CN111879887A - 黄芪药材及其制剂中成分的检测方法和应用 - Google Patents

黄芪药材及其制剂中成分的检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及成分检测技术领域，尤其是涉及一种黄芪药材及其制剂中成分的检测方法和应用。黄芪药材及其制剂中成分的检测方法，包括：采用高效液相色谱电雾式检测器法对黄芪药材或其制剂供试品溶液进行检测；采用外标法或一测多评法对所述供试品溶液中的黄酮类成分和/或皂苷类成分的含量进行测算；检测条件包括：采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；流动相A为含0vol.％～0.1vol.％甲酸的乙腈，流动相B为含0vol.％～0.1vol.％甲酸的水。本发明可同时检测黄酮类和皂苷类成分，提高了成分检测的灵敏度，缩短了检测时间，且该方法简便易行，专属性强，耐用性好。

Description

黄芪药材及其制剂中成分的检测方法和应用
技术领域
本发明涉及成分检测技术领域，尤其是涉及一种黄芪药材及其制剂中成分的检测方法和应用。
背景技术
黄芪是一种多功效药材，具有多种化学成分。其中，黄芪中的黄酮类和皂苷类成分与其生理活性作用密切相关，因而，对于上述成分的检测具有重要意义。
2015版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)中以黄酮类成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷和皂苷类成分黄芪甲苷作为黄芪药材及饮片质控指标，两者分别采用HPLC-UV和HPLC-ELSD作为其含量测定方法。文献报道的黄芪中皂苷的含量测定方法多为HPLC-ELSD和HPLC-MS。文献报道的黄芪多成分含量测定方法多以外标法进行，如专利报道HPLC-CAD测定含有黄芪的中药制剂中的多种皂苷成分的含量。
《中国药典》中检测方法相对繁琐，而且黄芪甲苷样品制备方法较为复杂，致使检测时间较长，增加了检测人员的工作量。文献报道中使用的HPLC-ELSD检测方法，其灵敏度较低；HPLC-MS方法虽然具有较高灵敏度，但因其造价较高，难以广泛应用。HPLC-CAD测定方法需要多种对照品来进行含量测定。因中药中的对照品不稳定、难以分离、价格昂贵等原因造成了多指标质量控制中对照品匮乏的问题，在品种和数量上均难以满足中药质量控制等方面的需求，限制了外标法对中药多成分的定量和多指标的质量控制的应用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供黄芪药材及其制剂中成分的检测方法，以解决现有技术中存在的检测方法复杂、稳定性差等技术问题。
本发明的第二目的在于提供黄芪药材及其制剂中成分的检测方法在黄芪药材及其制剂质量控制中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
黄芪药材及其制剂成分的检测方法，包括如下步骤：
采用高效液相色谱电雾式检测器法对黄芪药材或其制剂供试品溶液进行检测；
采用外标法或一测多评法对所述供试品溶液中的黄酮类成分和/或皂苷类成分的含量进行测算；
其中，所述高效液相色谱电雾式检测器法的检测条件包括：
采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述流动相A为含0vol.％～0.1vol.％甲酸的乙腈，所述流动相B为含0vol.％～0.1vol.％甲酸的水。
在本发明的具体实施方式中，所述梯度洗脱的过程包括：0～3min内，流动相A的体积分数为20％；3～8min内，流动相A的体积分数由20％变至25％～28％；8～18min内，流动相A的体积分数由25％～28％变至36％；18～38min内，流动相A的体积分数由36％变至43％～60％。
其中，流动相A为含0vol.％～0.1vol.％甲酸的乙腈，是指流动相A可以为乙腈，也可以为含一定量的甲酸的乙腈；流动相B为含0vol.％～0.1vol.％甲酸的水，是指流动相B可以为水，也可以为含一定量的甲酸的水。
在本发明的上述梯度洗脱条件下，能够进一步保证各待测成分之间分离度良好，且基线平稳。
在本发明的具体实施方式中，黄芪药材及其制剂中的待测成分中的所述黄酮类成分包括但不限于毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷中的任一种或多种；所述皂苷类成分包括但不限于黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ和黄芪甲苷中的任一种或多种。
在实际操作中，利用外标法计算供试品溶液中待测成分的含量。具体的，含量cx＝cr×Ax/Ar其中：cx为供试品中待测成分浓度；cr为对照品浓度；Ax为供试品中待测成分峰面积；Ar为对照品峰面积。
在本发明的具体实施方式中，所述制剂包括芪蛭通络胶囊等。
采用本发明的检测方法对黄芪制剂如芪蛭通络胶囊进行检测时，能够准确分析其中黄酮类成分和皂苷类成分的含量。
