CN116818940B - 一种基于一测多评法的化浊解毒疏肝方中成分含量的检测方法 - Google Patents
一种基于一测多评法的化浊解毒疏肝方中成分含量的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及中成药的质量检测技术领域，具体涉及一种基于一测多评法的化浊解毒疏肝方中成分含量的检测方法。本发明采用一测多评法，以相对易得且化合物性质相对稳定的黄芩苷为内参物，通过限定高效液相色谱的检测条件，得到化浊解毒疏肝方中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素三种成份含量，能够实现对化浊解毒疏肝方的质量进行定性定量分析。另外，本发明提供的检测方法简单易操作，且测定结果准确，方法重复性好、稳定性好、耐用性好，为建立化浊解毒疏肝方的质量评价提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及中成药的质量检测技术领域，具体涉及一种基于一测多评法的化浊解毒疏肝方中成分含量的检测方法。
背景技术
化浊解毒疏肝方由黄芩、柴胡、绞股蓝、石菖蒲、罗勒、荷梗等九种中药材按照生产工艺制成的中药方剂，临床上常用于治疗浊毒内蕴证的轻中度精神抑郁。化浊解毒疏肝方涉及九种中药，成分较复杂。目前，出于对化浊解毒疏肝方的质量评价仅仅限于对化浊解毒疏肝方中的单一成分进行检测，然而，单一成分的定量测定难以作为整体质量的评价标准。
一测多评法(quantitative analysis ofmulticomponents by single marker，QAMS)指利用中药有效成分内在的函数关系和比例关系，只测定其中的一个成分，来实现多个成分的同步测定，是适合中药特点的多指标质量评价模式。在对照品不足的情况下，利用相对校正因子(relative correction factor，RCF)对药材进行质量控制是方便、快速、廉价的，其方法将会是中药多组分同步定量的发展方向。目前，还没有用一测多评法同时测定化浊解毒疏肝方中有效成分的含量的报道。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于一测多评法的化浊解毒疏肝方中成分含量的检测方法。本发明所述的检测方法能够准确检测化浊解毒疏肝方中的黄芩苷、黄芩素和汉黄芩。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种化浊解毒疏肝方中成分的检测方法，包括以下步骤：
采用黄芩苷为内参物，分别建立黄芩素相对黄芩苷的相对矫正因子、汉黄芩素相对黄芩苷的相对校正因子；
将化浊解毒疏肝方利用甲醇水溶液进行提取，得到待测液；
对所述待测液进行高效液相色谱检测，分别得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积；
根据黄芩苷的峰面积和预定的标准曲线，得到黄芩苷的含量；所述预定的标准曲线为黄芩苷的峰面积和黄芩苷的质量浓度的线性关系；
根据黄芩素的峰面积、黄芩苷的含量和黄芩素的相对校正因子，得到化浊解毒疏肝方中黄芩素的含量；
根据汉黄芩素的峰面积、黄芩苷的含量和汉黄芩素的相对校正因子，得到化浊解毒疏肝方中汉黄芩素的含量；
所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系包括流动相A和流动相B；所述流动相A为乙腈；所述流动相B为甲酸水溶液；色谱柱为C18柱；所述流动相体系的流速为1mL/min；检测波长为280nm；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序为：
0～7min：所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到15％；
7～15min：所述流动相A的体积百分含量由15％匀速增加到20％；
15～30min：所述流动相A的体积百分含量由20％匀速增加到35％；
30～50min：所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到50％；
75～85min：所述流动相A的体积百分含量由50％匀速增加到70％。
优选地，所述相对校正因子的建立，包括以下步骤：
将黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的系列浓度的混合标准溶液进行高效液相色谱检测，分别得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积；
由式I计算得到黄芩素相对黄芩苷的相对矫正因子、汉黄芩素相对黄芩苷的相对校正因子；
RCFR/S＝(AS×AR)/(ρR×ρS) 式I；
所述式I中，A表示峰面积；ρ表示质量浓度；R表示黄芩素或汉黄芩素；
s表示黄芩苷。
优选地，其特征在于，所述甲酸水溶液的质量浓度为0.1％。
优选地，所述甲醇水溶液的质量浓度为75％。
优选地，所述高效液相色谱检测的进样量为10μL；柱温为28～31℃。
优选地，所述提取为超声提取。
优选地，所述超声的条件包括：功率为80～600w，频率为20kHz～1MHz，温度为40～60℃，时间为24～40min。
优选地，所述混合标准溶液的配制，包括以下步骤：
将黄芩苷标准品、黄芩素标准品和汉黄芩素标准品，用甲醇稀释，分别得到黄芩苷储备液、黄芩素储备液和汉黄芩素储备液；
分别将系列体积的黄芩苷储备液、黄芩素储备液和汉黄芩素储备液混合，得到系列浓度的混合标准溶液。
