CN114137129B - 一种采用hplc-pda方法检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法 - Google Patents
一种采用hplc-pda方法检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种采用HPLC‑PDA方法检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法，属于兽药有效成分检测领域。本发明采用反相高效液相色谱(UPLC‑PDA)分离技术，对公英青蓝合剂中15种有效成分进行检测；其中，(R，S)‑告依春来检测板蓝根和大青叶；新绿原酸、单咖啡酰酒石酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、菊苣酸和4,5‑二‑O‑咖啡酰奎宁酸来检测金银花和蒲公英；绿原酸和盐酸小檗碱、盐酸巴马汀来检测黄柏；黄芩苷和黄芩素来检测黄芩；甘草酸和甘草苷来检测甘草。本发明，方法简便快速、分离效果好，鉴别精度高，结果重现性好，易于观察，专属性强，色谱峰峰形良好，既达到中国兽药典的要求，还节省时间、试剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用HPLC-PDA方法检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法，属于兽药有效成分检测领域。
背景技术
公英青蓝合剂现收载于《兽药质量标准》2017年版中药卷p96-97，处方为：蒲公英200g，大青叶200g，板蓝根200g，金银花100g，黄芩100g，黄柏100g，甘草100g，藿香50g，石膏50g；以上9味，加水煎煮2次，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.09，加水至1000mL，加适量防腐剂，灌装，灭菌，即得，为棕褐色的液体；味苦。具有清热解毒的功效，辅助治疗鸡传染性法氏囊等病毒性疾病，广泛应用于集约化家禽养殖企业。
现行标准对黄芩(黄芩苷)、黄柏(盐酸小檗碱)分别进行了薄层鉴别，对绿原酸进行了含量测定。该方法存在很大的缺点：薄层鉴别展开剂共采用乙酸丁酯、丁酮、甲酸、苯、乙酸乙酯、甲醇、异丙醇、浓氨试液等多种溶剂，污染大、前处理繁琐，展开耗时长，结果不易判定。
另外标准中只对绿原酸进行了含量测定，对其他主要成分未测，流动相比例中乙腈占比小，大部分有效成分储积在柱子中，未及时冲出，柱子寿命大大缩短。
发明内容
本发明针对上述问题，提供了一种采用HPLC-PDA方法检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法，本次发明采用反相高效液相色谱(UPLC-PDA)分离技术，对公英青蓝合剂中的有效成分金银花、蒲公英、板蓝根、大青叶、黄芩、黄柏、甘草等开展一法多测研究，优化提取方法、色谱条件，尤其是需要优化检测波长和梯度洗脱程序，使尽可能多的目标峰分离出来，对含量较高的组分进行含量测定，实现定性或定量，方法更高效、快速、环保。本发明成功建立了一种采用HPLC-PDA检测公英青蓝合剂液中15种有效成分的方法：新绿原酸、表告依春、单咖啡酰酒石酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、甘草苷、异绿原酸B、菊苣酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、黄芩、甘草酸，共计15种。
其中，表告依春来检测板蓝根和大青叶；新绿原酸、单咖啡酰酒石酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、菊苣酸和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸来检测金银花和蒲公英；绿原酸和盐酸小檗碱、盐酸巴马汀来检测黄柏；黄芩苷和黄芩素来检测黄芩；甘草酸和甘草苷来检测甘草。
进一步的，本发明采用液相色谱仪，梯度洗脱的方式，PDA检测器，3D扫描范围190-450nm，2D检测波长选择217nm(甘草苷最大吸收波长)，240nm(表告依春最大吸收波长)，278nm(黄芩苷和黄芩素最大吸收波长)324nm(咖啡酸最大吸收波长)，327nm(绿原酸等系列化合物最大吸收波长)，251nm(甘草酸最大吸收波长)，330nm(单咖啡酰酒石酸、菊苣酸最大吸收波长)，346nm(盐酸小檗碱、盐酸巴马汀最大吸收波长)等。由于表告依春最大吸收波长240nm，在251nm、324nm、327nm、330nm等处几乎紫外吸收太小，最终采用240nm来采集，兼顾其他化合物的响应值。
进一步的，本发明同时鉴别公英青蓝合剂液中15种成分的方法，包括下述步骤：
第一步：供试品溶液的制备：取供试品至棕色容量瓶，加入溶剂，定容至25mL，振摇后超声提取，提取时间20-40min，过滤，作为供试品溶液；
优选的，所述供试品的取样量为1mL，所述溶剂选自10％甲醇、50％甲醇、20％乙醇、50％乙醇或者75％乙醇，优选为20％乙醇，提取时间30min；
第二步，对照品溶液的制备：各取表告依春、新绿原酸、单咖啡酰酒石酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、甘草苷、异绿原酸B、菊苣酸、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、黄芩素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和甘草酸对照品适量至容量瓶，分别加无水乙醇或甲醇或75％乙醇，制备对照品储备溶液；再取15种储备液适量体积混合，作为混合对照品储备溶液；
第三步：液相色谱法：
扫描波长：190-400nm；
检测波长：217nm，240nm，278nm，324nm，327nm，230nm，251nm，330nm，346nm等；优选的，检测波长为240nm；
色谱柱：安捷伦色谱柱zorbax SB C18 4.6*150mm，粒径3.5micro；
进样量为：1-10μL；优选的，所述进样量为5μL
柱温：30-40℃；
流动相A相：乙腈；
流动相B相：0.4％磷酸溶液；
流速：0.60mL/min；
运行时间：66min；
梯度洗脱程序：
0-18min，A相为8％，B相为92％；
18-20min，A相由8％升至20％，B相由92％降至80％；
20-48min，A相为20％，B相为80％；
48-50min，A相由20％升至40％，B相由80％降至60％；
50-58min，A相为40％，B相为60％；
58-59min，A相由40％降至8％，B相由60％升至92％；
59-66min，A相为8％，B相为92％。
优选的，使用仪器：waters e2695配二极管阵列检测器PDA；agilent infinity II配二极管阵列检测器DAD。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明通过一套液相色谱系统同时把15种目标化合物一次鉴别出来，方法简便快速、分离效果好，鉴别精度高，结果重现性好，易于观察，专属性强，色谱峰峰形良好，既达到中国兽药典的要求，还节省时间、试剂。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定
图1为16种混合对照品光谱图；1A图中自上而下依次为新绿原酸、表告依春、单咖啡酰酒石酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、甘草苷和异绿原酸B的光谱图；1B图中自上而下依次为3,5-二-0-咖啡酰奎宁酸(峰9)、菊苣酸、4,5-二-0-咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、黄芩素、甘草酸的光谱图；
图2为16种混合对照品液相色谱图，240nm；
图3为实施例1中采用本发明所述方法冀中公英青蓝合剂0510批次液相色谱图，240nm；
图4为实施例1中采用本发明所述方法冀中公英青蓝合剂0524批次液相色谱图，240nm；
图5为实施例1中采用本发明所述方法迅达康公英青蓝合剂601批次液相色谱图，240nm；
图6为实施例1中采用本发明所述方迅达康公英青蓝合剂701批次液相色谱图，240nm；
图7为实施例1中采用本发明所述方法迅达康公英青蓝合剂801批次液相色谱图，240nm；
图8为16种种混合对照品液相色谱图，251nm；
图9为16种种混合对照品液相色谱图，278nm；
图10为16种种混合对照品液相色谱图，327nm；
图11为16种种混合对照品液相色谱图，346nm；
图12为迅达康公英青蓝合剂601批次液相色谱图，251nm；
图13为迅达康公英青蓝合剂601批次液相色谱图，278nm；
图14为迅达康公英青蓝合剂601批次液相色谱图，327nm；
图15为迅达康公英青蓝合剂601批次液相色谱图，346nm；
图16为冀中公英青蓝合剂0510批次液相色谱图，251nm；
图17为冀中公英青蓝合剂0510批次液相色谱图，278nm；
图18为冀中公英青蓝合剂0510批次液相色谱图，327nm；
图19为冀中公英青蓝合剂0510批次液相色谱图，346nm；
图20为迅达康公英青蓝合剂701批次液相色谱图，240nm；
图21为迅达康公英青蓝合剂701批次液相色谱图，240nm；
图22为迅达康公英青蓝合剂801批次液相色谱图，240nm；
图23为迅达康公英青蓝合剂801批次液相色谱图，240nm。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中，供试品：为企业生产样品，为严格按照药典处方进行生产的样品；无水乙醇为分析纯，磷酸为优级纯，乙腈色谱纯，对照品购自中国食品药品检定研究院、中国药品生物制品检定所、成都曼斯特公司等单位。
实施例：一种同时鉴别公英青蓝合剂液中15种成分的方法。
包括下述步骤：
第一步：供试品溶液的制备：取供试品1mL至棕色容量瓶，加不同浓度的乙醇/甲醇溶液(见表1)，定容至25mL，振摇后超声提取，提取时间20-40min，过滤，作为供试品溶液；
表1不同的提取溶剂表
| 序号 | 溶剂 | 提取时间 | 备注 |
| 1 | 20％甲醇 | 40min | 见图23 |
| 2 | 50％甲醇 | 20min | 见图22 |
| 3 | 20％乙醇 | 30min | 见图1-图19。 |
| 4 | 50％乙醇 | 25min | 见图20 |
| 5 | 75％乙醇 | 20min | 见图21 |
5种溶剂对各种化合物均能提取出来，但提取率略有不同；为了减少溶剂效应和有机溶媒的使用量，减少有机废液对环境的污染，考虑到色谱响应值和减少干扰组分，最终优化使用20％乙醇作为提取溶剂。
第二步，对照品溶液的制备：另各取表告依春、新绿原酸、单咖啡酰酒石酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、甘草苷、异绿原酸B、菊苣酸、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、黄芩素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和甘草酸对照品适量至容量瓶，分别加无水乙醇或甲醇或75％乙醇，制备对照品储备溶液；再取16种储备液适量体积混合，作为混合对照品储备溶液；先是前7种化合物配置成7种混合溶液见表2-1，后9种化合物配置成9种混合溶液见表2-2，两者以3:1体积比混合成16种混合溶液，各种化合物具体浓度及优选溶剂见表2-3。
表2-1 7种对照品溶液配置浓度表
表2-2 9种对照品溶液配置浓度表
表2-3 16种对照品溶液配置浓度表
其混合对照品的光谱图和色谱图见图1A-图1B，根据保留时间和光谱图的峰形不同，来判断待测样品中的目标化合物。
3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸的出峰时间和公英青蓝合剂中防腐剂苯甲酸钠的保留时间重合，但对照品光谱图不一致，所以我们虽然配置了16种化合物的混合对照品溶液，但最终检测时删掉了3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸化合物，最终只测定了15种化合物。这也是我们使用二极管阵列检测器，查看光谱图来辅助鉴别的原因之一，可以有效的判定干扰，这是紫外检测器无法做到的。
第三步：液相色谱法：
使用仪器：waters e2695配二极管阵列检测器PDA；
agilent infinity II配二极管阵列检测器DAD；
扫描波长：190-400nm，检测波长217nm，240nm，278nm，324nm，327nm，230nm，251nm，330nm，346nm等；色谱柱:安捷伦色谱柱zorbax SB C184.6*150mm，粒径3.5micro。进样量1-10μL；柱温30-40℃；
流动相A相：乙腈；流动相B相：0.4％磷酸溶液；流速0.60mL/min；运行时间66分钟。
按表3中的规定进行梯度洗脱。
表3梯度洗脱条件表
所述第三步的检测波长是217nm，240nm，278nm、324nm，327nm，251nm，330nm，346nm等。我们最初选择327nm，新绿原酸、单咖啡酰酒石酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、菊苣酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、甘草苷等响应值非常高，但甘草酸和表告依春相应非常低，不利于检测，而且由于表告依春的含量比较低(见图10、图14、图18)；在251nm处，甘草酸响应值最高，但其他响应值稍低，尤其是表告依春较低(见图8、图13、图16)；在278nm处，黄芩苷和黄芩素的最大吸收波长，响应最高，但其他响应稍低，尤其是表告依春更低(见图9、图13、图16)；在346nm处，盐酸小檗碱，盐酸巴马汀响应值最高，(见图11、图15、图19)；最终我们选择表告依春的最大吸收波长240nm，作为最佳波长(见图2-图7，图20-图23)。而且16种化合物对照品响应值均较高，背景干扰小。结果判定：
方法1：根据色谱图，供试品色谱中(色谱图见图3-图19)，在与15种对照品色谱(见图2)相应的位置上，出现相同的色谱峰，且光谱图一致(见图1)，表明可检出相应目标化合物；并通过对照品和样品色谱峰面积的比值来计算并进行定量；结果见表4-10。
由结果可以看出，黄芩苷含量最高，其次是隐绿原酸、绿原酸、新绿原酸；单咖啡酰酒石酸，菊苣酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、甘草苷、甘草酸、盐酸小檗碱含量较少；表告依春、咖啡酸、黄芩素极少，盐酸巴马汀均未检出。不同企业的公英青蓝合剂由于受设备和提取经验的限制，以及所用中药原药材含量多少的局限，各种化合物其含量略有不同。
在实际生产和检验过程中，对如此多的品种化合物都进行定量是不现实的，但可以根据本发明专利的检测结果，针对含量较高的组分建立多种化合物特征图谱对公英青蓝合剂进行质量控制，在具体制定药典标准时，我们可以考虑对含量非常高的组分黄芩苷，隐绿原酸等进行定量检测。
方法2：在实践中，如果缺少对照品，也可以根据相对保留时间和光谱图(见图1)来确定化合物的特征图谱，我们分别针对黄芩苷和隐绿原酸当做参照峰，分别计算了每个化合物的相对保留时间，并对相对保留时间做了正负2％的限定值。见表4。
表4混合对照品色谱结果及相对保留时间的计算结果(进样体积5微升)：其中E为科学计数法。
应用黄芩苷或隐绿原酸作为参比峰的相对保留时间，并对上下限做出了要求，相对保留时间在正负2％范围内均能达到要求。见表5表5相对保留时间的限定范围表。
表6冀中0510批公英青蓝合剂结果(进样体积5微升)
表7冀中0524批公英青蓝合剂结果(进样体积5微升)
表8迅达康601批公英青蓝合剂结果(进样体积5微升)
表9迅达康701批公英青蓝合剂结果(进样体积5微升)
表10迅达康801批公英青蓝合剂结果(进样体积5微升)
Claims (5)
1.一种采用反相高效液相色谱-二极管阵列检测器检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法，其特征在于，所述方法采用反相高效液相色谱分离技术，公英青蓝合剂由蒲公英，大青叶，板蓝根，金银花，黄芩，黄柏，甘草，藿香和石膏组成；对公英青蓝合剂中15种有效成分新绿原酸、表告依春、单咖啡酰酒石酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、甘草苷、异绿原酸B、菊苣酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、黄芩素、甘草酸的检测；其中，表告依春来检测板蓝根和大青叶；新绿原酸、单咖啡酰酒石酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、菊苣酸和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸来检测金银花和蒲公英；绿原酸和盐酸小檗碱、盐酸巴马汀来检测黄柏；黄芩苷和黄芩素来检测黄芩；甘草酸和甘草苷来检测甘草；
所述方法包括下述步骤：
第一步：供试品溶液的制备：取供试品至棕色容量瓶，加入溶剂，定容至25mL，振摇后超声提取，提取时间20-40min，过滤，作为供试品溶液；所述溶剂为20％的乙醇；
第二步，对照品溶液的制备：各取表告依春、新绿原酸、单咖啡酰酒石酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、甘草苷、异绿原酸B、菊苣酸、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、黄芩素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和甘草酸对照品适量至容量瓶，分别加无水乙醇、甲醇或75％乙醇，制备对照品储备溶液；再取15种储备液适量体积混合，作为混合对照品储备溶液；
第三步：液相色谱法：
扫描波长：190-400nm；
检测波长：240nm；
色谱柱：安捷伦色谱柱zorbax SB C18 4.6*150mm，粒径3.5micro；
进样量为：1-10μL；
柱温：30-40度；
流动相A相：乙腈；
流动相B相：0.4％磷酸溶液；
流速：0.60mL/min；
运行时间：66min；
梯度洗脱程序：
0-18min，A相为8％，B相为92％；
18-20min，A相由8％升至20％，B相由92％降至80％；
20-48min，A相为20％，B相为80％；
48-50min，A相由20％升至40％，B相由80％降至60％；
50-58min，A相为40％，B相为60％；
58-59min，A相由40％降至8％，B相由60％升至92％；
59-66min，A相为8％，B相为92％。
2.根据权利要求1所述的采用反相高效液相色谱-二极管阵列检测器检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法，其特征在于，第一步中，提取时间为30min。
3.根据权利要求1所述的采用反相高效液相色谱-二极管阵列检测器检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法，其特征在于，第三步中，所述进样量为5μL。
4.根据权利要求1所述的采用反相高效液相色谱-二极管阵列检测器检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法，其特征在于，第三步中，柱温为35℃。
5.根据权利要求1所述的采用反相高效液相色谱-二极管阵列检测器检测公英青蓝合剂中15种有效成分的方法，其特征在于，第三步中，使用仪器：waters e2695配二极管阵列检测器PDA；agilent infinity II配二极管阵列检测器DAD。
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| 基于紫外指纹图谱的公英青蓝合剂质量研究;潘春晖 等;中国畜牧兽医;第44卷(第2期);578-585 * |
| 超高效液相色谱-串联质谱法检测公英 青蓝合剂中非法添加物金刚乙胺;魏秀丽 等;山东农业科学;第51卷(第3期);124-127 * |
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