CN104345115B - 一种抗骨增生片的定性定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗骨增生片的定性定量检测方法，增加了：（1）采用薄层色谱法，以柚皮苷为对照，鉴别抗骨增生片中含有骨碎补；以鸡血藤对照药材为对照，鉴别抗骨增生片中含有鸡血藤；以淫羊藿苷为对照，鉴别抗骨增生片中含有淫羊藿；（2）采用高效液相色谱法测定抗骨增生片中淫羊藿苷的含量。与现有技术相比，本发明方法，既增加了定性鉴别方法又增加了有效成份的含量测定方法，修订后的质量标准，提高了药品的质量控制水平，确保了人们用药的安全性和有效性。本发明的抗骨增生片的定性定量检测方法，既可以用于控制抗骨增生片的质量，又可以用来控制相同处方的其他剂型如胶囊、颗粒、丸剂等剂型的质量。

Description

一种抗骨增生片的定性定量检测方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种抗骨增生片的质量控制方法。

背景技术

抗骨增生片由熟地黄、鹿衔草、骨碎补、鸡血藤、淫羊藿、肉苁蓉、莱菔子组成，具有补肾，活血、止痛之功效，用于肥大性脊椎炎，颈椎病，跟骨刺，增生性关节炎，大骨节病。该产品的质量标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第7册，标准编号WS₃-B-1338-93，该标准中仅有鸡血藤显微鉴别方法，没有任何定性定量检测方法，不利于控制抗骨增生片的产品质量。现代食品与药品杂志2006年第16卷第2期《抗骨增生片质量标准研究》记载了抗骨增生片质量控制方法，对骨碎补、鸡血藤进行了定性鉴别，对淫羊藿苷进行了含量测定，其定性方法操作复杂且所用试剂毒性较大。海峡药学2007年第19卷第6期《抗骨增生片的质量标准研究》记载了抗骨增生片质量检测方法，对肉苁蓉、淫羊藿进行了定性鉴别，对淫羊藿苷进行了含量测定，其质控方法操作繁琐。中国实验方剂学杂志第12卷第7期《抗骨增生丸的定性定量方法研究》记载了抗骨增生丸定性定量检测方法，对鸡血藤、骨碎补进行了定性鉴别，对淫羊藿苷和松果菊苷进行了含量测定，其定性方法操作复杂且所用试剂毒性较大。现有质量标准不能有效的控制抗骨增生片的质量，从而将影响该产品的质量水平及其临床疗效。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种抗骨增生片的定性定量检测方法。本发明针对现有控制标准的不足，对抗骨增生片的质量控制方法进行了研究，在原部颁标准的基础上增加了：（1）采用薄层色谱法，以柚皮苷为对照，鉴别抗骨增生片中含有骨碎补；以鸡血藤对照药材为对照，鉴别抗骨增生片中含有鸡血藤；以淫羊藿苷为对照，鉴别抗骨增生片中含有淫羊藿；（2）采用高效液相色谱法测定抗骨增生片中淫羊藿苷的含量，本发明方法提高了抗骨增生片的质量控制水平，从而保证了该药品的质量和临床疗效。

本发明是这样实现的：

一种抗骨增生片的定性定量检测方法，包括鸡血藤的显微鉴别，还包括：①薄层色谱法，以柚皮苷为对照，鉴别抗骨增生片中含有骨碎补；以鸡血藤对照药材为对照，鉴别抗骨增生片中含有鸡血藤；以淫羊藿苷为对照，鉴别抗骨增生片中含有淫羊藿；②采用高效液相色谱法测定抗骨增生片中淫羊藿苷的含量，所述定性定量检测方法包含如下步骤：

（1）取本品，置显微镜下观察：石细胞圆形或椭圆形、长方形或多角形，壁厚，胞腔含橙红色或棕色物。

（2）取本品，研细，加石油醚（60～90℃），加热回流，放冷，滤过，滤液备用。残渣加乙酸乙酯，加热回流，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿苷和柚皮苷对照品，分别加甲醇制成溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各5~10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水=5~15∶0.5~1.5∶0.5~1.5∶0.5~1.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（3）取上述石油醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯使溶解，作为供试品溶液；另取鸡血藤对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各5~20µl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯=9.5~28.5∶2.5~7.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯（365nm）下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（4） 含量测定： 照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05~0.3%甲酸溶液=20~35∶80~65为流动相；检测波长为260~280nm；流速为0.5~1.0mL/min；柱温25~35℃；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含60µg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品5~20片，研细，取约0.5~2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%~95%乙醇，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz），放冷，再称定重量，用50%~95%乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本品每片含淫羊藿以淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅)计不得少于0.34mg。

