一种治疗糖尿病视网膜病变的中药组合物的质量检测方法
技术领域
本发明属于药学和分析化学领域,具体涉及一种治疗糖尿病视网膜病变的中药组合物的质量检测方法。
背景技术
糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,简称DR),是糖尿病严重而常见的眼部并发症之一。随着糖尿病病程的延长,DR的发生率亦随之增高。病程8年以上者中,糖尿病视网膜病变发生率约为50%。该病早期症状不明显,易被忽视,晚期又没有特效的控制方法,疾病缠绵,顽固难治。本病失治,后果严重,是导致成人失明的主要原因,致盲率高达8-12%,对患病人群的生活质量造成了严重不良影响。因此,DR的防治已成为当今医学领域急需解决的重大攻关课题,日益受到国内外医学界和医药工作者的高度重视。
在申请人早前的一件名为“一种治疗早期糖尿病视网膜病变的中药制剂”专利中(专利号ZL200610087540.3,授权公告日2009年9月16日),公开了一种治疗早期糖尿病视网膜病变的中药制剂,处方组成为:
黄芪30-60g、女贞子9-15g、益母草9-30g、乌梅3-10g、黄连2-9g、肉桂2-5g、密蒙花3-9g。
本方组方特别,临床效果显著。但是,迄今未见有关其质量检测方法的报道。为了保证用药质量和安全,有必要建立上述原料药制备成的中药组合物的质量检测方法。
由于该处方中药味较多,且中药成分复杂,单一的定性鉴别或含量测定,都难以全面反映所述中药组合物的质量。因此,通过多次试验尝试,本发明最终选择了采用HPLC的方法,分别以黄芪甲苷、盐酸小檗碱、蒙花苷为检测指标,对方中的黄芪、黄连、密蒙花进行含量测定;同时采用TLC的方法,对方中的所有原料药——黄芪、女贞子、益母草、乌梅、黄连、密蒙花、肉桂进行薄层鉴别,以含量测定和薄层鉴别相结合的方式同时对所述中药组合物进行质量控制。
发明内容
针对上述问题,本发明的一个目的在于提供一种治疗糖尿病视网膜病变的中药组合物的质量检测方法。该方法操作简便、准确、可靠、重现性好,可有效地控制所述中药组合物的内在质量,保证制剂的稳定性和临床疗效。
为了实现上述发明目的,本发明采用了如下的技术方案:
一种治疗糖尿病视网膜病变的中药组合物的质量检测方法,所述中药组合物的原料药组成为:
黄芪30-60重量份、女贞子9-15重量份、益母草9-30重量份、乌梅3-10重量份、黄连2-9重量份、肉桂1-5重量份、密蒙花3-9重量份;
所述质量检测方法包括含量测定和薄层鉴别。
优选的,本发明所述质量检测方法,所述含量测定包括黄芪甲苷的含量测定,具体操作为:
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以体积比为35∶65的乙腈-水为流动相;蒸发光散射检测器检测;理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000;
对照品溶液的制备:取黄芪甲苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液,即得;
供试品溶液的制备:取所述中药组合物粉末约4g,精密称定,加入70%乙醇100ml,称定重量,超声20min,放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过;精密量取续滤液50ml,蒸干,残渣加水25ml使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取4次,每次25ml,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤3次,每次40ml,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇使溶解并转移至5ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl,供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,测定,用外标两点法对数方程计算,即得;
本发明所述中药组合物含黄芪甲苷不得少于0.5mg/g。
优选的,本发明所述质量检测方法,所述含量测定还包括蒙花苷和小檗碱的含量测定,其中采用如下的前处理方法,得到供试品溶液分别用于蒙花苷和小檗碱的含量测定:
取所述中药组合物粉末约0.6g,精密称定,置具塞锥形瓶,精密加入50%乙醇50ml,称定重量,超声处理20min,放冷,再称定重量,用50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,即得。
优选的,上述蒙花苷的含量测定,还包括:
