CN104398642A - 一种复方黄柏液的制备及质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复方黄柏液的制备及质量检测方法,该质量检测方法包括连翘、黄柏、金银花和蒲公英的鉴别,山银花的检查,连翘苷和盐酸小檗碱的含量测定。本发明的鉴别方法在合格供试品薄层色谱图中,在与对照品薄层色谱图相应的位置上,均显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰,该方法选择性好,简便,准确。本发明的山银花检查方法使用高效液相色谱法进行检查,该方法特异性好,可以区分复方黄柏液采用山银花冒充金银花投料的情况。本发明的连翘苷和盐酸小檗碱的含量测定方法线性关系良好,回收率试验准确度较高,具有极好的重复性和稳定性,可以准确、严密地检测复方黄柏液的质量,保证了本复方制剂较高的质量标准水平。

Description

一种复方黄柏液的制备及质量检测方法
技术领域
本发明涉及一种药品组合物的制备及质量检测方法,特别涉及一种复方黄柏液的制备及质量检测方法。
背景技术
复方黄柏液,国药准字Z10950097,主要成分为:连翘、黄柏、金银花、蒲公英。具有清热解毒,消肿止痛,祛腐生肌,抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、消炎和促进伤口愈合的作用,还具有提高非特异性免疫力、增强单核巨噬细胞吞噬功能的作用。适用于骨髓炎、骨结核窦道、脉管炎等疑难病及疮疡溃后外伤感染等常见病,是临床化脓性感染、促进愈合的特效外用药物。
现行复方黄柏液的质量检测标准包括连翘、黄柏的定性鉴别以及盐酸小檗碱的含量测定这两部分。采用薄层色谱法进行盐酸小檗碱的含量测定以及连翘与黄柏的定性鉴别,其展开剂成分中含有苯等对人体毒性大的物质,不利于实验室人员健康,同时没有对连翘进行含量测定,且由于处方中存在金银花,而金银花、山银花在药用历史、植物形态、药材性状、化学成分等方面存在差异,特别是山银花中含有大量皂苷类成分,则可能存在溶血等安全风险,为临床使用埋下了隐患。因此亟需研究一套关于复方黄柏制剂的更安全、更准确、更严密的质量检测方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种复方黄柏液的制备方法及一种安全、准确、严密的复方黄柏液的质量检测方法。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案是,一种复方黄柏液,其原料组成为:
连翘       80±10重量份       黄柏40±5重量份
金银花     40±5重量份        蒲公英40±5重量份
蜈蚣       2.4±0.3重量份。
作为优化,所述复方黄柏液的原料组成为:
连翘       80重量份       黄柏40重量份
金银花     40重量份       蒲公英40重量份
蜈蚣       2.4重量份 。
一种复方黄柏液的制备方法,包括以下步骤:
(1)按重量组分称取处方中的五味中药,加水煎煮提取三次;
(2)煎液合并,过滤,浓缩滤液;
(3)加入乙醇,静置,过滤,滤液回收乙醇至无味,得清液备用;
(4)将步骤3所得的清液加水定容,搅匀,静置,冷藏,即得。
一种复方黄柏液的制备方法,包括以下步骤:
(1)按重量组分称取处方中的五味中药,加水煎煮提取三次,第一次1小时,第二次45分钟,第三次30分钟;
(2)煎液合并,过滤,浓缩滤液至相对密度为1.10~1.15(温度为50℃下测量)的清膏;
(3)加乙醇使含乙醇量达70%,静置24小时,过滤,滤液减压浓缩至无乙醇,得清液备用;
(4)将步骤3所得的清液加水至1000重量份,搅匀,静置,冷藏24小时,滤过,灌装,灭菌,即得。
一种复方黄柏液的质量检测方法,包括鉴别、检查、含量测定三部分。
作为优化,所述的鉴别包括连翘、黄柏、金银花、蒲公英四种药材成分的鉴别:
A.连翘
取复方黄柏液40ml,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次40ml;合并正丁醇提取液,用氨试液40ml洗涤;分取正丁醇液,回收溶剂至干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;
取连翘对照药材1g,加水40ml,煎煮30分钟,过滤;滤液用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次40ml,合并正丁醇提取液,用氨试液40ml洗涤;分取正丁醇液,回收溶剂至干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为对照药材溶液;
取连翘苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg连翘苷的溶液,作为对照品溶液;
薄层色谱法试验:吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷:丙酮:甲醇:甲酸=12∶2.5∶2∶0.2的混合溶液为展开剂展开,取出,晾干;喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰;在日光下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
B.黄柏
取复方黄柏制剂40ml,加在中性氧化铝柱中,用1%醋酸甲醇溶液50ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇2ml使溶解,作为供试品溶液;
取黄柏对照药材0.1g,加入1%醋酸甲醇溶液20ml,于60℃温度下超声处理20分钟,滤过,滤液浓缩至2ml,作为对照药材溶液;