为更好的实现本发明，所述抗骨增生片的定性定量检测方法，可进一步优化为：

（1）取本品，置显微镜下观察：石细胞圆形或椭圆形、长方形或多角形，壁厚，胞腔含橙红色或棕色物。

（2）取本品10~30片，研细，加石油醚（60～90℃）20~80ml，加热回流0.5~2小时，放冷，滤过，滤液备用。残渣加乙酸乙酯20~80ml，加热回流0.5~2小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5~2ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿苷和柚皮苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5~10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水=5~15∶0.5~1.5∶0.5~1.5∶0.5~1.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（3）取上述石油醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯0.5~2ml使溶解，作为供试品溶液；另取鸡血藤对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各5~20µl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯=9.5~28.5∶2.5~7.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯（365nm）下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（4）含量测定： 照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05~0.3%甲酸溶液(20~35∶80~65)为流动相；检测波长为260~280nm；流速为0.5~1.0mL/min；柱温25~35℃；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含60µg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：取本品5~20片，研细，取约0.5~2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%~95%乙醇20~50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz）30~60分钟，放冷，再称定重量，用50%~95%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本品每片含淫羊藿以淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅)计不得少于0.34mg。

为更好的实现本发明，所述抗骨增生片的定性定量检测方法，可再进一步优化为：

（1）取本品，置显微镜下观察：石细胞圆形或椭圆形、长方形或多角形，壁厚，胞腔含橙红色或棕色物；

（2）取本品20片，研细，加石油醚（60～90℃）30ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液备用。残渣加乙酸乙酯50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿苷和柚皮苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各5µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水=10∶1∶1∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（3）取上述石油醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取鸡血藤对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各10µl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯=19∶5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯（365nm）下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（4）含量测定： 照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%甲酸溶液(28∶72)为流动相；检测波长为270nm；流速为0.8mL/min；柱温30℃；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含60µg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：取本品10片，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本品每片含淫羊藿以淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅)计不得少于0.34mg。

为更好的表明本发明的实质，将本发明的方法学考察详述如下：

1、取本品粉末，用水合氯醛透化后装片，置显微镜下观察：石细胞圆形、长圆形或类多角形，壁厚，胞腔含橙红色或棕色物。见图1。

2、取本品20片，研细，加石油醚（60～90℃）30ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液备用。残渣加乙酸乙酯50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。分别按处方配比称取缺淫羊藿或缺骨碎补的其他药材，分别制成缺淫羊藿或缺骨碎补的阴性样品，同法制成缺淫羊藿或缺骨碎补的阴性对照溶液。另取淫羊藿苷和柚皮苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各5µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(10∶1∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图2、3。

3、取上述石油醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，作为供试品溶液。按处方配比称取缺鸡血藤的其他药材，制成缺鸡血藤的阴性样品，同法制成缺鸡血藤的阴性对照溶液。另取鸡血藤对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各10µl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯（19∶5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图4。

4、含量测定：照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定；

（1）仪器与试药：Waters2695高效液相色谱仪，Waters2998 PDA检测器，Empower2色谱工作站，AY220电子分析天平（日本岛津），CP225D电子分析天平（赛多利斯），KQ300DV超声仪（昆山市超声仪器有限公司），TU-1901紫外-可见分光光度仪（北京普析通用），C18 柱Kromasil ODS-2 ( 250mm ×4.6mm，5µm）；柱温为30℃，检测波长：270nm，流动相：乙腈∶0.1%甲酸溶液（28∶72），流速为0.8ml/min；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

淫羊藿苷：中国药品生物制品检定所提供，含量测定用，批号：110737-200414。

（2）对照品溶液的制备：

取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含60µg的溶液，即得；

（3）流动相的选择

采用高效液相色谱法测定淫羊藿苷的含量时，常用流动相有：①乙腈-水 (27:73）、②乙腈-0.1%甲酸溶液（28:72）。分别以两种流动相试验，所得淫羊藿苷色谱峰的峰对称性均较好，因以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相理论板数高、分离度较好，故选择乙腈-0.1%甲酸溶液（28:72）作为流动相。

（4）测定波长的选择

取淫羊藿苷对照品溶液，置紫外-可见分光光度仪中，于200～400nm波长范围内扫描，结果淫羊藿苷在269.90nm波长处有最大吸收，故选择检测波长为270nm。见图5。

（5）提取溶剂的选择

取本品，研细，取约1g，共8份，精密称定，置具塞锥形瓶中，依次精密加入稀乙醇、70%乙醇、50%甲醇、甲醇各25ml，密塞，称定重量，超声处理（300W，40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定并计算，结果表明，用4种溶剂提取供试品，用70%乙醇、甲醇作为提取溶剂测得含量结果较高，但甲醇相对70%乙醇毒性大，因此，选择70％乙醇为提取溶剂。见表1。