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以体积比为45∶54.5∶0.5的甲醇-水-醋酸为流动相;检测波长为326nm;理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1000;
对照品溶液的制备:取蒙花苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含蒙花苷0.1mg的溶液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液10μl与上述供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
本发明所述中药组合物含蒙花苷不得少于0.7mg/g。
优选的,上述小檗碱的含量测定,还包括:
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以体积比为50∶50的乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相,其中每100ml0.05mol/L磷酸二氢钾溶液中加十二烷基硫酸钠0.4g,再用磷酸调节PH值为4.0,然后与乙腈按照所述体积比混合;检测波长为345nm;理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000;
对照品溶液的制备:取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含20μg盐酸小檗碱的溶液,即得;
测定法:分别精密吸取对照品溶液与上述供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得;
本发明所述中药组合物含小檗碱以盐酸小檗碱计,不得少于1.8mg/g。
优选的,本发明所述质量检测方法,所述薄层鉴别包括对黄连、密蒙花和肉桂薄层鉴别,具体步骤为:
(1)黄连薄层鉴别
取所述中药组合物0.2-0.3g,加甲醇50ml,超声处理15min,过滤,作为供试品溶液;另取黄连对照药材0.2g,同法制成对照药材溶液;另取盐酸小檗碱对照品,加甲醇制成每1ml含0.25mg盐酸小檗碱的溶液,作为对照品溶液;吸取上述三种溶液各1μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以体积比为8:2:2:1.5:1的乙酸乙酯-氯仿-甲醇-氨水-三乙胺为展开剂,展开,取出,晾干,在紫外灯365nm下检视;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
(2)密蒙花薄层鉴别
取所述中药组合物2-3g,加无水乙醇20ml,超声处理30min,过滤,滤液蒸干,残渣加水30ml和0.6M盐酸溶液2ml使溶解,用乙酸乙酯25ml,振摇提取1次,弃去水层,乙酸乙酯层蒸干,残渣加1ml甲醇使溶解,作为供试品溶液;另取密蒙花对照药材0.5g,加无水乙醇5ml,浸泡10分钟,超声处理20分钟,过滤,滤液作为对照药材溶液;吸取上述两种溶液各1μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以体积比为20∶1∶0.1的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;
(3)肉桂薄层鉴别
取所述中药组合物4-5g,加水20ml,超声处理10min,过滤,滤液用乙醚15ml,振摇提取1次,弃去水层,乙醚层蒸干,残渣加1ml无水乙醇使溶解,作为供试品溶液;另取肉桂对照药材约0.5g,加入无水乙醇10ml,不断振摇下冷浸20分钟,过滤,得对照药材溶液;另取桂皮醛对照品,加无水乙醇制成每1ml含0.6mg桂皮醛的溶液,作为对照品溶液;吸取上述三种溶液各3μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以体积比17:3的沸程60~90℃的石油醚-乙酸乙酯为展开剂,展开,取出,晾干,喷以2,4-二硝基苯肼乙醇试液;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
优选的,本发明所述质量检测方法,所述薄层鉴别还包括对黄芪的薄层鉴别,具体操作为:
取所述中药组合物4-5g,加甲醇100ml,回流提取1小时,滤过,取滤液50ml,蒸干,残渣加水25ml使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次25ml,合并正丁醇液,用氨试液洗涤3次,每次40ml,弃去氨水层,正丁醇层蒸干,残渣加甲醇5ml使溶解,作为供试品溶液;另取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各4μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以体积比为13∶7∶2的氯仿-甲醇-水的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,日光下显相同的棕褐色斑点,365nm紫外光灯下显相同的橙黄色荧光斑点。
优选的,本发明所述质量检测方法,所述薄层鉴别还包括对女贞子的薄层鉴别,具体操作为:
取所述中药组合物5g,加甲醇20ml,超声处理20min,滤过,滤液蒸干,残渣加水5ml使溶解,通过大孔树脂柱,先后以水20ml和20%乙醇20ml洗脱,弃去洗脱液,继续用40%乙醇20ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液;另取特女贞苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以体积比为6:3:1的氯仿-甲醇-水下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,254nm紫外光灯下观察;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
优选的,所述女贞子薄层鉴别中,所述大孔树脂为D101型大孔树脂。
还优选的,所述女贞子薄层鉴别中,所述大孔树脂柱内径1.5cm,长10cm。
优选的,本发明所述质量检测方法,所述薄层鉴别还包括对益母草的薄层鉴别,具体操作为:
取所述中药组合物15g,加甲醇40ml,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水25ml,盐酸1ml,超声处理30min,4000转离心10分钟,取上清液缓慢通过预处理好的内径1.5cm、长15cm的强酸型阳离子交换树脂柱,依次用水50ml和氨水溶液50ml洗脱,弃去洗脱液,继续用50ml相同浓度的氨水溶液洗脱,收集该部分洗脱液,蒸干,加1ml1%盐酸甲醇使溶解,作为供试品;另取盐酸水苏碱,加1%盐酸甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液;吸取上述两种溶液各2μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以体积比为10:6:1的丙酮-无水乙醇-盐酸为展开剂,展开,取出,晾干,在105℃加热15分钟,放冷,喷以稀碘化铋钾-三氯化铁试液混合溶液至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
优选的,所述益母草薄层鉴别中,所述强酸型阳离子交换树脂为(732)001×7型阳离子交换树脂。
还优选的,所述益母草薄层鉴别中,所述强酸型阳离子交换树脂柱内径1.5cm,长15cm。
还优选的,所述益母草薄层鉴别中,所述氨水溶液的体积百分比浓度为10%-20%;更优选为13%-15%。
还优选的,本发明所述质量检测方法,所述薄层鉴别还包括对乌梅的薄层鉴别,具体操作为:
取所述中药组合物0.2-0.3g,加无水乙醇10ml和盐酸0.1ml,超声处理30min,过滤,作为供试品溶液;另取乌梅对照药材0.2g,同法制成对照药材溶液;另取枸橼酸对照品,加无水乙醇制成每1ml含1mg枸橼酸的溶液,作为对照品溶液;吸取上述三种溶液各4μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以体积比为4:1:5的正丁醇-甲酸-水的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以0.1%溴甲酚绿至斑点显色清晰;供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
本发明所述中药组合物,所述各味原料药经过或不经过提取,加入或不加入药学上可以接受的辅料,制成临床上可以接受的制剂。
上述临床上可以接受的制剂,包括但不限于:散剂、丸剂、浓缩丸剂、水煎剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、软胶囊剂、口服液等。
本发明所述氨试液的配制方法,见中国药典第一部附录XVB部分的记载。
本发明的有益技术效果在于:
(1)本发明所述中药组合物的原料药药味较多,定性鉴别和定量测定存在着诸多的干扰因素,本发明通过多次试验尝试,建立了对本发明所述组合物进行质量检测的方法:采用HPLC的方法,分别以黄芪甲苷以及盐酸小檗碱和蒙花苷为检测指标,对方中的黄芪、黄连、密蒙花进行含量测定;再优选采用薄层层析(TLC)的方法,对方中的黄芪、女贞子、益母草、乌梅、黄连、密蒙花、肉桂分别进行薄层鉴别。使组合物中所有药味的存在都以某种形式得到了检测和有效控制,从而保证制剂的稳定性、临床疗效和患者用药安全。