取盐酸黄柏碱对照品,加甲醇制成每1ml含0.5mg盐酸黄柏碱的溶液,作为对照品溶液;
薄层色谱法试验:吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷:甲醇:水=30:15:4的下层溶液为展开剂,置氨蒸汽饱和的展开缸内,展开,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾试液;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
C.金银花、蒲公英
取复方黄柏制剂40ml,用乙酸乙酯振摇提取2次,每次40ml,合并乙酸乙酯提取液,回收溶剂至干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;
取金银花对照药材、蒲公英对照药材各1g,分别加水40ml,煎煮30分钟,滤过;滤液用乙酸乙酯振摇提取2次,每次40ml,合并乙酸乙酯提取液,回收溶剂至干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为两组对照药材溶液;
薄层色谱法试验:吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸丁酯:甲酸:水=14∶5∶5的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,在紫外光(365nm)下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
作为优化,所述的检查是通过检查是否含有山银花特有成分灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙,确定复方黄柏液是否采用山银花代替金银花投料:
精密量取复方黄柏液5ml,置于10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,作为供试品溶液;
取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品和川续断皂苷乙对照品,加50%甲醇制成每1ml含灰毡毛忍冬皂苷乙与川续断皂苷乙各0.2mg的混合溶液,作为对照品溶液;
高效液相色谱法试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以水为流动相A,以乙腈为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;用蒸发光散射检测器检测,理论板数按灰毡毛忍冬皂苷乙峰计算应不低于5000,吸取上述两种溶液各10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,供试品色谱中,不得呈现与对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰;
作为优化,所述的含量测定是通过测定连翘苷和盐酸小檗碱的含量确定成品中连翘、黄柏的含量:
A.连翘
采用高效液相色谱法测定;
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈:水=25:75的混合溶液为流动相;检测波长为278nm;理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000;
对照品溶液的制备:取连翘苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含50μg连翘苷的溶液,即得;
供试品溶液的制备:精密量取复方黄柏液5ml,置10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
B.黄柏
采用高效液相法测定;
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈:0.033mol/L磷酸二氢钾溶液=35:65的混合溶液为流动相;检测波长为347nm;理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于3000;
对照品溶液的制备:取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含8μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:精密量取复方黄柏液3ml,置10ml量瓶中,加甲醇5ml,置60℃水浴中保温15分钟,取出,超声处理(功率500W,频率40kHz)30分钟,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
作为优化,所述的中性氧化铝柱内径为1cm,容量为6g,氧化铝为100~200目。
本发明的有益效果是:与现有技术相比,本发明的一种复方黄柏液的质量检测方法,包括连翘、黄柏、金银花和蒲公英的鉴别;山银花的检查;连翘苷和盐酸小檗碱的含量测定。经过实验研究,本发明的质量检测方法中的鉴别方法在供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,均显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。本发明的山银花检查方法使用高效液相色谱法进行检查,结果表明,该方法特异性好,可以区分复方黄柏液样品的金银花投料情况。用本发明所述的含量测定方法测定复方黄柏液中的连翘苷和盐酸小檗碱的含量,结果表明,该方法线性关系良好,回收率试验准确度较高,具有极好的重复性和稳定性,可以准确、严密地检测复方黄柏液的质量。
具体实施方式
实施例1:
一种复方黄柏液,其原料组成为:
连翘       80重量份       黄柏40重量份
金银花     40重量份       蒲公英40重量份
蜈蚣       2.4重量份 。
一种复方黄柏液的制备方法,包括以下步骤:
(1)按重量组分称取处方中的五味中药,加水煎煮提取三次,第一次1小时,第二次45分钟,第三次30分钟;
(2)煎液合并,过滤,浓缩滤液至相对密度为1.10~1.15(温度为50℃下测量)的清膏;
(3)加乙醇使含乙醇量达70%,静置24小时,过滤,滤液减压浓缩至无乙醇,得清液备用;
(4)将步骤3所得的清液加水,搅匀,静置,冷藏24小时,滤过,灌装,灭菌,即得。
一种复方黄柏液的质量检测方法,包括鉴别、检查、含量测定三部分。所述的鉴别包括连翘、黄柏、金银花、蒲公英四种药材成分的鉴别:
A.连翘
取复方黄柏制剂40ml,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次40ml;合并正丁醇提取液,用氨试液40ml洗涤;分取正丁醇液,回收溶剂至干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。
取连翘对照药材1g,加水40ml,煎煮30分钟,过滤;滤液用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次40ml,合并正丁醇提取液,用氨试液40ml洗涤;分取正丁醇液,回收溶剂至干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为对照药材溶液。
取连翘苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg连翘苷的溶液,作为对照品溶液。
薄层色谱法试验:吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷:丙酮:甲醇:甲酸=12∶2.5∶2∶0.2的混合溶液为展开剂展开,取出,晾干;喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰;在日光下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
B.黄柏
取复方黄柏制剂40ml,加在中性氧化铝柱中,用1%醋酸甲醇溶液50ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇2ml使溶解,作为供试品溶液;所述中性氧化铝柱内径为1cm,容量为6g,氧化铝为100~200目。
取黄柏对照药材0.1g,加入1%醋酸甲醇溶液20ml,于60℃温度下超声处理20分钟,滤过,滤液浓缩至2ml,作为对照药材溶液。
取盐酸黄柏碱对照品,加甲醇制成每1ml含0.5mg盐酸黄柏碱的溶液,作为对照品溶液。
薄层色谱法试验:吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷:甲醇:水=30:15:4的下层溶液为展开剂,置氨蒸汽饱和的展开缸内,展开,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾试液;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
C.金银花、蒲公英
取复方黄柏制剂40ml,用乙酸乙酯振摇提取2次,每次40ml,合并乙酸乙酯提取液,回收溶剂至干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。
取金银花对照药材、蒲公英对照药材各1g,分别加水40ml,煎煮30分钟,滤过;用乙酸乙酯振摇提取2次,每次40ml,合并乙酸乙酯提取液,回收溶剂至干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为两组对照药材溶液。
薄层色谱法试验:吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸丁酯:甲酸:水=14∶5∶5的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,在紫外光(365nm)下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
检查:通过检查是否含有山银花特有成分灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙,确定复方黄柏液是否采用山银花代替金银花投料:
精密量取复方黄柏制剂5ml,置于10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,作为供试品溶液。
取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品和川续断皂苷乙对照品,加50%甲醇制成每1ml含灰毡毛忍冬皂苷乙与川续断皂苷乙各0.2mg的混合溶液,作为对照品溶液。
高效液相色谱法试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以水为流动相A,以乙腈为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;用蒸发光散射检测器检测,理论板数按灰毡毛忍冬皂苷乙峰计算应不低于5000,吸取上述两种溶液各10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,供试品色谱中,不得呈现与对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰。
时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%)
0~12 20→28 80→72
12~27 28→33 72→67
27~30 33 67
30~33 33→20 67→80
33~40 20 80
含量测定:通过测定连翘苷和盐酸小檗碱的含量确定成品中连翘、黄柏的含量。
A.连翘
采用高效液相色谱法测定。
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈:水=25:75的混合溶液为流动相;检测波长为278nm;理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备:取连翘苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.1mg连翘苷的溶液,即得。
供试品溶液的制备:精密量取复方黄柏制剂5ml,置10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
复方黄柏制剂每1ml含连翘以连翘苷(C27H34O11)计,不得少于60μg。
B.黄柏
采用高效液相法测定。
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈:0.033mol/L磷酸二氢钾溶液=35:65的混合溶液为流动相;检测波长为347nm;理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备:取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含8μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备:精密量取复方黄柏制剂3ml,置10ml量瓶中,加甲醇5ml,置60℃水浴中保温15分钟,取出,超声处理(功率500W,频率40kHz)30分钟,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
复方黄柏制剂每1ml含黄柏以盐酸小檗碱(C20H17NO4﹒HCl)计,不得少于15.0μg。
下面结合实验例,对本发明的检测方法及检测参数的取得做进一步说明:
实验例1:对各种原料药鉴别方法的研究实验
按照复方黄柏制剂的标准制备复方黄柏制剂,分别对其中的各种原料药的鉴别方法进行试验,实验依据及结果如下:
1、参考现有复方黄柏制剂标准对连翘进行鉴别试验,结果表明三批样品中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,但对照药材色谱斑点不清晰,且连翘苷对照品没有展开。故不作为本发明复方黄柏制剂质量检测方法中的一部分。
2、参考《中国药典》2010年版一部第一增补本“小儿退热合剂”中连翘的薄层色谱鉴别方法对连翘试验,结果表明三批样品和阴性对照色谱中,在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上,均显相同颜色的斑点;阴性对照无干扰。故作为本发明复方黄柏制剂质量检测方法中的一部分。
3、参考《中国药典》2010年版一部黄柏质量标准对黄柏试验,结果表明三批供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,未见相同颜色的斑点。故不作为本发明复方黄柏制剂质量检测方法中的一部分。
4、参考文献对金银花、蒲公英同时试验,结果表明三批样品和阴性对照色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,均显相同颜色的斑点;阴性对照无干扰。故作为本发明复方黄柏制剂质量检测方法中的一部分。
实验例2:HPLC法检查复方黄柏制剂原料是否采用了山银花
1.仪器、试药和供试样品
仪器,高效液相色谱仪:Agilent 1200 高效液相色谱仪(ELSD检测器);Sartorius CP225D电子天平。
对照药材:金银花,山银花。
对照品:灰毡毛忍冬皂苷乙对照品,川续断皂苷乙对照品。
样品:复方黄柏液。
2.流动相的选择
参考《中国药典》2015年版“多来源中药材在中成药中专属性检测方法的研究与标准制定”课题中山银花的检查方法,拟选用乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,在此条件下分离度良好。
3.对照品溶液的制备
精密称取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品13.64mg,置25ml容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为灰毡毛忍冬皂苷乙对照品储存液。精密称取川续断皂苷乙对照品11.43mg,置25ml容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为川续断皂苷乙对照品储备液。分别取上述两种对照品储备液各5ml,混匀,即得到灰毡毛忍冬皂苷乙浓度为0.2532mg/ml、川续断皂苷乙浓度为0.2135mg/ml的混合对照品溶液。
4.对照药材溶液的制备
分别取金银花、山银花对照药材粉末(过四号筛)各0.5g,精密称定,置50ml容量瓶中,加50%甲醇适量,超声处理40分钟,放冷,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,作为金银花、山银花对照药材溶液。
5.供试品溶液的制备    
精密量取复方黄柏液5ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀释至满刻度,混匀,作为供试品溶液。
6.耐用性试验
