 789477.8
峰面积RSD 0.40％ 0.38％ 0.19％ 0.34％
6、色谱柱耐受性试验
采用不同温度和流速做微小的改变，测试其混合对照溶液保留时间和分离的稳定性。采用1.00ml/min的流速不变，以33℃、38℃柱温，或保持柱温35℃不变，流速改变以1.01ml/min、0.99ml/min进行采样。保留时间上下不超过1.0min，分离度良好，满足实验需求。
如在实际检测样品时发现响应值较低，可以适当提高进样量到5-20μl，色谱图中的各种成分色谱峰可以显而易见。
尽管已经出示和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，比如使用不同品牌的色谱仪，使用不同厂家的色谱柱，使用比例稍微改变的流动相组成，不同的柱温等等，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法，所述的4种有效成分为绿原酸、咖啡酸、盐酸小檗碱、黄芩苷，测定方法包括如下步骤：
a、制备标准储备液和混合标准储备溶液
取绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、盐酸小檗碱标准品，用甲醇溶解并定容，分别配制成绿原酸标准储备液、咖啡酸标准储备液、黄芩苷标准储备液、盐酸小檗碱标准储备液；将各标准储备液混合，得到混合标准储备溶液；
b、制备待测样品溶液：取供试品，置于25mL容量瓶中，用65-75％乙醇溶解并定容至刻度，超声提取、离心、过滤，滤液供液相色谱测定；
c、所用仪器为超高效液相色谱仪，检测器为光电二极管阵列检测器，色谱柱为T3色谱柱，柱温为30-40℃，选择217nm、278nm、228nm、324nm、346nm作为种有效成分的检测波长，流动相A为甲醇，流动相B为0.4％磷酸，A、B两项的混合液作为洗脱液；洗脱梯度程序:0～10min，20％A；10～15min，20％A线性变化到25％A；15～16min，25％A；16～20min，25％A线性变化到36％A；20～35min，36％A；35～40min，36％A线性变化到55％A；40～48min，55％A；48～50min，55％A线性变化到70％A；50～55min，70％A；40～48min，55％A；55～57min，70％A线性变化到20％A；57～58min，20％A；流速：1.0mL/min；进样量：0.2～5μL；
d、标准曲线的绘制：将混合标准储备溶液注入高效液相色谱仪中，在步骤c的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据进样量所测峰面积的大小与其进样量的对应关系绘制标准曲线；
e、结果分析：取步骤b中滤液注入高效液相色谱仪中，在步骤c的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，测得滤液中各目标物的峰面积，以保留时间定性，根据步骤d中制作的标准曲线定量，计算出供试品中有效成分的含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤a中，
绿原酸标准储备液的浓度为180-200μg/ml，
咖啡酸标准储备液的浓度为320-340μg/ml，
黄芩苷标准储备液的浓度为220-240μg/ml，
盐酸小檗碱标准储备液的浓度为180-200μg/ml。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤a中，
绿原酸标准储备液、咖啡酸标准储备液、黄芩苷标准储备液、盐酸小檗碱标准储备液混合的体积比为：(1.4-1.6)：1：(1.8-2.4)：(1.1-1.6)。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤b中，乙醇的质量浓度为70％。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤b中，供试品与乙醇的质量体积比：(1-2)：(20-50)，单位，g/mL。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤b中，供试品与乙醇的质量体积比：1：(20-30)，单位，g/mL；优选的，步骤b中，供试品与乙醇的质量体积比：1：25，单位，g/mL。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤b中，超声提取时的超声功率为35-50KHz，超声提取时间为20-40min。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤b中，离心转速为8000-15000rpm/min，离心时间为3-8min。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤c中，所述色谱柱规格为长(150-250)mm×内径4.6mm，填料颗粒粒径5μm。
10.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤c中，有效成分的检测波长为324nm，步骤d中，所述标准曲线系数不小于0.999。
CN202110895287.9A 2021-08-05 2021-08-05 公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法 Pending CN113495110A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110895287.9A CN113495110A (zh) 2021-08-05 2021-08-05 公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110895287.9A CN113495110A (zh) 2021-08-05 2021-08-05 公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113495110A true CN113495110A (zh) 2021-10-12