本发明提供一种化浊解毒疏肝方中成分的检测方法，包括以下步骤：采用黄芩苷为内参物，分别建立黄芩素相对黄芩苷的相对矫正因子、汉黄芩素相对黄芩苷的相对校正因子；将化浊解毒疏肝方利用甲醇水溶液进行提取，得到待测液；对所述待测液进行高效液相色谱检测，分别得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积；根据黄芩苷的峰面积和预定的标准曲线，得到黄芩苷的含量；所述预定的标准曲线为黄芩苷的峰面积和黄芩苷的质量浓度的线性关系；根据黄芩素的峰面积、黄芩苷的含量和黄芩素的相对校正因子，得到化浊解毒疏肝方中黄芩素的含量；根据汉黄芩素的峰面积、黄芩苷的含量和汉黄芩素的相对校正因子，得到化浊解毒疏肝方中汉黄芩素的含量；所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系包括流动相A和流动相B；所述流动相A为乙腈；所述流动相B为甲酸水溶液；色谱柱为C18柱；所述流动相体系的流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0～7min：所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到15％；7～15min：所述流动相A的体积百分含量由15％匀速增加到20％；15～30min：所述流动相A的体积百分含量由20％匀速增加到35％；30～50min：所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到50％；75～85min：所述流动相A的体积百分含量由50％匀速增加到70％。本发明采用一测多评法，以相对易得且化合物性质相对稳定的黄芩苷为内参物，通过限定高效液相色谱的检测条件，得到化浊解毒疏肝方中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素三种成份含量，能够实现对化浊解毒疏肝方的质量进行定性定量分析。另外，本发明提供的检测方法简单易操作，且测定结果准确，方法重复性好、稳定性好、耐用性好，为建立化浊解毒疏肝方的质量评价提供依据。
附图说明
图1为混合标准溶液6#的高效液相色谱图；
图2为实施例2中化浊解毒疏肝方样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于一测多评法的化浊解毒疏肝方中成分含量的检测方法，包括以下步骤：
采用黄芩苷为内参物，分别建立黄芩素相对黄芩苷的相对矫正因子、汉黄芩素相对黄芩苷的相对校正因子；
将化浊解毒疏肝方利用甲醇水溶液进行提取，得到待测液；
对所述待测液进行高效液相色谱检测，分别得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积；
根据黄芩苷的峰面积和预定的标准曲线，得到黄芩苷的含量；所述预定的标准曲线为黄芩苷的峰面积和黄芩苷的质量浓度的线性关系；
根据黄芩素的峰面积、黄芩苷的含量和黄芩素的相对校正因子，得到化浊解毒疏肝方中黄芩素的含量；
根据汉黄芩素的峰面积、黄芩苷的含量和汉黄芩素的相对校正因子，得到化浊解毒疏肝方中汉黄芩素的含量；
所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系包括流动相A和流动相B；所述流动相A为乙腈；所述流动相B为甲酸水溶液；色谱柱为C18柱；所述流动相体系的流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序为：
0～7min：所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到15％；
7～15min：所述流动相A的体积百分含量由15％匀速增加到20％；
15～30min：所述流动相A的体积百分含量由20％匀速增加到35％；
30～50min：所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到50％；
75～85min：所述流动相A的体积百分含量由50％匀速增加到70％。
在本发明中，若没有特殊说明，所采用的试剂均为本领域技术人员所熟知的市售商品。
本发明采用黄芩苷为内参物，分别建立黄芩素相对黄芩苷的相对矫正因子、汉黄芩素相对黄芩苷的相对校正因子。
在本发明中，所述相对校正因子的建立，包括以下步骤：
将黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的系列浓度的混合标准溶液进行高效液相色谱检测，分别得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积；
由式I计算得到黄芩素相对黄芩苷的相对矫正因子、汉黄芩素相对黄芩苷的相对校正因子；
RCFR/S＝(AS×AR)/(ρR×ρS) 式I；
所述式I中，A表示峰面积；ρ表示质量浓度；R表示黄芩素或汉黄芩素；
s表示黄芩苷。
在本发明中，所述混合标准溶液的配制，优选包括以下步骤：
将黄芩苷标准品、黄芩素标准品和汉黄芩素标准品，用甲醇稀释，分别得到黄芩苷储备液、黄芩素储备液和汉黄芩素储备液；
分别将系列体积的黄芩苷储备液、黄芩素储备液和汉黄芩素储备液混合，得到系列浓度的混合标准溶液。
在本发明实施例中，所述黄芩苷储备液、黄芩素储备液和汉黄芩素储备液的溶剂优选为甲醇。在本发明实施例中，所述黄芩苷储备液的浓度具体优选为4.928g·L-1；所述黄芩素储备液的浓度具体优选为0.6920g·L-1；所述汉黄芩素储备液的浓度具体优选为0.2460g·L-1。
在本发明实施例中，所述混合标准溶液配制时，所取的黄芩苷储备液、黄芩素储备液和汉黄芩素储备液的系列体积优选为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和4.0mL。
在本发明中，所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系包括流动相A和流动相B；所述流动相A为乙腈；所述乙腈的纯度优选为色谱纯；所述流动相B为甲酸水溶液；所述甲酸水溶液的质量浓度优选为0.1％；所述甲酸水溶液中的水优选为超纯水；所述流动相体系的流速为1.0mL/min；色谱柱为C18柱，实施例中具体优选为所述C18柱优选为AgilentZorbax SB C18柱(250mm×4.6mm，5μm)、Kinetex C18柱或Diamonsil C18柱；所述高效液相色谱检测的柱温优选为28～31℃，更优选为30℃；进样量优选为10μL；所述高效液相色谱的检测器优选为紫外检测器；检测波长为280nm。洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：
0～7min：所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到15％；
7～15min：所述流动相A的体积百分含量由15％匀速增加到20％；
15～30min：所述流动相A的体积百分含量由20％匀速增加到35％；
30～50min：所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到50％；
75～85min：所述流动相A的体积百分含量由50％匀速增加到70％。
本发明将化浊解毒疏肝方利用甲醇水溶液进行提取，得到所述待测液。
在本发明中，所述甲醇水溶液的质量浓度优选为75％。在本发明中，所述化浊解毒疏肝方的粒径优选为100～300目，更优选为200目。在本发明中，所述化浊解毒疏肝方的质量和甲醇水溶液的体积比优选为1g：8～15mL，更优选为1g：12mL。在本发明中，所述甲醇水溶液中的水优选为超纯水。1mg∶0.01～0.015mL，更优选为1mg∶0.012mL。
在本发明中，所述提取的方式优选为超声，在本发明中，所述超声的条件包括：功率优选为80～600w，更优选为400W。频率优选为20kHz～1MHz，更优选为40Hz，温度优选为40～60℃，更优选为60℃；时间优选为24～40min，更优选为30min。在本发明中，提取前后，优选对待提取体系进行称量，提取前后的质量差优选用质量分数为75％的甲醇水溶液补足。得到待测液后，本发明对所述待测液进行高效液相色谱检测，分别得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积；根据黄芩苷的峰面积和预定的标准曲线，得到黄芩苷的含量；所述预定的标准曲线为黄芩苷的峰面积和黄芩苷的质量浓度的线性关系。
在本发明中，高效液相色谱检测条件优选同前文所述，不再赘述。
在本发明中，所述预定的标准曲线的获取，优选包括以下步骤：
将系列浓度的混合标准溶液进行高效液相色谱检测，得到黄芩苷的峰面积；
对黄芩苷的峰面积和黄芩苷的质量浓度进行线性拟合，得到所述预定的标准曲线。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的实施例和对比例中，所用仪器、试剂和检测条件如下所示：
Agilent 1260高效高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；UltiMate 3000高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)；AL204电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)，Agilent Zorbax SB C18液相色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，美国Agilent公司)，KQ-250E超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；
检测条件：色谱柱为：Agilent Zor-bax SB C18柱(250mm×4.6mm，5μm)或KinetexC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，美国Phenomenex公司)或Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，北京迪科马科技有限公司)；柱温为30℃；进样量为10μL；流动相A为乙腈；流动相B为质量浓度为0.1％的甲醇水溶液；流动相体系的流速为1.0mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；梯度洗脱程度为：0～7min：所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到15％；7～15min：所述流动相A的体积百分含量由15％匀速增加到20％；15～30min：所述流动相A的体积百分含量由20％匀速增加到35％；30～50min：所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到50％；75～85min：所述流动相A的体积百分含量由50％匀速增加到70％；检测器为紫外检测器；检测波长为280nm。