在上述色谱条件下,选择3种不同型号色谱柱进行耐用性考察,三种色谱柱分别为依利特Hypersil BDS C18 5μm、4.6×250mm,Thermo BDS C18 5μm、250×4.6mm,Kromasil 100-5C18、250×4.6mm。结果表明,测定时,对称因子、理论板数等均能基本符合对高效液相色谱分析的有关要求,对色谱柱选择性不强,适用范围广。
7.标准曲线的制备和线性关系的考察     
精密量取混合对照品溶液(灰毡毛忍冬皂苷乙浓度为0.2532mg/ml、川续断皂苷乙浓度为0.2135mg/ml)3μl、5μl、10μl、15μl、20μl,注入液相色谱仪,分别测定峰面积积分值。以对照品进样量的自然对数为横坐标,峰面积积分值的自然对数为纵坐标,进行线性回归,得回归方程,灰毡毛忍冬皂苷乙:回归方程y = 1.7200x + 4.4571,相关系数:r=0.9999。川续断皂苷乙:回归方程y = 1.7568x + 4.4695,相关系数:r=0.9999。结果表明:灰毡毛忍冬皂苷乙进样量在0.7596~5.0640μg之间、川续断皂苷乙进样量在0.6405~4.2700μg之间,其自然对数与峰面积积分值自然对数均呈良好的线性关系。
8.精密度试验  
精密吸取混合对照品溶液(灰毡毛忍冬皂苷乙浓度为0.2532mg/ml、川续断皂苷乙浓度为0.2135mg/ml)20μl,注入液相色谱仪,连续进样6次,测其峰面积,取自然对数并计算相对标准偏差,RSD=0.34%。结果表明,仪器精密度良好。
9.稳定性试验  
供试品溶液制备完成后,精密吸取10μl,注入液相色谱仪,记录峰面积,以后每隔2小时测定一次,考察8小时,计算峰面积的相对标准偏差,RSD=0.90%。结果表明:供试品中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙在8小时内测定结果稳定。
10.检测限和定量限考察
分别配制合适浓度的对照品溶液,精密吸取10μl,注入液相色谱仪,观察其峰高与基线噪音的比值,计算检测限与定量限。灰毡毛忍冬皂苷乙的检测限为0.0253mg/ml,定量限为0.0506mg/ml。川续断皂苷乙的检测限为0.0214mg/ml,定量限为0.0427mg/ml。
11.重复性试验   
取复方黄柏制剂,重复测定6次,计算样品中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量。结果灰毡毛忍冬皂苷乙平均含量为:0.1287mg/ml,RSD=1.78%;川续断皂苷乙平均含量为:0.1327mg/ml,RSD=1.14%。表明分析方法重复性良好。
12.加样回收率试验   
精密量取复方黄柏制剂5ml,精密加入混合对照品溶液(灰毡毛忍冬皂苷乙浓度为0.2532mg/ml、川续断皂苷乙浓度为0.2135mg/ml)5ml,摇匀,制成供试品溶液,平行制备6份。精密吸取混合对照品溶液5μl、20μl及上述供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定其含量,计算回收率,结果如下。灰毡毛忍冬皂苷乙平均回收率为98.31%,RSD=1.78%;川续断皂苷乙平均回收率为98.28%,RSD=1.14%。表明该方法的回收率良好。
 回收率试验结果
13.专属性  
阳性对照溶液的制备:取山银花药材1g,加50%甲醇25ml,超声处理(功率500W、频率40kHz)20分钟,滤过,滤液作为山银花阳性对照溶液。取金银花药材1g,加50%甲醇25ml,超声处理(功率500W,频率40kHz)20分钟,滤过,滤液作为金银花阳性对照溶液。
分别吸取对照品溶液、山银花阳性对照溶液、金银花阳性对照溶液及供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定。结果表明,山银花阳性对照色谱图中,呈现与灰毡毛忍冬皂苷乙对照品和川续断皂苷乙对照品保留时间相同的色谱峰;而金银花阳性对照色谱图中,未呈现与灰毡毛忍冬皂苷乙对照品和川续断皂苷乙对照品保留时间相同的色谱峰;供试品中亦无相应色谱峰。表明该方法可以区分复方黄柏制剂样品的金银花投料情况。
14.样品测定  
 取复方黄柏液3批,测定灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量,结果表明三批样品中,灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙均低于检出限。
实验例3:HPLC法测定复方黄柏液中连翘苷的含量
1.仪器、试药和供试样品
仪器:高效液相色谱仪(岛津LC-20A高效液相色谱仪);二极管阵列检测器;Sartorius CP225D电子天平。
对照品:连翘苷对照品。
样品:复方黄柏液。
2.色谱条件的选择
参考《中国药典》2010版一部双黄连口服液中连翘苷的含量测定条件,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈:水=25:75混合液为流动相,检测波长为278nm,流速1ml/min,柱温35℃,在此条件下,连翘苷与其它相邻峰分离度较大,峰形较好。
3.色谱柱的考察及最低理论板数的确定
在上述色谱条件下,选择3种不同型号色谱柱进行耐用性考察,三种色谱柱分别为依利特C18 5μm、4.6×250mm;Diamonsil C18 5μm、250×4.6mm;Kromasil C18、250×4.6mm。结果表明,测定时,对称因子、理论板数等均能基本符合对高效液相色谱分析的有关要求,对色谱柱选择性不强,适用范围广,根据上述测定结果,确定理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000。
4.对照品溶液的制备
精密称取连翘苷对照品23.27mg(含量以96.8%计),置25ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,再精密量取3ml,置50ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得到浓度为0.05406mg/ml对照品溶液。
5.供试品溶液的制备    
精密量取复方黄柏液5ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
6.标准曲线的制备和线性关系的考察     
精密量取连翘苷对照品溶液(浓度为0.05406mg/ml)1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl,注入液相色谱仪,分别测定峰面积积分值。以对照品的进样量为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,进行线性回归,得回归方程:y = 1101191.42x +2627.40,相关系数:R=1.0000。结果表明:连翘苷进样量在0.05406~1.0812μg之间,连翘苷的进样量与峰面积积分值线性关系良好。
7.精密度试验  
精密吸取连翘苷对照品溶液(浓度为0.05406mg/ml)10μl,注入液相色谱仪,连续进样6次,测定峰面积并计算相对标准偏差,RSD=0.51%。结果表明,仪器精密度良好。
8.稳定性试验  
精密吸取供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,每隔3小时测定一次,测定连翘苷的峰面积积分值,共考察15小时,计算相对标准偏差,RSD=0.38%。结果表明:供试品中连翘苷在15小时内稳定性良好,能够满足测定需要。
9.重复性试验   
取复方黄柏液,按照供试品溶液的制备方法,平行制备6份样品,按上述方法和条件进行测定。结果连翘苷平均含量为:88.18μg/ml,RSD=0.43%。表明分析方法重复性良好。
10.回收率试验   
精密量取同一复方黄柏液样品2.5ml共6份,置10ml量瓶中,精密加入连翘苷对照品(浓度为0.05406mg/ml)5ml,加甲醇至满刻度,摇匀,测定其含量,计算回收率,结果如下。连翘苷平均回收率为97.22%,RSD=0.30%。表明该测定方法的回收率良好。
回收率试验结果
11.专属性试验   
阴性对照溶液的制备:取处方中除去连翘的其他药味,按制备工艺制得阴性样品,按上述“供试品溶液的制备”制得缺连翘阴性对照溶液。
取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各10μl,注入液相色谱仪中进行测定。结果显示供试品色谱中,在与对照品色谱相应的保留时间处,有一色谱峰,而阴性对照溶液色谱图中无相应色谱峰。说明处方中其他药味对测定结果无干扰。
12.样品测定  
 取复方黄柏液3批,测定并计算连翘苷含量,结果如下。
复方黄柏液样品含量测定结果
批号 含量(μg/ml)
1307241 94.7
1307261 85.3
1307281 80.3
1306171 91.1
1306141 88.1
1303161 95.3
实验例4:HPLC法测定复方黄柏液中盐酸小檗碱的含量
1.仪器、试药和供试样品
仪器:高效液相色谱仪(岛津LC-20A高效液相色谱仪)二极管阵列检测器;Sartorius CP225D电子天平。
对照品:盐酸小檗碱对照品。
样品:复方黄柏液。   
2.流动相选择  
参考《中国药典》2005年版一部复方黄连素片中盐酸小檗碱的含量测定条件,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾(35:65)为流动相;流速1ml/min,柱温35℃。
3.检测波长确定
取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含8.923μg的溶液,在200~500nm波长范围内进行紫外扫描,结果显示岩白菜素在264nm和347nm波长处有最大吸收,再分别以264nm、347nm作为检测波长进行样品测定,结果显示当检测波长为347nm时,供试品色谱图中盐酸小檗碱前后无干扰峰,易于积分定量;检测波长为264nm时,盐酸小檗碱峰前有干扰色谱峰,不能达到完全的基线分离,故将检测波长确定为347nm。
4.色谱柱的考察及最低理论板数的确定
在上述色谱条件下,选择3种不同型号色谱柱进行耐用性考察,三种色谱柱分别为Kromasil C18 5μm、4.6×250mm;Diamonsil C18 5μm、250×4.6mm;InerstilODS-VP C18、250×4.6mm。结果表明测定时对称因子、理论板数等均能基本符合对高效液相色谱分析的有关要求,对色谱柱选择性不强,适用范围广,根据上述测定结果,确定理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000。
5.对照品溶液的制备
精密称取盐酸小檗碱对照品12.85mg(含量以86.8%计),置100ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,再精密量取2ml,置25ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得到浓度为0.008923mg/ml对照品溶液。
6.供试品溶液的制备  
精密量取复方黄柏液3ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,置60℃水浴中保温15分钟,取出,再超声(功率500W,频率40kHz)处理30分钟,滤过,取续滤液,即得。
7.系统适用性试验及阴性干扰的考察
阴性对照溶液的制备:取处方中除去黄柏的其他药味,按制备工艺制得阴性样品,按上述“供试品溶液的制备”制得缺黄柏阴性对照溶液。