在本发明的具体实施方式中，当采用一测多评法进行测算时，还包括：采用所述高效液相色谱电雾式检测器法对含内参物对照品溶液进行检测；根据检测结果计算所述供试品溶液中内参物的含量；根据相对校正因子计算所述供试品溶液中黄酮类成分和/或皂苷类成分的含量。
本发明基于一测多评法采用HPLC-CAD对黄芪药材中的黄酮类和皂苷类成分进行测定，方法简便、灵敏、具有良好的重复性与准确度。建立皂苷类与黄酮类成分的相对校正因子，实现了利用内参如皂苷类成分同时进行黄酮类和皂苷类成分的含量测定，适用于黄芪中一种或多种黄酮类成分和皂苷类成分的含量测定。
与现有技术相比，采用HPLC-CAD检测器同时检测黄酮类和皂苷类成分，提高了成分检测的灵敏度，缩短了检测时间，且该方法简便易行，专属性强，耐用性好。
本发明采用同一内参物同时测定紫外吸收不相近的两类化学成分的定量分析方法，突破了以往一测多评研究仅用于同类化学成分或用于紫外吸收相近的不同类化学成分的定量分析的局限。本发明为中药多组分质量分析提供了可行方法，有效提高了中药质控水平，降低了质控成本。
在本发明的优选实施方式中，所述梯度洗脱的过程包括：0～3min内，流动相A的体积分数为20％；3～8min内，流动相A的体积分数由20％变至25％；8～18min内，流动相A的体积分数由25％变至36％；18～38min内，流动相A的体积分数由36％变至43％。
通过采用上述梯度洗脱条件，能够保证各目标化合物分离度高，且色谱峰基线平稳。
在本发明的具体实施方式中，所述检测条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
柱温：25～40℃；
流速：0.8～1.2mL/min；
进样量：5～20μL；
漂移管温度：30～60℃；
气体流速：30～80psi/min。
在本发明的优选实施方式中，所述检测条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：20μL；
漂移管温度：50℃；
气体流速：50psi/min。
在本发明的具体实施方式中，所述色谱柱的规格为150mm×4.6mm，3.5μm。如型号可以为Agilent SB-C18色谱柱。
在本发明的优选实施方式中，所述内参物包括黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷中的任一种。优选的，所述内参物为黄芪皂苷Ⅱ。
以单一成分如黄芪皂苷Ⅱ为内参物，同时检测黄芪中其他5种黄酮和皂苷的含量，避免同一药物重复繁琐的操作，克服对照品紧缺和检测成本高的困难，实现黄芪中黄酮类和皂苷类成分多指标的一测多评。
在本发明的具体实施方式中，所述相对校正因子的计算方法可以包括：
采用所述高效液相色谱电雾式检测器法对黄酮类成分和皂苷类成分的混合对照品溶液进行检测，根据检测结果分别计算黄酮类成分和皂苷类成分的相对校正因子，计算公式如下；
相对校正因子F＝(As×Wn)/(An×Ws)；
其中，As代表内参物对照品的色谱峰面积，Ws代表内参物对照品的质量浓度；An代表待测物对照品的色谱峰面积，Wn代表待测物对照品的质量浓度。
在实际操作中，若以黄芪皂苷Ⅱ作为内参物，则待测物分别为黄芪皂苷Ⅰ、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷。也就是说，As代表混合对照品溶液中黄芪皂苷Ⅱ的色谱峰面积，Ws代表混合对照品溶液中黄芪皂苷Ⅱ的质量浓度；当计算黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅰ的相对校正因子时，An代表混合对照品溶液中黄芪皂苷Ⅰ的色谱峰面积，Wn代表混合对照品溶液中黄芪皂苷Ⅰ的质量浓度。黄芪皂苷Ⅱ和其余待测成分的相对校正因子计算方法同理。
在本发明的具体实施方式中，以黄芪皂苷Ⅱ作为内参物，所述内参物黄芪皂苷Ⅱ与黄芪皂苷Ⅰ、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷的相对校正因子分别为0.50～0.60、0.80～0.90、0.25～0.35、0.75～0.85和0.75～0.85。
在本发明的具体实施方式中，所述混合对照品溶液中，黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷的浓度分别可以为0.04～0.05mg/mL、0.04～0.05mg/mL、0.01～0.02mg/mL、0.02～0.03mg/mL、0.015～0.025mg/mL和0.025～0.035mg/mL。
在本发明的具体实施方式中，所述混合对照品溶液中的溶剂为体积分数为75％～85％的甲醇水溶液，如体积分数为80％的甲醇水溶液。
在本发明的具体实施方式中，所述供试品溶液的配制包括：采用甲醇回流提取所述黄芪药材，然后收集液体，浓缩得到固体，再采用体积分数为75％～85％的甲醇水溶液溶解所述固体，得到供试品溶液。具体的可采用体积分数为80％的甲醇水溶液。
在实际操作中，所述黄芪药材与所述甲醇的比例为1g﹕25mL。所述回流提取的时间为2h。
在本发明的具体实施方式中，所述供试品溶液中内参物的含量的计算方法包括：
