CN104849381B

CN104849381B - 基于高效液相色谱-电雾式检测器法同时测定7种黄芪皂苷类成分的方法

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Publication number: CN104849381B
Application number: CN201410756591.5A
Authority: CN
Inventors: 萧伟; 王伟; 李家春; 刘俊超; 杨绪芳; 黄文哲
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2016-09-28
Anticipated expiration: 2034-12-10
Also published as: CN104849381A

Abstract

本发明公开一种基于高效液相色谱‑电雾式检测器法同时测定含黄芪的中药组合物中7种黄芪皂苷类成分的方法，其特征在于：采用C₁₈色谱柱，以水－乙腈为流动相，梯度洗脱，体积流速:0.8～1.2 mL·min^‑1；电雾式检测器的检测温度为25～35℃。本发明方法选用乙腈－水洗脱系统，其色谱峰灵敏度高，色谱峰峰形、分离效果好；选择特定的梯度洗脱程序提高检测的准确性，方法简单易行，定量准确。

Description

基于高效液相色谱-电雾式检测器法同时测定7种黄芪皂苷类成分的方法

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及一种基于高效液相色谱-串联电雾式检测器法同时测定含黄芪的中药中7种黄芪皂苷类成分的方法。

背景技术

本发明是基于中国发明专利ZL200410022665.9所述中药组合物，该组合物以黄芪和红花为有效成分。

该中药组合物具有益气活血，化瘀通脉等功效，适应于冠心病、心绞痛属于气虚血瘀证者。制剂中黄芪皂苷类成分是其主要活性成分，具有调节免疫，改善大脑缺血，抗血栓及抗应激，心室重构保护，心肌抗氧化等功能。其在制剂中含量的高低，直接影响着注射用芪红脉通的药理作用。现行标准采用比色法测定黄芪总皂苷，专属性不强；文献仅对少数黄芪皂苷(黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)进行测定，难以全面控制其质量。且文献方法多采用HPLC－ELSD，虽然ELSD对糖类、皂苷类、银杏内酯等弱紫外吸收的化合物检测具有一定的适用性，但其检测限相对较高，对低含量成分检测的重复性较差。黄芪皂苷结构式：

黄芪甲苷：R1＝glc，R2＝xyl

黄芪皂苷Ⅰ：R1＝glc，R2＝R5＝H，R3＝R4＝Ac

异黄芪皂苷Ⅰ：R1＝glc，R2＝R4＝H，R3＝R5＝Ac

Cycloastragenol-3-O-β-D-(3",4"-di-O-acetyl)xylopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside：R1＝glc，

R2＝R3＝H，R4＝R5＝Ac

黄芪甲苷Ⅱ：R1＝glc，R2＝R4＝R5＝H，R3＝Ac

异黄芪甲苷Ⅱ：R1＝glc，R2＝R3＝R5＝H，R4＝Ac

CyclocephalosideⅡ：R1＝glc，R2＝R3＝R4＝H，R5＝Ac

电雾式检测器(CAD)是近年来在市场上被逐步推广的一款高灵敏度、通用型、质量型检测器。具有灵敏度高、重现性好、检测范围宽等特点，且其检测信号不依赖于被检测物质的化学结构中的发色团，可用于糖类、脂质类、固醇类和皂苷类等样品的检测。

针对现有技术中对黄芪皂苷类成分检测的灵敏度不高、检测限相对较高，对低含量成分检测的重复性较差的技术问题，需要提供一种新的黄芪皂苷类成分的测定方法，以全面控制其质量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于高效液相色谱-电雾式检测器法同时测定含黄芪的中药中7种黄芪皂苷类成分的方法。

本发明建立HPLC－CAD联用的方法同时测定7种黄芪皂苷，可以实现黄芪药材或成品制剂的多指标质量控制。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基于高效液相色谱-电雾式检测器法同时测定含黄芪的中药组合物中7种黄芪皂苷类成分的方法，采用C₁₈色谱柱，以水(A)－乙腈(B)为流动相，梯度洗脱，体积流速:0.8～1.2mL·min^-1；电雾式检测器的检测温度为25～35℃；所述梯度洗脱的程序为：0～5min乙腈：25％；5～30min乙腈：25％→40％；30～35min乙腈：40％；35～50min乙腈：40％→60％；50～55min乙腈：60％→25％；55～60min乙腈：25％；

或者为：0～5min乙腈：30％；5～15min乙腈：30％→35％；15～35min乙腈：35％→60％；35～40min乙腈60％；40～45min乙腈：60％→30％；45～55min乙腈：30％；

再或者为：0～5min乙腈：25％；5～25min乙腈：25％→40％；25～40min乙腈：40％→60％；40～45min乙腈60％→25％；45～55min乙腈：25％。