取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各10μl,注入液相色谱仪中进行测定。结果显示供试品色谱中,在与对照品色谱相应的保留时间处,有一色谱峰,而阴性对照溶液色谱图中无相应色谱峰。说明处方中其他药味对测定结果无干扰。
8.线性试验 
精密量取盐酸小檗碱对照品溶液(浓度为0.008923mg/ml)1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl,注入液相色谱仪,分别测定峰面积积分值。以对照品的进样量为横坐标,以峰面积积分值为纵坐标,进行线性回归。得回归方程为:y=4426992.24x-1689.62相关系数R=1.0000。结果表明盐酸小檗碱进样量在0.008923~0.17846μg之间与峰面积积分值的线性关系良好。
9.精密度试验
精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液(浓度为0.008923mg/ml)10μl,注入液相色谱仪,连续进样6次进行测定,测定峰面积并计算相对标准偏差,RSD=0.81%。结果表明,仪器精密度良好。
10.稳定性试验  
精密吸取供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,每隔3小时测定一次,测定盐酸小檗碱的峰面积积分值,共考察15小时,计算相对标准偏差,RSD=0.94%。结果表明:供试品中盐酸小檗碱在15小时内稳定性良好,能够满足测定需要。
11.重复性试验   
取复方黄柏液,按照供试品溶液的制备方法,平行制备6份样品,按上述方法和条件进行测定。结果盐酸小檗碱平均含量为:26.52μg/ml,RSD=1.09%。表明分析方法重复性良好。
12.回收率试验  
精密量取同一复方黄柏液样品1.5ml共6份,置10ml量瓶中,精密加入盐酸小檗碱对照品(浓度为0.008923mg/ml)4ml,加甲醇至刻度,置60℃水浴中保温15分钟,取出,再超声(功率500W,频率40kHz)处理30分钟,滤过,取续滤液,测定其含量,计算回收率,结果如下。盐酸小檗碱平均回收率为98.52%,RSD=0.74%。表明该测定方法的回收率良好。
 盐酸小檗碱含量测定回收率试验结果
13.样品含量测定
取复方黄柏液6批,测定并计算盐酸小檗碱含量,结果如下表。
样品含量测定结果
批号 含量(μg /ml)
1307241 22.3
1307261 26.3
1307281 19.7
1306171 25.7
1306141 21.0
1303161 15.2

Claims (9)

1.一种复方黄柏液,其特征在于,其原料组成为:
连翘       80±10重量份       黄柏40±5重量份
金银花     40±5重量份        蒲公英40±5重量份
蜈蚣       2.4±0.3重量份。
2.根据权利要求1所述的一种复方黄柏液,其特征在于,所述复方黄柏液的原料组成为:
连翘       80重量份       黄柏40重量份
金银花     40重量份       蒲公英40重量份
蜈蚣       2.4重量份 。
3.一种复方黄柏液的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)按重量组分称取处方中的五味中药,加水煎煮提取三次;
(2)煎液合并,过滤,浓缩滤液;
(3)加入乙醇,静置,过滤,滤液回收乙醇至无味,得清液备用;
(4)将步骤(3)所得的清液加水定容,搅匀,静置,冷藏,即得。
4.一种复方黄柏液的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)按重量组分称取处方中的五味中药,加水煎煮提取三次,第一次1小时,第二次45分钟,第三次30分钟;
(2)煎液合并,过滤,浓缩滤液至相对密度为1.10~1.15(温度为50℃下测量)的清膏;
(3)加乙醇使含乙醇量达70%,静置24小时,过滤,滤液减压浓缩至无乙醇,得清液备用;
(4)将步骤3所得的清液加水至1000重量份,搅匀,静置,冷藏24小时,滤过,灌装,灭菌,即得。
5.一种复方黄柏液的质量检测方法,其特征在于:包括鉴别、检查、含量测定三部分。
6.根据权利要求5所述的一种复方黄柏液的质量检测方法,其特征在于:所述的鉴别包括连翘、黄柏、金银花、蒲公英四种药材成分的鉴别,
A、连翘:
取复方黄柏液40ml,用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次40ml;合并正丁醇提取液,用氨试液40ml洗涤;分取正丁醇液,回收溶剂至干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;
取连翘对照药材1g,加水40ml,煎煮30分钟,过滤;滤液用水饱和的正丁醇振摇提取2次,每次40ml,合并正丁醇提取液,用氨试液40ml洗涤;分取正丁醇液,回收溶剂至干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为对照药材溶液;
取连翘苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg连翘苷的溶液,作为对照品溶液;
薄层色谱法试验:吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷:丙酮:甲醇:甲酸=12∶2.5∶2∶0.2的混合溶液为展开剂展开,取出,晾干;喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰;在日光下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
B.黄柏