将含内参物对照品的标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，在所述检测条件下，测定相应的色谱峰面积，以标准系列工作溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制内参物的标准曲线；将所述供试品溶液的色谱检测结果中的内参物的色谱峰面积代入所述内参物的标准曲线中，计算得到所述供试品溶液中内参物的含量。
本发明还提供了采用上述任一检测方法在黄芪药材及其制剂的质量控制中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的检测方法，采用特定的检测条件，保证供试品中多种待测成分分离度高，检测结果准确；
(2)本发明基于一测多评法采用HPLC-CAD对黄芪药材中的黄酮类和皂苷类成分进行测定，可以实现以单一成分黄芪皂苷II为内参物同时检测黄芪中其他5种黄酮和皂苷的含量，避免同一药物重复繁琐的操作，克服对照品紧缺和检测成本高的困难，缩短了检测时间，且灵敏度高、专属性强、耐用性好；
(3)本发明的检测方法可用于黄芪药材及其制剂的质量控制中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1得到的色谱图；其中，A为空白溶液，B为混合对照品溶液，C为黄芪药材供试品溶液；
图2为本发明实施例2得到的供试品溶液的色谱图；
图3为本发明实施例3得到的供试品溶液的色谱图；
图4为本发明实施例4得到的供试品溶液的色谱图；
图5为本发明实施例5得到的供试品溶液的色谱图；
图6为本发明实施例6得到的供试品溶液的色谱图；
图1-图6中，标号1～6分别代表：1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷，2-黄芪甲苷，3-芒柄花素，4-7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷，5-黄芪皂苷Ⅱ，6-黄芪皂苷Ⅰ。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
具体实施方式中的对专属性、检测限与定量限、精密度、线性关系及范围、重复性、溶液稳定性等项目的验证，按照现行版《中华人民共和国药典》附录中有关的指导原则进行方法学验证。
本发明具体实施例中采用的材料、仪器及试剂等信息可以如下：
材料：本发明采用的黄芪药材样品购自不同产地，经鉴定为蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.Mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根，具体黄芪药材样品来源信息表如下表1：
表1黄芪药材样品来源信息表
药材编号 产地 药材编号 产地
S1 甘肃 S11 山西
S2 甘肃 S12 山西
S3 甘肃 S13 山西
S4 甘肃 S14 山西
S5 甘肃 S15 山西
S6 甘肃 S16 山西
S7 甘肃 S16 山西
S8 甘肃 S18 内蒙
S9 甘肃 S19 内蒙
S10 山西 S20 内蒙
仪器及试剂：
高效液相色谱仪：型号Thermo U3000，赛默飞世尔科技有限公司，包括LPG-3400SD泵、WPS-3000TRS自动进样器、TCC-3200柱温箱、DAD检测器和Corona Veo RS电雾式检测器(CAD)；
乙腈：色谱纯，默克；
甲醇：色谱纯，默克；
其他化学试剂为分析纯；
毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：111920-201606，纯度97.6％，)、黄芪甲苷(批号：110781-201717，纯度96.9％，)购自中国食品药品检定研究院；芒柄花素(批号：3523，纯度98.2％，)、黄芪皂苷I(批号：6107，纯度99.0％)、黄芪皂苷II(批号：3258，纯度100.0％)购自施丹德生物科技有限公司；7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷(批号：Y31D10H107318，纯度98％)购自上海源叶生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供了黄芪药材成分的检测方法，包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液：
精密称取黄芪药材粉末2g(过4号筛)，置于100mL圆底烧瓶中，精密加入体积分数为80％的甲醇水溶液50mL，80℃～90℃加热回流提取2h，过滤，滤渣以甲醇20mL冲洗，回收甲醇液，蒸干得残渣，残渣以体积分数为80％的甲醇水溶液溶解并定容至5mL量瓶中，摇匀，以0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
(2)混合对照品溶液的制备：