所述的C₁₈色谱柱优选为KromasilC₁₈色谱柱、PhenomenexC₁₈色谱柱或Waters C¹⁸色谱柱。

该方法中柱温为25～35℃，优选为30℃。

所述的体积流速优选为1.0mL·min^-1。

所述电雾式检测器的检测温度优选为30℃。

电雾式检测器的检测条件更进一步优化为：雾化气：N₂；雾化气压力：34.7Psi；氮气流速：约4L·min^-1；喷雾器温度：30℃；采样频率：10Hz，增益：16。

所述含黄芪的中药组合物为含黄芪的中药组合物的提取物或成品制剂。进一步优选，所述的含黄芪的中药组合物尤其是以黄芪和红花为主要有效成分，例如注射用芪红脉通。

最优选的技术方案为：

色谱条件为：色谱柱：采用C₁₈色谱柱，柱温:30℃，以水为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～5min乙腈：25％；5～30min乙腈：25％→40％；30～35min乙腈：40％；35～50min乙腈：40％→60％；50～55min乙腈：60％→25％；55～60min乙腈：25％。体积流速：1.0ml·min^-1；电雾式检测器：雾化气：N₂；雾化气压力：34.7Psi；氮气流速：约4L·min^-1；喷雾器温度：30℃；采样频率：10Hz，增益：16。

结果：7种黄芪皂苷类成分均达到基线分离，线性关系良好，7个成分的加样回收率为97.8％～101.1％，RSD(n＝6)均小于3.0％。

本发明的有益效果：

本发明方法选用水－乙腈为洗脱系统，其色谱峰灵敏度高，色谱峰峰形、分离效果好；选择特定的梯度洗脱程序显著提高检测的准确性。该方法检测的7个成分均达到基线分离，线性关系良好，7个成分的加样回收率为97.8％～101.1％，RSD(n＝6)均小于3.0％。该方法简单易行，定量准确，可用于本发明所述中药组合物中7个皂苷类成分的定量分析，为多指标控制中药组合物质量提供了实验基础，同时也为含黄芪药材的其他制剂的质量研究提供了参考方法。

附图说明

图1为对照品(A)、供试品(B)及阴性供试品(C)高效液相色谱图。

其中，1.黄芪甲苷(astragalosides)Ⅳ、2.黄芪皂苷Ⅱ(astragalosides)Ⅱ、3.异黄芪皂苷Ⅱ(isoastragaloside)Ⅱ、4.Cyclocephaloside、Ⅱ5.黄芪皂苷Ⅰ(astragalosides)Ⅰ、6.异黄芪皂苷Ⅰ(isoastragalosidesⅠ)、7.Cycloastragenol-3-O-β-D-(3",4"-di-O-acetyl)xylopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside。

图2为以水—甲醇为流动相测定供试品溶液的高效液相色谱图。

图3为以水—乙腈为流动相在洗脱条件Ⅰ条件下测定供试品溶液的高效液相色谱图。

图4为以水—乙腈为流动相在洗脱条件Ⅱ条件下测定供试品溶液的高效液相色谱图。

图5为以水—乙腈为流动相在洗脱条件Ⅲ条件下测定供试品溶液的高效液相色谱图。

图6为以水—乙腈为流动相在洗脱条件Ⅳ条件下测定供试品溶液的高效液相色谱图。

图7为以水—乙腈为流动相在洗脱条件Ⅴ条件下测定供试品溶液的高效液相色谱图。

图8为以水—1％冰醋酸溶液为流动相测定供试品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

1仪器与试药

Ultimate高效液相色谱仪(含双三元梯度泵、自动进样器、柱温箱、Corona Ultra电雾式检测器)，METTLER TOLEDO XP6型电子分析天平。

乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)，水为超纯水。

黄芪甲苷(110781-200613，供含量测定用，中国药品生物制品检定研究所)、黄芪皂苷Ⅰ(MUST-11070101，纯度：≥98％，成都曼思特生物科技有限公司)、黄芪皂苷Ⅱ(MUST-11031905，纯度：≥98％，成都曼思特生物科技有限公司)、异黄芪皂苷Ⅰ(130101)、异黄芪皂苷Ⅱ(130102)、CyclocephalosideⅡ(130103)、Cycloastragenol-3-O-β-D-(3",4"-di-O-acetyl)xylopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside(130104)。其中异黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅱ、CyclocephalosideⅡ、Cycloastragenol-3-O-β-D-(3",4"-di-O-acetyl)xylopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside由上海药物所赵维民老师实验室提供，或者通过市场购买获得，经IR、MS、¹H NMR、¹³C NMR确证结构，与文献报道的数据一致，峰面积归一化法计算纯度大于98％，5个批次的中药组合物由江苏康缘药业股份有限公司依照中国发明专利ZL200410022665.9中制备方法制备的注射用芪红脉通。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Kromasil C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，以水为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～5min乙腈：25％；5～30min乙腈：25％→40％；30～35min乙腈：40％；35～50min乙腈：40％→60％；50～55min乙腈：60％→25％；55～60min乙腈：25％。体积流速：1.0ml·min^-1；电雾式检测器：雾化气：N₂；雾化气压力：34.7Psi；氮气流速：约4L·min^-1；喷雾器温度：30℃；采样频率：10Hz，增益：16。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、CyclocephalosideⅡ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ、Cycloastragenol-3-O-β-D-(3",4"-di-O-acetyl)xylopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside对照品适量，加甲醇溶解，制成每1mL分别含黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、CyclocephalosideⅡ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ、Cycloastragenol-3-O-β-D-(3",4"-di-O-acetyl)xylopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside各1.138、0.9450、0.4712、0.4120、0.4664、0.4860、0.1640mg的混合溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备：取注射用芪红脉通一支，加水溶解并定容至10mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性供试品溶液的制备：按处方工艺，制备缺黄芪的阴性样品，按2.2.2项下方法制备阴性供试品溶液，即得。

2.3方法学考察

2.3.1空白试验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按照2.1项下色谱条件测定，记录色谱图，空白对上述7个成分测定无干扰，结果见图1。

2.3.2线性范围精密吸取2.2.1项下配制的混合对照品溶液1、2、3、5、10、15、25μL，注入高效液相色谱仪，照2.1项下色谱条件测定，以待测组分浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明各组分在进样量范围之内线性关系良好，结果见表1。

表1 7个黄芪皂苷的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

2.3.3定量限和检测限的测定取2.2.1项下对照品混合溶液，逐级稀释，按照2.1项下色谱条件测定对照品各物质的峰面积，分别以信噪比(S/N)等于3和10为标准，测得7个待测组分的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果见表1。

2.3.4精密性试验精密吸取2.2.1项下混合对照品溶液10μL，按2.1项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，结果7个对照品物质峰面积的RSD(n＝6)分别为1.2％、1.7％、0.84％、0.86％、1.0％、1.2％、1.5％。

2.3.5稳定性试验取同一供试品溶液10μL，按2.1项下色谱条件于0、1、2、3、6、9、12、15、18h进样，测定峰面积，结果样品中7个黄芪皂苷峰面积的RSD分别为1.1％、1.5％、1.6％、1.9％、1.4％、1.6％、1.4％，表明供试品溶液在室温条件下18h内稳定。

2.3.6重复性试验取注射用芪红脉通(批号：130701)6支，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项的色谱条件测定峰面积，计算各成分含量，结果黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、CyclocephalosideⅡ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ、Cycloastragenol-3-O-β-D-(3",4"-di-O-acetyl)-xylopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside的平均含量分别为3.81、2.93、1.53、1.29、1.54、1.56、0.53mg/支，相对标准偏差RSD为1.5％～2.2％，表明该方法重复性良好。

2.3.7回收率试验取注射用芪红脉通(批号：130701)6支，精密加水10mL，分别精密量取5mL置10mL量瓶中，各加入混合对照品溶液(黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、CyclocephalosideⅡ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ、Cycloastragenol-3-O-β-D-(3",4"-di-O-acetyl)-xylopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside的质量浓度分别为0.569、0.4725、0.2333、0.206、0.235、0.243、0.081mg·mL^－1)3mL，再加水定容至刻度，作为供试品溶液，测定，计算7个成分的加样回收率，结果见表2。

表2 样品加标回收率(n＝6)

2.4样品测定

取不同批次的注射用芪红脉通样品按2.2.2项方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液10μL，注入HPLC仪中，按2.1项下色谱条件测定峰面积，计算7个成分的含量，结果见表3。

表3 样品测定结果(mg/支)