取复方黄柏制剂40ml,加在中性氧化铝柱中,用1%醋酸甲醇溶液50ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇2ml使溶解,作为供试品溶液;
取黄柏对照药材0.1g,加入1%醋酸甲醇溶液20ml,于60℃温度下超声处理20分钟,滤过,滤液浓缩至2ml,作为对照药材溶液;
取盐酸黄柏碱对照品,加甲醇制成每1ml含0.5mg盐酸黄柏碱的溶液,作为对照品溶液;
薄层色谱法试验:吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷:甲醇:水=30:15:4的下层溶液为展开剂,置氨蒸汽饱和的展开缸内,展开,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾试液;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
C.金银花、蒲公英
取复方黄柏制剂40ml,用乙酸乙酯振摇提取2次,每次40ml,合并乙酸乙酯提取液,回收溶剂至干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;
取金银花对照药材、蒲公英对照药材各1g,分别加水40ml,煎煮30分钟,滤过;滤液用乙酸乙酯振摇提取2次,每次40ml,合并乙酸乙酯提取液,回收溶剂至干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为两组对照药材溶液;
薄层色谱法试验:吸取上述三种溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸丁酯:甲酸:水=14∶5∶5的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,在紫外光(365nm)下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
7.根据权利要求5所述的一种复方黄柏液的质量检测方法,其特征在于:所述的检查是通过检查是否含有山银花特有成分灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙,确定复方黄柏液是否采用山银花代替金银花投料:
精密量取复方黄柏液5ml,置于10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,作为供试品溶液;
取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品和川续断皂苷乙对照品,加50%甲醇制成每1ml含灰毡毛忍冬皂苷乙与川续断皂苷乙各0.2mg的混合溶液,作为对照品溶液;
高效液相色谱法试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以水为流动相A,以乙腈为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;用蒸发光散射检测器检测,理论板数按灰毡毛忍冬皂苷乙峰计算应不低于5000,吸取上述两种溶液各10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,供试品色谱中,不得呈现与对照品色谱峰保留时间相对应的色谱峰;
时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%) 0~12 20→28 80→72 12~27 28→33 72→67 27~30 33 67 30~33 33→20 67→80 33~40 20 80
 。
8.根据权利要求5所述的一种复方黄柏液的质量检测方法,其特征在于,所述的含量测定是通过测定连翘苷和盐酸小檗碱的含量确定成品中连翘、黄柏的含量,
A、连翘:
采用高效液相色谱法测定;
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈:水=25:75的混合溶液为流动相;检测波长为278nm;理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000;
对照品溶液的制备:取连翘苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含50μg连翘苷的溶液,即得;
供试品溶液的制备:精密量取复方黄柏液5ml,置10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
B.黄柏
采用高效液相法测定;
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈:0.033mol/L磷酸二氢钾溶液=35:65的混合溶液为流动相;检测波长为347nm;理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于3000;
对照品溶液的制备:取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含8μg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:精密量取复方黄柏液3ml,置10ml量瓶中,加甲醇5ml,置60℃水浴中保温15分钟,取出,超声处理(功率500W,频率40kHz)30分钟,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
9.根据权利要求5至8中任一权利要求所述的一种复方黄柏液的质量检测方法,其特征在于:所述的中性氧化铝柱内径为1cm,容量为6g,氧化铝为100~200目。
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