试剂：黄芩苷标准品(批号110715-201821，中国食品药品检定研究院，含量质量分数95.4％)；黄芩素标准品(批号111595-201808，中国食品药品检定研究院，含量质量分数97.9％)、汉黄芩素标准品(批号18062942，上海同田生物技术股份有限公司，含量质量分数98.8％)；化浊解毒疏肝方(黄芩(批号：162321201)、柴胡(批号：162140901)、石菖蒲(批号：160530801)、荷梗(批号：163151501)、绞股蓝(批号：164791201)、罗勒(批号：161354201)，河北博康药业有限公司)。乙腈、甲酸均为色谱纯，水为超纯水。
实施例1
一、相对校正因子的计算
1、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的混合标准溶液的配制
黄芩苷储备液：精密称取黄芩苷标准品，加甲醇溶解、稀释，得到浓度为4.928g·L-1的黄芩苷储备液。
黄芩素储备液：精密称取黄芩素标准品，加甲醇溶解、稀释，得到浓度为0.6920g·L-1的黄芩素储备液。
汉黄芩素储备液：精密称取汉黄芩素标准品，加甲醇溶解、稀释，得到浓度为0.2460g·L-1的汉黄芩素储备液。
2、混合标准溶液的配制
分别吸取黄芩素储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0mL，汉黄芩素储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0mL及黄芩苷储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0mL，置20mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别得到混合标准溶液1#～6#，备用。
3、相对校正因子
分别精密吸取混合标准溶液1#～6#10μL，进行高效液相色谱检测，其中高效液相色谱检测的条件为：Agilent 1260高效高效液相色谱仪；流动相A为乙腈；所述流动相B为质量分数为0.1％甲酸水溶液；色谱柱为Agilent Zor-bax SB C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；所述流动相体系的流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0～7min：所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到15％；7～15min：所述流动相A的体积百分含量由15％匀速增加到20％；15～30min：所述流动相A的体积百分含量由20％匀速增加到35％；30～50min：所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到50％；75～85min：所述流动相A的体积百分含量由50％匀速增加到70％。图1为混合标准溶液6#的高效液相色谱图，从图1可知，各组分分离度良好，图中5表示黄芩苷；6表示黄芩素；7表示汉黄芩素。
根据检测得到的黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的峰面积，按照式I RCFR/S＝(AS×AR)/(ρR×ρS)计算，分别得到黄芩素和汉黄芩素的相对校正因子，见表1。
表1黄芩素和汉黄芩素的相对校正因子
4、待测组分的色谱峰定位
取混合标准溶液6#按照“3、相对校正因子”中高效液相色谱的检测方法进行测定，得到混合标准溶液中的黄岑苷、黄岑素和汉黄岑素的色谱图，进而得到黄岑苷、黄岑素和汉黄岑素的保留时间。混合标准溶液6测试后的保留时间见表2。
表2黄岑苷、黄岑素和汉黄岑素的保留时间
| 混合标准溶液 | 黄芩苷的保留时间 | 黄芩素的保留时间 | 汉黄芩素的保留时间 |
| 混合标准溶液6# | 1.125 | 1.149 | 1.218 |
二、供试品溶液
精密称定1g化浊解毒疏肝方粉末，置于具塞锥形瓶中，加入75％甲醇溶液，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，并用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即获得供试品溶液。
三、验证实验
1)线性范围考察
分别精密实施例1中“2混合标准溶液的配置”得到的混合对照品溶液10μL，按照“3、相对校正因子”中高效液相色谱的检测方法进行测定，分别得到黄岑苷、黄岑素和汉黄岑素的峰面积，以峰面积(A)对质量浓度(ρ，mg·L-1)进行回归计算绘制标准曲线，其中黄岑苷的标准曲线为A＝5.768*105ρ+1192；质量浓度范围为24.64～985.6mg·L-1，r为0.9997；黄岑素的标准曲线为A＝7.830*105ρ+787.2；质量浓度范围为3.460～138.4mg·L-1，r为0.9994；汉黄岑素的标准曲线为A＝3.262*105ρ-132.1；质量浓度范围为1.230～49.20mg·L-1，r为0.9993；结果表明3种成份在相应范围内与峰面积线性关系良好。
2)精密度试验