2.5色谱条件优化过程：

2.5.1以水—甲醇为流动相，采用表4中的梯度洗脱条件测定供试品溶液，其他测定条件同2.1，测定结果见图2。

表4 以水—甲醇为流动相的梯度洗脱条件

2.5.2以水—乙腈为流动相，采用表5中的梯度洗脱条件Ⅰ测定供试品溶液，其他测定条件同2.1，测定结果见图3。

表5 以水—乙腈为流动相的梯度洗脱条件Ⅰ

2.5.3以水—乙腈为流动相，采用表6中的梯度洗脱条件Ⅱ测定供试品溶液，其他测定条件同2.1，测定结果见图4。

表6 以水—乙腈为流动相的梯度洗脱条件Ⅱ

2.5.4以水—乙腈为流动相，采用表7中的梯度洗脱条件Ⅲ测定供试品溶液，其他测定条件同2.1，测定结果见图5。

表7 以水—乙腈为流动相的梯度洗脱条件Ⅲ

2.5.5以水—乙腈为流动相，采用表8中的梯度洗脱条件Ⅳ测定供试品溶液，其他测定条件同2.1，测定结果见图6。

表8 以水—乙腈为流动相的梯度洗脱条件Ⅳ

2.5.6以水—乙腈为流动相，采用表9中的梯度洗脱条件Ⅴ测定供试品溶液(测定条件与2.1相同)，测定结果见图7。

表9 以水—乙腈为流动相的梯度洗脱条件Ⅴ

2.5.7以水—1％(w/w)冰醋酸溶液为流动相，采用表10中的梯度洗脱条件测定供试品溶液，其他测定条件同2.1，测定结果见图8。

表10 以乙腈—1％冰醋酸溶液为流动相的梯度洗脱条件

3讨论

3.1CAD为通用型检测器，适用于各种非挥发或半挥发性化合物。试验研究显示：黄芪皂苷标准曲线在较宽的范围内，CAD检测器的响应值与化合物的质量呈一元二次曲线关系,而在小范围内，CAD检测器的响应值与化合物的质量呈直线关系，可采用外标两点法计算，较为方便。试验结果显示CAD检测器精密度良好(RSD<2％)、灵敏度高，可用于组分的含量测定。

3.2本发明比较了水－甲醇、水－乙腈和乙腈－醋酸溶液不同的洗脱系统以及以水－乙腈作为洗脱系统的梯度洗脱程序Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，结果显示水－乙腈系统的梯度洗脱程序Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ尤其是梯度洗脱程序Ⅴ的色谱峰峰形、分离效果优于水－甲醇系统，且水－乙腈较乙腈－醋酸水系统基线噪音小，色谱峰灵敏度高，因此选用水－乙腈溶液作为洗脱体系，选用了梯度洗脱程序Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ尤其是梯度洗脱程序Ⅴ作为梯度洗脱条件。由于7种黄芪皂苷化学结构比较相近，等度洗脱的方式达不到定性和定量的要求，因此选择梯度洗脱方式。选用不同品牌(Kromasil、Phenomenex、Waters)的C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)进行试验，样品中的7个黄芪皂苷类成分均能够达到基线分离，试验选用柱效中等的KromasilC₁₈色谱柱。对检测器条件进行优化，分别采用25、30、35℃作为氮气雾化温度进行比较，发现黄芪皂苷类成分的分离效果与响应没有显著变化，选用30℃作为雾化温度，与洗脱的柱温条件一致，不易产生温差等造成的波动影响。

3.3本申请首次建立了以HPLC-CAD法同时测定7种黄芪皂苷成分的检测方法，结果表明，该方法简单易行，定量准确，可用于含黄芪的中药组合物或成品制剂中7个皂苷类成分的定量分析，为多指标同时控制质量提供了实验基础，同时也为含黄芪药材的其他制剂的质量研究提供了参考方法。

Claims

1.一种基于高效液相色谱-电雾式检测器法同时测定含黄芪的中药组合物中7种黄芪皂苷类成分的方法，其特征在于：采用C₁₈色谱柱，以水－乙腈为流动相，梯度洗脱，体积流速: 0.8~1.2 mL min^-1；电雾式检测器的检测温度为25～35℃；所述梯度洗脱的程序为：0～5min乙腈：25% ；5～30min 乙腈：25%→40% ；30～35min乙腈：40% ；35～50min乙腈：40%→60%；50～55min乙腈：60%→25%；55～60min乙腈：25%；

或者为：0～5min乙腈：30% ；5～15min 乙腈：30%→35% ；15～35min乙腈：35%→60% ；35～40min乙腈 60%；40～45min乙腈：60%→30%；45～55min乙腈：30%；

再或者为：0～5min乙腈：25% ；5～25min 乙腈：25%→40% ；25～40min乙腈：40%→60% ；40～45min乙腈 60%→25%；45～55min乙腈：25%；

所述的7种黄芪皂苷类成分为黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ、CyclocephalosideⅡ、黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅰ和Cycloastragenol-3-O-β-D-(3",4"-di-O-acetyl)-xylopyranosyl-6-O-β-D-glucopyranoside。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的C₁₈色谱柱为KromasilC₁₈色谱柱、PhenomenexC₁₈色谱柱或Waters C₁₈色谱柱。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法中柱温为25~35℃。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的柱温为30℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的体积流速为1.0 mL min^-1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述电雾式检测器的检测温度为30℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述含黄芪的中药组合物为含黄芪的中药组合物的提取物或成品制剂。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于所述的含黄芪的中药组合物是以黄芪和红花为主要有效成分。