取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、芒柄花素和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷各对照品适量，精密称定，以体积分数为80％的甲醇水溶液配制成每1mL中含有毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.65mg、黄芪甲苷0.04mg、黄芪皂苷Ⅰ1.125mg、黄芪皂苷Ⅱ0.12mg、芒柄花素0.05mg和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷0.075mg的混合对照品储备溶液，精密量取混合对照品储备液4mL，置于10mL量瓶中，加入体积分数为80％的甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.260mg、黄芪甲苷0.016mg、黄芪皂苷Ⅰ0.450mg、黄芪皂苷Ⅱ0.048mg、芒柄花素0.020mg和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷0.030mg的混合对照品溶液。
(3)色谱检测条件
色谱柱：Agilent SB-C18(150mm×4.6mm，3.5μm)；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
流动相：0.05vol.％甲酸乙腈(A)-0.05vol.％甲酸水(B)；
梯度洗脱条件(体积分数)：0～3min，20％A；3～8min，20％A→25％A；8～18min，25％A→36％A；18～38min，36％A→43％A；
进样量：20μL；
CAD参数：漂移管温度50℃，气体流速50psi/min。
(4)检测步骤：
分别精密量取空白溶液、所述混合对照品溶液和所述供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按照步骤(3)中的条件进行检测，记录色谱图，色谱图分别如图1中的A、B和C所示。其中，空白溶液是指体积分数为80％的甲醇水溶液。其中，各标号代表的分别为：1-毛蕊异黄酮葡萄糖苷，2-黄芪甲苷，3-芒柄花素，4-7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷，5-黄芪皂苷Ⅱ，6-黄芪皂苷Ⅰ。
(5)相对校正因子计算
分别精密吸取混合对照品溶液1、2.5、5、10、20、30μL，依次注入高效液相色谱仪，按步骤(3)中的条件进行检测，记录色谱图。以黄芪皂苷Ⅱ为内参物，分别计算黄芪皂苷Ⅱ对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷、黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅰ的相对校正因子，计算公式为：
相对校正因子F＝(As×Wn)/(An×Ws)；其中，As代表内参物黄芪皂苷Ⅱ对照品的色谱峰面积，Ws代表内参物黄芪皂苷Ⅱ对照品的质量浓度；An代表待测物(毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷、黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅰ)对照品的色谱峰面积，Wn代表待测物(毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷、黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅰ)对照品的质量浓度；
具体结果见表2和表3。
表2黄芪皂苷Ⅰ、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷对黄芪皂苷Ⅱ的相对保留时间
Figure BDA0002648642870000111
注：Rt1＝黄芪皂苷Ⅰ保留时间/黄芪皂苷Ⅱ保留时间；Rt2＝黄芪甲苷保留时间/黄芪皂苷Ⅱ保留时间；Rt3＝毛蕊异黄酮葡萄糖苷保留时间/黄芪皂苷Ⅱ保留时间；Rt4＝芒柄花素保留时间/黄芪皂苷Ⅱ保留时间；Rt5＝7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷保留时间/黄芪皂苷Ⅱ保留时间
表3黄芪皂苷Ⅱ对黄芪皂苷Ⅰ、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷的相对校正因子
Figure BDA0002648642870000112
Figure BDA0002648642870000121
注：F1为黄芪皂苷Ⅱ/黄芪皂苷Ⅰ的相对校正因子；F2为黄芪皂苷Ⅱ/黄芪甲苷的相对校正因子；F3为黄芪皂苷Ⅱ/毛蕊异黄酮葡萄糖苷的相对校正因子；F4为黄芪皂苷Ⅱ/芒柄花素的相对校正因子；F5为黄芪皂苷Ⅱ/7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷的相对校正因子
根据上述结果计算所述供试品溶液中内参物黄芪皂苷Ⅱ的含量；再根据相对校正因子计算所述供试品溶液中其余黄酮类和皂苷类成分(黄芪皂苷Ⅰ、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷)的含量。
其中，所述供试品溶液中内参物黄芪皂苷Ⅱ的含量的计算方法包括：
将含内参物黄芪皂苷Ⅱ的标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，按照步骤(3)中的条件进行检测，测定黄芪皂苷Ⅱ相应的色谱峰面积，以标准系列工作溶液的浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制内参物黄芪皂苷Ⅱ的标准曲线；将所述供试品溶液的色谱检测结果中的内参物黄芪皂苷Ⅱ的色谱峰面积代入所述内参物黄芪皂苷Ⅱ的标准曲线中，计算得到所述供试品溶液中内参物黄芪皂苷Ⅱ的含量。黄芪皂苷Ⅱ的线性方程为y＝60.91x+0.3741，R2＝0.9982。
实施例2
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(3)的色谱检测条件不同：
色谱柱：Agilent SB-C18(150mm×4.6mm，3.5μm)；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
流动相：0.1vol.％甲酸乙腈(A)-0.1vol.％甲酸水(B)；
梯度洗脱条件(体积分数)：0～3min，20％A；3～8min，20％A→28％A；8～18min，28％A→36％A；18～30min，36％A→42％A；30～38min，42％A～60％A；
进样量：20μL；
CAD参数：漂移管温度50℃，气体流速50psi/min。
步骤(4)检测得到的所述供试品溶液的色谱图如图2所示。
目标化合物分离度较好，但是色谱峰基线相对不平稳。
实施例3
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(3)的色谱检测条件不同：
色谱柱：Agilent SB-C18(150mm×4.6mm，3.5μm)；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
流动相：0.1vol.％甲酸乙腈(A)-0.1vol.％甲酸水(B)；
梯度洗脱条件(体积分数)：0～3min，20％A；3～8min，20％A→28％A；8～18min，28％A→36％A；18～24min，36％A→39％A；24～38min，39％A～60％A；
进样量：20μL；
CAD参数：漂移管温度50℃，气体流速50psi/min。
步骤(4)检测得到的所述供试品溶液的色谱图如图3所示。
目标化合物分离度较好，但是色谱峰基线相对不平稳。
实施例4
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(3)的色谱检测条件不同：
色谱柱：Agilent SB-C18(150mm×4.6mm，3.5μm)；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
流动相：0.1vol.％甲酸乙腈(A)-0.1vol.％甲酸水(B)；
梯度洗脱条件(体积分数)：0～3min，20％A；3～8min，20％A→25％A；8～18min，25％A→36％A；18～38min，36％A→43％A；
进样量：20μL；
CAD参数：漂移管温度50℃，气体流速50psi/min。
步骤(4)检测得到的所述供试品溶液的色谱图如图4所示。
目标化合物分离度较好，色谱峰基线平稳。
实施例5
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(3)的色谱检测条件不同：
色谱柱：Agilent SB-C18(150mm×4.6mm，3.5μm)；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
流动相：乙腈(A)-水(B)；
梯度洗脱条件(体积分数)：0～8min，20％A；8～15min，20％A→30％A；15～30min，30％A→43％A；30～40min，43％A→60％A；
进样量：20μL；
CAD参数：漂移管温度50℃，气体流速50psi/min。
步骤(4)检测得到的所述供试品溶液的色谱图如图5所示。
目标化合物分离度较好，但是色谱峰基线相对较差。
实施例6
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(3)的色谱检测条件不同：
色谱柱：Agilent SB-C18(150mm×4.6mm，3.5μm)；
柱温：35℃；
流速：1.0mL/min；
流动相：乙腈(A)-水(B)；
梯度洗脱条件(体积分数)：0～8min，10％A→20％A；8～15min，20％A→30％A；15～30min，30％A→40％A；30～40min，40％A→60％A；
进样量：20μL；
CAD参数：漂移管温度50℃，气体流速50psi/min。
步骤(4)检测得到的所述供试品溶液的色谱图如图6所示。
目标化合物分离度较好，但是色谱峰基线相对较差。
实验例1
方法学考察
1、专属性
取混合对照品溶液、供试品溶液、空白溶液，分别注入液相色谱仪，比较色谱图。其中，混合对照品溶液、供试品溶液、空白溶液分别如实施例1所述，色谱检测条件参照实施例1，色谱图测试结果如图1所示。
从图1中可知，空白溶液中未出现与混合对照品溶液及黄芪药材供试品溶液中6种待测成分保留时间相一致的色谱峰，表明空白溶液对6种待测成分均无干扰。