Family

ID=77996633

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110895287.9A Pending CN113495110A (zh) 2021-08-05 2021-08-05 公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113495110A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114137129A (zh) * 2021-12-16 2022-03-04 山东省饲料兽药质量检验中心 一种采用hplc-pda方法检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法
CN114235993A (zh) * 2021-12-02 2022-03-25 魏秀丽 一种采用hplc-pda检测板青败毒口服液中13种有效成分的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105651722A (zh) * 2016-03-29 2016-06-08 四川德成动物保健品有限公司 一种基于紫外指纹图谱的公英青蓝合剂质量控制方法
CN112229934A (zh) * 2020-11-17 2021-01-15 山东宏济堂制药集团股份有限公司 一种当归六黄汤全成分的分析方法
CN112415109A (zh) * 2020-11-03 2021-02-26 广州那比昂生物科技有限公司 一种同时测定祛痘组合物中不同特征成分的hplc检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105651722A (zh) * 2016-03-29 2016-06-08 四川德成动物保健品有限公司 一种基于紫外指纹图谱的公英青蓝合剂质量控制方法
CN112415109A (zh) * 2020-11-03 2021-02-26 广州那比昂生物科技有限公司 一种同时测定祛痘组合物中不同特征成分的hplc检测方法
CN112229934A (zh) * 2020-11-17 2021-01-15 山东宏济堂制药集团股份有限公司 一种当归六黄汤全成分的分析方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
农业部曾药评审中心: "《兽药国家标准汇编第三册》", 1 July 2012 *
潘春晖等: "基于紫外指纹图谱的公英青蓝合剂质量研究", 《中国畜牧兽医》 *
董自波等: "HPLC同时测定蒲地蓝消炎口服液中7个成分的含量", 《中国中药杂志》 *
闫研等: "HPLC法同时测定复方蒲芩胶囊中4种有效成分的含量", 《海峡药学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114235993A (zh) * 2021-12-02 2022-03-25 魏秀丽 一种采用hplc-pda检测板青败毒口服液中13种有效成分的方法
CN114235993B (zh) * 2021-12-02 2024-04-26 魏秀丽 一种采用hplc-pda检测板青败毒口服液中13种有效成分的方法
CN114137129A (zh) * 2021-12-16 2022-03-04 山东省饲料兽药质量检验中心 一种采用hplc-pda方法检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法
CN114137129B (zh) * 2021-12-16 2023-06-20 山东省饲料兽药质量检验中心 一种采用hplc-pda方法检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101444606B (zh) 一种六味安消中药制剂的质量检测方法
CN113495110A (zh) 公英青蓝颗粒中4种有效成分同时测定方法
CN103869041A (zh) 一种止咳口服药物组合物的质量控制方法
CN113466355A (zh) 一种青风藤高效液相特征图谱方法的构建
CN109085285B (zh) 一种肠炎宁颗粒的质量控制方法
CN108037200B (zh) 一种滋肾宁神丸的质量检测方法
CN115575541B (zh) 一种银黄二陈合剂中多种活性成分同时测定方法
CN101797277A (zh) 金感胶囊的检测方法
CN108037234B (zh) 一种鸡骨草肝炎颗粒的质量检测方法
CN104833754B (zh) 一种附甘药物检测方法
CN114994220A (zh) 一种七清败毒颗粒的指纹图谱的构建方法和其成分含量的测定方法及应用
CN113514581B (zh) 清肺排毒颗粒的质控方法
CN101703656B (zh) 调经活血胶囊的质量检测方法
CN103675192A (zh) 一种复方苦木消炎胶囊的检测方法
CN104111295A (zh) 一种中药制剂的质量控制方法
CN110927274B (zh) 一种同时检测便通胶囊中六种成分含量的方法
CN101762640A (zh) 一种中药清火药物的检测方法
CN115343377A (zh) 一种清胃黄连片的指纹图谱及其构建方法及应用
CN113252826A (zh) 一种安眠补脑口服液的hplc指纹图谱检测方法
CN110907562A (zh) 和胃解毒胶囊的质量检测方法
CN115420827B (zh) 一种全面控制叶下珠质量的检测方法
CN102854283A (zh) 一种小金牛草的检测方法
CN111323518B (zh) 一种乌锦颗粒的uplc-pda联合qams的检测方法
CN112098567B (zh) 颠茄流浸膏和含有颠茄流浸膏的样品中阿托品的检测方法
CN113917001B (zh) 清肺排毒颗粒中黄芩有效成分的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination