CN117491529A - 一种诃子中没食子酸含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种诃子中没食子酸含量的测定方法,涉及中药成分测定技术领域。本发明的诃子中没食子酸含量的测定方法包括以下步骤:制备没食子酸对照品溶液;制备诃子样品溶液;分别将没食子酸对照品溶液和诃子样品溶液进行液相色谱检测。本发明用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以体积比为95:5的0.2%磷酸‑甲醇为流动相,采用等度洗脱色谱法分离诃子中没食子酸,30min内完成分离,没食子酸效果良好。本方法灵敏、简便,过程容易控制,重复性好,稳定性强,可为藏药原料诃子的质量评价以及标准制订提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及中药成分测定技术领域,特别是涉及一种诃子中没食子酸含量的测定方法。
背景技术
诃子为使君子科植物诃子或绒毛诃子的干燥成熟果实,诃子的主要成分为单宁、三萜类物质、小檗碱、酚酸类物质等,具有收敛、抗病原微生物、降低内毒素损伤及炎症反应、抗氧化以及提升肠道屏障功能等多方面功效。在《中国药典》2020版中诃子的质量标准中只有性状和薄层色谱鉴别,无含量检测项,不能有效判定产品的质量和稳定性,因此建立诃子没食子酸有效成分含量测定对评价诃子质量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种诃子中没食子酸含量的测定方法,以解决上述现有技术存在的问题。本发明采用HPLC法测定诃子中没食子酸的含量,可用于诃子的质量控制。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种诃子中没食子酸含量的测定方法,包括以下步骤:
制备没食子酸对照品溶液;制备诃子样品溶液;分别将没食子酸对照品溶液和诃子样品溶液进行液相色谱检测;
液相色谱检测的色谱条件:色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶,流动相为体积比95:5的0.2%磷酸-甲醇溶液,洗脱方式为等度洗脱。
作为本发明的进一步优选,所述制备没食子酸对照品溶液中,提取溶剂为甲醇,所述没食子酸对照品溶液的浓度为96μg/mL。
作为本发明的进一步优选,所述制备诃子样品溶液中,溶剂为甲醇,提取方式为超声提取,诃子样品与提取溶剂的质量体积比为1g:50mL。
作为本发明的进一步优选,所述制备没食子酸对照品溶液包括以下步骤:取没食子酸对照品,精密称定,置量瓶中,加甲醇溶解并定容至量瓶刻度,摇匀,即得没食子酸对照品母液;精密量取没食子酸对照品母液置量瓶中,用甲醇稀释至量瓶刻度,摇匀,即得没食子酸对照品溶液。
作为本发明的进一步优选,所述制备诃子样品溶液包括以下步骤:取诃子样品,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇,密塞,称定重量,在功率200W、频率53kHz的条件下超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得诃子样品溶液。
提取溶剂选择:选用甲醇作为溶剂,进行超声提取。
本发明参照中国药典余甘子项下没食子酸的含量测定方法与二十五味珊瑚胶囊标准项下没食子酸含量测定方法选择甲醇作为溶剂,甲醇作为实验室常用的有机溶剂,价格低廉,吸收波长适中。从提取时间和能源成本方面考虑,选择超声提取。
作为本发明的进一步优选,本发明还包括建立没食子酸标准曲线的步骤,所述建立没食子酸标准曲线的步骤具体为:精密吸取含没食子酸1.201212mg/mL的没食子酸对照品母液,分别精密吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL分别置于10mL的容量瓶中,加甲醇至容量瓶刻度,摇匀,按色谱条件进样测定,记录峰面积。以没食子酸浓度(μg/mL)为x轴,以峰面积为y轴,进行线性回归,得回归方程Y=30345.9X-12384.0,相关系数R=0.9999012。
作为本发明的进一步优选,本发明还包括确定诃子样品的没食子酸含量的步骤,所述确定诃子样品的没食子酸含量的步骤具体为:将诃子样品的峰面积代入没食子酸标准曲线,计算出诃子样品的没食子酸浓度,计算得到诃子样品的没食子酸含量。
作为本发明的进一步优选,所述液相色谱检测的色谱条件具体为:
色谱柱填充剂:十八烷基硅烷键合硅胶;
色谱柱:waters xbridgeC18、InertSustain C18和zafex supfexjx C18色谱柱中的一种;
流动相:体积比95:5的0.2%磷酸-甲醇溶液;
检测波长:271nm;
柱温:30℃;
流速:1.0mL/min;
洗脱方式:等度洗脱;
进样量:10μL。
更优选的,waters xbridgeC18色谱柱的规格为4.6mm×250mm,5μm;InertSustainC18色谱柱的规格为4.6mm×250mm,5μm;zafex supfexjx C18色谱柱的规格为250×4.6mm,5μm。
色谱条件中色谱柱的性能、流动相的选择、柱温、流速等都会影响分离效果。
作为本发明的进一步优选,所述诃子样品为诃子肉。
本发明公开了以下技术效果:
本发明用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以体积比95:5的0.2%磷酸-甲醇溶液为流动相,采用等度洗脱色谱法分离诃子中没食子酸,30min内完成分离,没食子酸出峰效果良好。本发明的测定方法灵敏、简便,过程容易控制,重复性好,稳定性强,可为藏药原料诃子的质量评价以及标准制订提供依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为没食子酸对照品紫外吸收波长图;
图2为没食子酸对照品溶液HPLC图;
图3为诃子样品溶液HPLC图;
图4为没食子酸标准曲线图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值,以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
本发明以下实施例所用的仪器与试剂:
液相色谱仪(四元泵,DAD检测,柱温箱,自动进样器,Labsolutions色谱数据工作站)、METTLER XP205(十万分之一)电子天平、METTLER XP504(万分之一)电子天平、数控超声波清洗器KQ-500DE;没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110831-201906,规格:20mg,含量:91.5%);甲醇为色谱纯(Fisher公司);磷酸为色谱纯;水为超纯水。
下面结合实施例对本发明技术方案进行进一步详细的说明。
实施例1
步骤1没食子酸对照品溶液和诃子样品溶液的制备
取没食子酸对照品32.82mg,精密称定,置25mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至量瓶刻度,摇匀,即得没食子酸对照品母液。精密量取没食子酸对照品母液0.8mL置10mL量瓶中,用甲醇稀释至量瓶刻度,摇匀,即得没食子酸对照品溶液(每1mL中含没食子酸96μg)。
取诃子样品0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50mL,密塞,称定重量,超声处理(功率200W,频率53kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得诃子样品溶液。
步骤2流动相的选择
色谱条件与系统适用性条件用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂;以体积比95:5的0.2%磷酸-甲醇溶液为流动相;检测波长271nm;柱温30℃;流速为1.0mL/min,等度洗脱色谱法分离诃子中没食子酸,30min内完成分离,没食子酸出峰效果良好,出峰时间适宜,峰性好,没有拖尾等现象,符合含量测定要求。
步骤3检测波长的选择
取没食子酸对照品溶液,进样10μL,用DAD检测器在210~400nm波长范围进行全波长扫描,没食子酸对照品紫外吸收波长图如图1所示。结果显示没食子酸在271nm处有最大吸收,故选择检测波长为271nm。
步骤4测定法
分别精密吸取没食子酸对照品溶液、诃子样品溶液各10μL,注入液相色谱仪,按以下色谱条件测定。
色谱条件:填充剂:十八烷基硅烷键合硅胶;色谱柱:zafex supfexjx C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:体积比95:5的0.2%磷酸-甲醇溶液;检测波长:271nm;柱温:30℃;流速:1.0mL/min;洗脱方式:等度洗脱。
没食子酸对照品溶液HPLC图如图2所示,诃子样品溶液HPLC溶液如图3所示。诃子样品溶液色谱中,在与没食子酸对照品色谱峰相应的位置上,有相同的色谱峰。以没食子酸峰计算理论板数大于3000。
定量分析方法学考察
1.建立没食子酸标准曲线
精密吸取没食子酸对照品母液(含没食子酸1.201212mg/mL),分别精密吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL分别置于10mL的容量瓶中,加甲醇至容量瓶刻度,摇匀,按步骤4测定法进样测定,记录峰面积。以没食子酸进样量(μg)为x轴,以峰面积为y轴,进行线性回归,得回归方程Y=30345.9X-12384.0,相关系数R=0.9999012。结果表明该成分在范围内线性关系良好。没食子酸标准曲线如图4所示。
2.精密度实验
取步骤1中的没食子酸对照品溶液10μL,连续进样6次,记录峰面积,并计算相对标准偏差(RSD)。没食子酸的峰面积的RSD为0.79%(n=6),表明仪器精密度良好。结果见表1。
表1精密度实验结果(峰面积)n=6
次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD% |
没食子酸 | 2991515 | 2963727 | 2953460 | 2945944 | 2926929 | 2932772 | 2952391 | 0.79 |
3.重复性实验
按照步骤1的方法平行制备6份诃子样品溶液,分别进样10μL并记录峰面积,计算含量,结果见表2。从表2可以看出各份诃子样品溶液的没食子酸测定结果,RSD(n=6)为1.58%,表明本发明的方法重复性好。
表2重复性实验结果(含量)n=6
4.稳定性实验
取6份诃子样品溶液在室温下放置0、2、4、6、8、12、24小时在步骤4的色谱条件下分析,测得没食子酸的峰面积的RSD(n=6)为0.70%,结果表明诃子样品溶液在24小时内稳定。稳定性实验结果见表3。
表3供试品溶液稳定性实验结果(峰面积)
5.加样回收率实验
取没食子酸对照品适量,加甲醇制成24.0242μg/mL的溶液,即加样回收实验没食子酸对照品溶液。
取已知没食子酸含量的诃子样品粉末6份,每份0.05g左右,精密称定,置于6个具塞锥形瓶中,分别加入加样回收实验没食子酸对照品溶液50mL,按照步骤1的方法制备没食子酸加样回收诃子样品溶液,按步骤4的色谱条件测定,计算回收率,结果见表4;平均回收率为105.92,RSD为3.2%,表明该方法加样回收试验结果良好。表明本法有良好的准确性。
回收率的计算方法为:回收率(%)=(测得没食子酸的量-样品中没食子酸的量)/加入没食子酸的量。
表4加样回收率试验结果(n=6)
6.耐用性考察
分别采用3种不同品牌的色谱柱对同一诃子样品溶液进行测定,实验结果见表5。三种色谱柱型号分别为waters xbridge C18、InertSustain C18、zafex supfexjx C18。没食子酸的平均含量为1.9%,其中waters xbridgeC18测定的没食子酸含量为2.0%,InertSustain C18和zafex supfexjx C18均为1.9%,RSD为2.9%。因此说明三种型号的色谱柱型号差别不大,都适用于诃子中没食子酸含量的测定。
表5耐用性实验结果
色谱柱的选择:试验过程中考察了waters xbridgeC18(4.6mm×250mm,5μm)和InertSustain C18(4.6mm×250mm,5μm)以及zafex supfexjx C18色谱柱,结果表明三种色谱柱出峰效果差别不大,因此选择三种色谱柱waters xbridgeC18、InertSustain C18和zafex supfexjx C18色谱柱。
本方法灵敏、简便,过程容易控制,重复性好,稳定性强,可为藏药原料诃子的质量评价以及标准制订提供依据。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种诃子中没食子酸含量的测定方法,其特征在于,包括以下步骤:
制备没食子酸对照品溶液;制备诃子样品溶液;分别将没食子酸对照品溶液和诃子样品溶液进行液相色谱检测;
液相色谱检测的色谱条件:色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶,流动相为体积比95:5的0.2%磷酸-甲醇溶液,洗脱方式为等度洗脱。
2.根据权利要求1所述的诃子中没食子酸含量的测定方法,其特征在于,所述制备没食子酸对照品溶液中,溶剂为甲醇,所述没食子酸对照品溶液的浓度为96μg/mL。
3.根据权利要求1所述的诃子中没食子酸含量的测定方法,其特征在于,所述制备诃子样品溶液中,提取溶剂为甲醇,提取方式为超声提取,诃子样品与提取溶剂的质量体积比为1g:50mL。
4.根据权利要求1所述的诃子中没食子酸含量的测定方法,其特征在于,所述制备没食子酸对照品溶液包括以下步骤:取没食子酸对照品,精密称定,置量瓶中,加甲醇溶解并定容至量瓶刻度,摇匀,即得没食子酸对照品母液;精密量取没食子酸对照品母液置量瓶中,用甲醇稀释至量瓶刻度,摇匀,即得没食子酸对照品溶液。
5.根据权利要求1所述的诃子中没食子酸含量的测定方法,其特征在于,所述制备诃子样品溶液包括以下步骤:取诃子样品,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇,密塞,称定重量,在功率200W、频率53kHz的条件下超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得诃子样品溶液。
6.根据权利要求1所述的诃子中没食子酸含量的测定方法,其特征在于,所述液相色谱检测的色谱条件具体为:
色谱柱填充剂:十八烷基硅烷键合硅胶;
色谱柱:waters xbridgeC18、InertSustain C18和zafex supfexjx C18色谱柱中的一种;
流动相:体积比95:5的0.2%磷酸-甲醇溶液;
检测波长:271nm;
柱温:30℃;
流速:1.0mL/min;
洗脱方式:等度洗脱;
进样量:10μL。
7.根据权利要求1所述的诃子中没食子酸含量的测定方法,其特征在于,所述测定方法还包括建立没食子酸标准曲线、确定诃子样品的没食子酸含量的步骤。
8.根据权利要求1所述的诃子中没食子酸含量的测定方法,其特征在于,所述诃子样品为诃子肉。
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