精密吸取同一混合标准溶液6#连续进样6次，按照“3、相对校正因子”中高效液相色谱的检测方法进行测定，得到黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的峰面积，计算RSD，结果黄岑苷、黄岑素和汉黄岑素的峰面积的RSD分别为0.45％、0.76％、1.1％。表明仪器精密度良好。
3)稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h，按照“3、相对校正因子”中高效液相色谱的检测方法进行测定，并记录峰面积，结果表明黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.56％、0.77％、1.2％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
4)重复性试验
分别取同一批化浊解毒疏肝方粉末1g，共6份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入75％甲醇溶液，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，并用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即待测液，将所得6份待测液按照“3、相对校正因子”中高效液相色谱的条件进行检测，测得黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素平均含量分别为0.267、0.288、9.121mg/g，RSD分别为0.79％、1.3％、1.7％。结果表明该方法重复性良好。
5)回收率试验
加标供试品溶液：
取已知黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量的化浊解毒疏肝方1g，精密称定，分别加入一定量的黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素标准品，置于具塞锥形瓶中，加入75％甲醇水溶液，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，并用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得到加标供试品溶液。
将加标供试品溶液按照“3、相对校正因子”中高效液相色谱检测的条件进行检测，得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积。
将黄芩苷的峰面积代入黄芩苷的标准曲线中，得到黄芩苷的含量；
将黄芩苷的含量、黄芩素的峰面积代入黄芩素的相对校正因子，得到黄芩素的含量；
将黄芩苷的含量、汉黄芩素的峰面积代入汉黄芩素的相对校正因子，得到汉黄芩素的含量。
根据所得黄芩苷的含量、黄芩素的含量和汉黄芩素的含量，得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的加标回收率分别为100.1％、98.90％、97.96％，RSD分别为0.62％、0.81％、1.3％，表明方法的准确度良好。
实施例2
取3批化浊解毒疏肝方样品，按照“实施例1二、供试品的配制”，得到待测液；
将待测液按照“3、相对校正因子”中高效液相色谱的检测条件进行检测，色谱图见图2，根据图2得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积；将黄芩苷的含量、黄芩素的峰面积代入黄芩素的相对校正因子，得到黄芩素的含量；将黄芩苷的含量、汉黄芩素的峰面积代入汉黄芩素的相对校正因子，得到汉黄芩素的含量。
对比例1
取与“实施例2”得到的待测液，将待测液按照“3、相对校正因子”中高效液相色谱的检测条件进行检测，得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积；将黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积分别代入黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的标准曲线，得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量。
实施例2和对比例1的黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量见表3。
表3黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量
注：相对误差(RE％)＝(实施例2测试得到的待测物含量－对比例1测试得到的待测物含量)/对比例1测试得到的待测物含量。
从表3可知：相对误差绝对值均小于5％，证明本发明提供的检测方法具有较好的准确性与可行性。
实施例3
对混合标准溶液6进行检测，检测方法与“3、相对校正因子”的测试方法的区别仅仅在于：色谱柱替换为：Kinetex C18柱。
实施例4
对混合标准溶液6进行检测，检测方法与“3、相对校正因子”的测试方法的区别仅仅在于：色谱柱替换为：Diamonsil C18。
实施例5
对混合标准溶液6进行检测，检测方法与“3、相对校正因子”的测试方法的区别仅仅在于：色谱柱替换为：Kinetex C18柱，高效液相色谱仪替换为：UltiMate 3000。
实施例6