2、精密度
分别精密量取6份实施例1中的混合对照品溶液20μL，按照实施例1中的色谱检测条件注入液相色谱仪中，分别记录色谱图，以6种成分的峰面积值计算RSD值。
计算结果：毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷、黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ和黄芪皂苷Ⅱ峰面积的RSD(n＝6)分别为1.33％、2.12％、1.17％、1.24％、2.55％和1.60％、，表明仪器精密度良好。
3、线性关系及范围
将实施例1中配制的混合对照品储备液逐级稀释，配制6个不同浓度的混合对照品标准系列工作溶液，按照实施例1中的色谱检测条件注入液相色谱仪中，分别记录色谱图，对应记录各成分在不同浓度下的峰面积。以进样量(μg)为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，计算线性回归方程和相关系数。
6种成分的线性回归方程及相关系数见表4。3种皂苷类成分和3种黄酮类成分在CAD检测条件下显示出良好的线性关系。
表4 6种成分的线性回归分析结果
Figure BDA0002648642870000161
4、检测限和定量限
精密称取实施例1中的混合对照品储备液，用体积分数为80％的甲醇水溶液逐步稀释至信噪比约为3和10时的溶液，计算此时的溶液的浓度。检测限和定量限结果如表5所示。
表5 6种成分的检测限和定量限分析结果
名称 定量限/μg 检测限/μg
毛蕊异黄酮葡萄糖苷 0.04 0.02
黄芪甲苷 0.02 0.01
黄芪皂苷Ⅰ 0.04 0.02
黄芪皂苷Ⅱ 0.02 0.01
芒柄花素 0.03 0.01
7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷 0.03 0.02
5、重复性
精密称取黄芪药材粉末样品6份，按照实施例1的方法制备供试品溶液；再按照实施例1的色谱检测条件分别测定6份供试品溶液中6种成分的含量，计算RSD值，测试结果见表6，下述结果表明重复性良好。
表6重复性测试结果
名称 RSD
毛蕊异黄酮葡萄糖苷 1.51％
芒柄花素 2.91％
7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷 2.81％
黄芪皂苷Ⅰ 2.38％
黄芪皂苷Ⅱ 2.29％
黄芪甲苷 1.70％
6、稳定性
取S20号黄芪药材样品，按照实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h、48h后进样分析(色谱检测条件参考实施例1)，以6种成分的峰面积计算RSD，测试结果见表7，结果表明供试品溶液在48h内稳定。
表7稳定性测试结果
名称 RSD
毛蕊异黄酮葡萄糖苷 3.24％
芒柄花素 2.28％
7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷 1.91％
黄芪皂苷Ⅰ 1.45％
黄芪皂苷Ⅱ 3.30％
黄芪甲苷 1.72％
7、加样回收率
精密称取6份已知含量的黄芪药材样品约1g，分别按照样品-对照品约1﹕1的比例加入一定量的各个对照品，按照实施例1的供试品溶液的制备方法，摇匀配制供试品溶液，按照实施例1的色谱检测条件进样测定各成分的峰面积，并计算回收率。6种成分的加样回收率在99.65～101.93％之间，6种成分RSD分别为2.23％，2.41％，1.98％，2.28％，1.34％，3.21％，具体结果见表8。
表8加样回收率结果(n＝6)
Figure BDA0002648642870000181
实验例2
采用一测多评法(QAMS)与外标法(ESM)分别测定比较表1中20批不同产地的黄芪药材，按照实施例1中的方法制备供试品溶液，并按照实施例1中的色谱检测条件进行检测，以及利用实施例1中的相对校正因子计算方法得出平均相对校正因子后，计算不同产品的黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪甲苷的含量，并与ESM计算得到的结果进行比较，结果见表9，利用SPSS软件对两种含量测定方法测定的结果进行t检验。
表9 QAMS法与ESM法测得的黄芪药材中6种成分的含量(mg/g)
Figure BDA0002648642870000191
Figure BDA0002648642870000201
由上表可知，两种含量测定方法无显著性差异，P>0.05。但一测多评法(QAMS)比外标法(ESM)相比，节约对照品用量、减少检测器使用，使检测成本大大降低。同时该测定方法快速、简便、准确，为黄芪药材的全面质量控制提供了新的方法和思路。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.黄芪药材及其制剂中成分的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用高效液相色谱电雾式检测器法对黄芪药材或其制剂供试品溶液进行检测；