表1 提取溶剂选择结果比较表

（6）提取方法和提取时间的考察

取本品，研细，取约1g，共8份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理（300W，40kHz）15、30、60、90分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

取本品，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，密塞，称定重量，回流提取30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得

测定法 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定，并计算，结果表明，回流提取与超声提取含量测定结果相近，因超声处理方法较简便，故选择超声提取。超声处理30、60分钟含量测定结果较高，因二者测得结果相近，故提取时间选择为30分钟。见表2。

表2 提取方法与时间选择结果比较表

综合上述两个方面的考察结果，供试品溶液的制备方法确定为：取本品10片，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

（7）专属性试验 按处方称取缺淫羊藿的其余各药味适量，制成缺淫羊藿的阴性对照样品，同法制备缺淫羊藿的阴性对照溶液。精密吸取对照品、供试品、阴性对照溶液各10μl，注入高效液相色谱仪。结果：阴性对照的色谱图中，在淫羊藿苷对照品色谱峰的相同保留时间处无色谱峰，说明阴性对照无干扰。见图6、7、8。

（8）精密度试验 精密吸取同一供试品溶液（批号：20110703），进样6次，每次10μl，测定，其淫羊藿苷峰面积积分值的RSD为0.28％，结果表明进样精密度良好。见表3。

表3 精密度试验结果表

（9）稳定性试验 取同一供试品溶液（批号：20110703），精密吸取10μl，分别于0、2、4、6、12、24小时，注入高效液相色谱仪，测定，结果表明：供试品溶液在24小时内稳定。见表4。

表4 稳定性试验结果表

（10）线性关系考察 分别精密吸取浓度为0.3092mg/ml的淫羊藿苷对照品贮备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、10.0ml至25、25、25、10、10、10ml量瓶内，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得系列对照品溶液(0.006184、0.01237、0.02474、0.09276、0.1237、0.3092mg/ml)，精密吸取上述溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标绘制标准曲线。结果表明：淫羊藿苷对照品在0.06184~3.092μg范围内线性关系良好，其回归方程为：Y= 2504541.7915X+37362.2461， r=0.9999，结果见表5、图9。

表5 线性关系考察结果表

（11）重复性试验 取批号为20110703的样品，依法制备6份供试品溶液，测定，结果表明：本方法重复性较好。结果见表6。

表6 重复性试验结果表

（12）检测限 精密吸取浓度为0.006184mg/ml的淫羊藿苷对照品溶液1μl， 注入高效液相色谱仪，测定，信噪比约为3，故检测限为6.184ng。

（13）定量限 精密吸取浓度为0.006184mg/ml的对照品溶液3μl， 注入高效液相色谱仪，测定，信噪比约为10，故定量限为18.55ng。测定6次，其峰面积积分值RSD为1.30%，见表7。

表7 定量限试验结果表

（14）加样回收率试验 取已测定含量（2.082mg/g）的样品（批号：20110703）取约0.5g，取6份，精密称定，精密加入浓度为0.04540mg/ml的淫羊藿苷对照品25ml，依法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，进样量10μl ，计算回收率，结果表明，本法回收率良好。结果见表8。

表8 回收率试验结果表

（15）耐用性考察 采用拟定的方法，采用不同型号的仪器与2个不同品牌的色谱柱对同一批样品进行淫羊藿苷含量测定，结果表明，本方法耐用性良好。见表9、10。

表9 仪器及色谱柱型号

表10 耐用性试验结果表

（16）样品含量测定

对10批次抗骨增生片进行含量测定，结果见表11。

表11 抗骨增生片中淫羊藿苷含量测定结果

本品每片含淫羊藿以淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅)计不得少于0.34mg。

本发明的有益效果是：

（1）本发明对抗骨增生片的质量标准进行了提高，增加了骨碎补、鸡血藤和淫羊藿等3种药味的定性鉴别，进行了淫羊藿苷的含量测定，其中定性方法和定量方法操作简便且所用试剂毒性均较小，骨碎补和淫羊藿鉴别方法一致，鸡血藤鉴别中供试品的制备方法是骨碎补和淫羊藿供试品制备方法的一部分。

（2）本发明所提供的定性定量检测方法提高了清肝片的质量标准，提高了药品的质量控制水平，从而保证了其临床疗效。

（3）本发明提供的抗骨增生片的定性定量检测方法，既可以用于控制抗骨增生片的质量，又可以用来控制相同处方的其他剂型如胶囊、颗粒、丸剂等剂型的质量。

附图说明:

图1是本发明的抗骨增生片中鸡血藤显微鉴别图；

图2是本发明的抗骨增生片中淫羊藿苷的薄层鉴别图；

图3是本发明的抗骨增生片中柚皮苷的薄层鉴别图；

图4是本发明的抗骨增生片中鸡血藤的薄层鉴别图；

图5是淫羊藿苷紫外光谱图；

图6是淫羊藿苷对照品的高效液相色谱图；

图7是本发明的淫羊藿苷含量测定抗骨增生片样品的高效液相色谱图；

图8是本发明的抗骨增生片缺淫羊藿阴性对照溶液高效液相色谱图；

图9是本发明的淫羊藿苷线性关系图；

具体实施方式

实施例1

抗骨增生片：批号20120318

（1）取本品，置显微镜下观察：石细胞圆形或椭圆形、长方形或多角形，壁厚，胞腔含橙红色或棕色物；

（2）取本品10片，研细，加石油醚（60～90℃）20ml，加热回流0.5小时，放冷，滤过，滤液备用；残渣加乙酸乙酯20ml，加热回流0.5小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿苷和柚皮苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水=5∶0.5∶0.5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视；；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（3）取步骤（2）项下石油醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取鸡血藤对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各5µl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯=9.5∶2.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯（365nm）下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（4）含量测定： 照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05%甲酸溶液(35∶65)为流动相；检测波长为260nm；流速为0.5mL/min；柱温25℃；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含60µg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：取本品5片，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇20ml，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz）45分钟，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

含量测定结果：本批次抗骨增生片每片含淫羊藿以淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅)计为0.41mg。

实施例2

抗骨增生片：批号20120612

（1）取本品，置显微镜下观察：石细胞圆形或椭圆形、长方形或多角形，壁厚，胞腔含橙红色或棕色物；

（2）取本品20片，研细，加石油醚（60～90℃）30ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液备用；残渣加乙酸乙酯50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿苷和柚皮苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各5µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水=10∶1∶1∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视；；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（3）取步骤（2）项下石油醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；另取鸡血藤对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各10µl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯=19∶5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯（365nm）下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（4）含量测定： 照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%甲酸溶液(28∶72)为流动相；检测波长为270nm；流速为0.8mL/min；柱温30℃；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含60µg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：取本品10片，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

含量测定结果：本批次抗骨增生片每片含淫羊藿以淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅)计为0.43mg。

实施例3

抗骨增生片：批号20120714

（1）取本品，置显微镜下观察：石细胞圆形或椭圆形、长方形或多角形，壁厚，胞腔含橙红色或棕色物；

（2）取本品30片，研细，加石油醚（60～90℃）80ml，加热回流2小时，放冷，滤过，滤液备用；残渣加乙酸乙酯80ml，加热回流2小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿苷和柚皮苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各5µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水=15∶1.5∶1.5∶1.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视；；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（3）取步骤（2）项下石油醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；另取鸡血藤对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各20µl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯=28.5∶7.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯（365nm）下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（4）含量测定： 照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.3%甲酸溶液(20∶80)为流动相；检测波长为280nm；流速为1.0mL/min；柱温35℃；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含60µg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：取本品20片，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz）60分钟，放冷，再称定重量，用95%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

含量测定结果：本批次抗骨增生片每片含淫羊藿以淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅)计为0.44mg。

Claims (1)

1.一种抗骨增生片的定性定量检测方法，包括鸡血藤的显微鉴别，其特征在于还包括：①薄层色谱法，以柚皮苷为对照，鉴别抗骨增生片中含有骨碎补；以鸡血藤对照药材为对照，鉴别抗骨增生片中含有鸡血藤；以淫羊藿苷为对照，鉴别抗骨增生片中含有淫羊藿；②采用高效液相色谱法测定抗骨增生片中淫羊藿苷的含量，所述定性定量检测方法包括如下步骤：

(1)取本品，置显微镜下观察：石细胞圆形或椭圆形、长方形或多角形，壁厚，胞腔含橙红色或棕色物；

(2)取本品20片，研细，加沸程为60～90℃的石油醚30ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液备用；残渣加乙酸乙酯50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取淫羊藿苷和柚皮苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB的薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水＝10∶1∶1∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(3)取步骤(2)项下石油醚提取液，挥干，残渣加乙酸乙酯0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取鸡血藤对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照中国药典2010年版一部附录ⅥB的薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以沸程为30～60℃的石油醚-乙酸乙酯＝19∶5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(4)含量测定：照中国药典2010年版一部附录ⅥD的高效液相色谱法测定；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％甲酸溶液＝28∶72为流动相；检测波长为270nm；流速为0.8mL/min；柱温30℃；理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加70％乙醇制成每1ml含60μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：取本品10片，研细，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，超声功率300W，超声频率40kHz，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本品每片含淫羊藿以淫羊藿苷C₃₃H₄₀O₁₅计不得少于0.34mg。