对混合标准溶液6进行检测，检测方法与“3、相对校正因子”的测试方法的区别仅仅在于：色谱柱替换为：Diamonsil C18柱，高效液相色谱仪替换为：UltiMate 3000。
实施例7
对混合标准溶液6进行检测，检测方法与“3、相对校正因子”的测试方法的区别仅仅在于：高效液相色谱仪替换为：UltiMate 3000。
实施例3～7测试得到的相对校正因子和待测物的保留时间见表4。
表4实施例3～7测试得到的相对校正因子和待测物的保留时间
从表4可知：不同仪器和色谱柱对黄芩素和汉黄芩素的相对校正因子以及保留时间的影响较小，且各成份的相对保留时间波动较小，故可以采用相对保留时间对色谱峰进行定位。
实施例8
对混合标准溶液6进行检测，检测方法与“3、相对校正因子”的测试方法的区别仅仅在于：柱温替换为：28℃。
实施例9
对混合标准溶液6进行检测，检测方法与“3、相对校正因子”的测试方法的区别仅仅在于：柱温替换为：29℃。
实施例10
对混合标准溶液6进行检测，检测方法与“3、相对校正因子”的测试方法的区别仅仅在于：柱温替换为：31℃。
实施例11
对混合标准溶液6进行检测，检测方法与“3、相对校正因子”的测试方法的区别仅仅在于：柱温替换为：32℃。
实施例8～11测试得到的相对校正因子见表5。
表5实施例8～11测试得到的相对校正因子
| 实施例 | 黄芩素的相对校正因子 | 汉黄芩素的相对校正因子 |
| 实施例8 | 0.7256 | 1.740 |
| 实施例9 | 0.7301 | 1.753 |
| 实施例10 | 0.7398 | 1.771 |
| 实施例11 | 0.7434 | 1.788 |
从表5可知：不同温度(28～31℃)对黄芩素和汉黄芩素的相对校正因子的影响较小，结果表明各成份之间相对校正因子重复性良好，无显著性差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种基于一测多评法的化浊解毒疏肝方中成分含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用黄芩苷为内参物，分别建立黄芩素相对黄芩苷的相对矫正因子、汉黄芩素相对黄芩苷的相对校正因子；
将化浊解毒疏肝方利用甲醇水溶液进行提取，得到待测液；
对所述待测液进行高效液相色谱检测，分别得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积；
根据黄芩苷的峰面积和预定的标准曲线，得到黄芩苷的含量；所述预定的标准曲线为黄芩苷的峰面积和黄芩苷的质量浓度的线性关系；
根据黄芩素的峰面积、黄芩苷的含量和黄芩素的相对校正因子，得到化浊解毒疏肝方中黄芩素的含量；
根据汉黄芩素的峰面积、黄芩苷的含量和汉黄芩素的相对校正因子，得到化浊解毒疏肝方中汉黄芩素的含量；
所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相体系包括流动相A和流动相B；所述流动相A为乙腈；所述流动相B为甲酸水溶液；色谱柱为C18柱；所述流动相体系的流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序为：
0～7min：所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到15％；
7～15min：所述流动相A的体积百分含量由15％匀速增加到20％；
15～30min：所述流动相A的体积百分含量由20％匀速增加到35％；
30～50min：所述流动相A的体积百分含量由40％匀速增加到50％；
75～85min：所述流动相A的体积百分含量由50％匀速增加到70％；
所述甲酸水溶液的质量浓度为0.1％；
所述甲醇水溶液的质量浓度为75％。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述相对校正因子的建立，包括以下步骤：
将黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的系列浓度的混合标准溶液进行高效液相色谱检测，分别得到黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积；
由式I计算得到黄芩素相对黄芩苷的相对矫正因子、汉黄芩素相对黄芩苷的相对校正因子；
RCFR/S＝(AS×AR)/(ρR×ρS)式I；
所述式I中，A表示峰面积；ρ表示质量浓度；R表示黄芩素或汉黄芩素；
s表示黄芩苷。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的进样量为10μL；柱温为28～31℃。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述提取为超声提取。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述超声提取的条件包括：功率为80～600w，频率为20kHz～1MHz，温度为40～60℃，时间为24～40min。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述混合标准溶液的配制，包括以下步骤：
将黄芩苷标准品、黄芩素标准品和汉黄芩素标准品，用甲醇稀释，分别得到黄芩苷储备液、黄芩素储备液和汉黄芩素储备液；
分别将系列体积的黄芩苷储备液、黄芩素储备液和汉黄芩素储备液混合，得到系列浓度的混合标准溶液。
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