采用外标法或一测多评法对所述供试品溶液中的黄酮类成分和/或皂苷类成分的含量进行测算；
其中，所述高效液相色谱电雾式检测器法的检测条件包括：
采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述流动相A为含0vol.％～0.1vol.％甲酸的乙腈，所述流动相B为含0vol.％～0.1vol.％甲酸的水。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的过程包括：0～3min内，流动相A的体积分数为20％；3～8min内，流动相A的体积分数由20％变至25％～28％；8～18min内，流动相A的体积分数由25％～28％变至36％；18～38min内，流动相A的体积分数由36％变至43％～60％；
优选的，所述梯度洗脱的过程包括：0～3min内，流动相A的体积分数为20％；3～8min内，流动相A的体积分数由20％变至25％；8～18min内，流动相A的体积分数由25％变至36％；18～38min内，流动相A的体积分数由36％变至43％；
优选的，所述检测条件包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
柱温：25～40℃；
流速：0.8～1.2mL/min；
进样量：5～20μL；
漂移管温度：30～60℃；
气体流速：30～80psi/min。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述黄酮类成分包括毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷中的任一种或多种；所述皂苷类成分包括黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ和黄芪甲苷中的任一种或多种。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用一测多评法进行测算时，还包括：采用所述高效液相色谱电雾式检测器法对含内参物对照品溶液进行检测；根据检测结果计算所述供试品溶液中内参物的含量；根据相对校正因子计算所述供试品溶液中黄酮类成分和/或皂苷类成分的含量；
优选的，所述内参物包括黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷中的任一种；
更优选的，所述内参物为黄芪皂苷Ⅱ。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述相对校正因子的计算方法包括：
采用所述高效液相色谱电雾式检测器法对黄酮类成分和皂苷类成分的混合对照品溶液进行检测，根据检测结果分别计算黄酮类成分和皂苷类成分的相对校正因子，计算公式如下；
相对校正因子F＝(As×Wn)/(An×Ws)；
其中，As代表内参物对照品的色谱峰面积，Ws代表内参物对照品的质量浓度；An代表待测物对照品的色谱峰面积，Wn代表待测物对照品的质量浓度。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述混合对照品溶液中，黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷的浓度分别为0.04～0.05mg/mL、0.04～0.05mg/mL、0.01～0.02mg/mL、0.02～0.03mg/mL、0.015～0.025mg/mL和0.025～0.035mg/mL。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，以黄芪皂苷Ⅱ作为内参物，所述内参物黄芪皂苷Ⅱ与黄芪皂苷Ⅰ、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷的相对校正因子分别为0.50～0.60、0.80～0.90、0.25～0.35、0.75～0.85和0.75～0.85。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液中内参物的含量的计算方法包括：
将含内参物对照品的标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，在所述检测条件下，测定相应的色谱峰面积，以标准系列工作溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制内参物的标准曲线；将所述供试品溶液的色谱检测结果中的内参物的色谱峰面积代入所述内参物的标准曲线中，计算得到所述供试品溶液中内参物的含量。
9.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的配制包括：采用甲醇回流提取所述黄芪药材，收集液体浓缩得到固体，采用体积分数为75％～85％的甲醇水溶液溶解所述固体，得到所述供试品溶液。
10.权利要求1-9任一项所述的检测方法在黄芪药材及其制剂的质量控制中的应用；
可选的，所述制剂包括芪蛭通络胶囊。
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