(2)本发明所述质量检测方法,专属性强、操作简便、准确、可靠、重现性好。
(3)本发明所述质量检测方法,黄芪甲苷的含量测定方法与2010版药典中黄芪药材的含量测定方法相比,具有操作简便、节省时间和原料,同时不降低分离度,稳定性和重现性良好等诸多优势。如:
①样品的提取:本发明以70%乙醇超声20min来提取所述中药组合物,而2010版药典中黄芪药材的提取方法为甲醇冷浸过夜,再回流提取4h。两种方法相较,本发明极大节约了时间成本;
②提取液的精制:本发明采用溶剂萃取法进行精制,相较2010版药典,省去了上D101型大孔吸附树脂精制的步骤,但是不降低分离度,节约了原料和时间,操作更加简便。同时因为减少了操作步骤,降低了操作过程中出现失误和差错的风险,使含量测定方法的稳定性和重现性均得到了提高。
(4)本发明所述质量检测方法,盐酸小檗碱和蒙花苷的含量测定方法采用同样的样品前处理方法,一种前处理方法得到的供试品溶液能够满足两种成分的含量测定,操作简便、快速,效率更高。
以下述颗粒剂为例,详细说明本发明所述黄芪甲苷、盐酸小檗碱、蒙花苷的含量测定方法的建立过程。
1.颗粒剂的制备:
原料药处方:
黄芪 6kg、女贞子 3kg、益母草 3kg、乌梅 1.8kg、黄连 1.2kg、肉桂 0.2kg、密蒙花 1.2kg
所述颗粒剂通过如下方法制备:
(1)按照处方准备各味药材。
(2)肉桂加药材重量10倍的水,用水蒸气蒸馏法提取挥发油,蒸馏后的水溶液另器收集,药渣备用;挥发油加2倍体积的无水乙醇溶解;取重量10倍于挥发油体积的β-环糊精,加β-环糊精重量25倍的水制成的β-环糊精水溶液;在转速150转/分钟下,缓慢向所述β-环糊精水溶液加入挥发油乙醇液,加入完毕后,继续搅拌1.5小时,冷藏12小时,过滤,将滤得物在45℃下低温烘干,得白色疏松的挥发油包合物。
(3)黄芪、女贞子、密蒙花加体积为药材重量10倍的70%乙醇回流提取2次,每次1.5小时,滤过,合并两次乙醇提取液,滤液回收乙醇,减压浓缩至80℃时测定相对密度为1.20-1.30的浸膏,得提取浸膏1,药渣备用。
(4)步骤(2)得到的肉桂药渣、步骤(3)得到的黄芪、女贞子和密蒙花药渣与乌梅,加药材总重量8倍的水回流提取2次,每次2小时,滤过,合并两次滤液,加入步骤(2)得到的蒸馏后的水溶液,静置,滤过,滤液减压浓缩至80℃时测定相对密度为1.20-1.30的浸膏,得提取浸膏2。
(5)益母草、黄连加体积为药材总重量10倍的60%乙醇提取3次,每次1.5小时,滤过,合并三次乙醇提取液,滤液回收乙醇,减压浓缩至80℃时测定相对密度为1.20-1.30的浸膏,得提取浸膏3。
(6)将提取浸膏1、2、3合并,与糊精1.58kg、阿斯巴甜30g,喷雾制粒,整粒,然后加入步骤(2)得到的挥发油包合物,混合均匀,共得颗粒6kg,装袋,每袋5g,共制得1200袋。
2.黄芪甲苷含量测定方法学考察
2.1 供试品溶液的制备
取同一批号的颗粒剂2份,1份按照本发明所述的“黄芪甲苷含量测定”项下“供试品制备方法”制备,得供试品溶液I;另1份按照2010版中国药典284页“黄芪甲苷含量测定”项下“供试品制备方法”制备,得供试品溶液II。
分别取供试品溶液I和II,按照本发明所述色谱条件进行测定。结果见附图1和2,结果显示本发明所述供试品溶液的制备方法与2010版药典方法相比,虽然省去了上D101型大孔吸附树脂精制的步骤,仍具有良好分离度,操作更加简便,节约了原料和时间。
2.2 系统适应性试验
从黄芪甲苷对照品溶液和样品溶液的色谱图可以看出,在本发明所述色谱条件下黄芪甲苷与组合物中其它组分色谱峰的分离度均大于1.5,能够达到基线分离,且阴性对照无干扰。参见附图3、4和5。
2.3 线性关系考察
精密称取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含黄芪甲苷0.308mg的溶液,摇匀。分别精密吸取1、3、5、10、20、25μl,按照上述的色谱条件进样,测定峰面积。以对照品进样量×对照品浓度的自然对数(X)为横坐标,以峰面积的自然对数(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。结果如表1所示,回归方程为Y=1.4705x-1.7904(r=0.9995)。
表1 黄芪甲苷线性关系的考察
结果表明,黄芪甲苷在30.8-770μg范围内线性良好。
2.4精密度
分别准确吸取对照品溶液20μl,按照上述色谱条件重复进样6次。结果如表2所示。
表2 黄芪甲苷精密度试验结果
黄芪甲苷峰面积的RSD为1.34%,表明本方法精密度良好。
2.5稳定性试验
精密量取为对照品溶液20μl,每隔一定时间进样1次,结果见表3。
表3 黄芪甲苷稳定性试验结果
黄芪甲苷峰面积的RSD为0.84%,表明供试品溶液在5h内基本稳定。
2.6 重现性试验
取同一批号的颗粒剂6份,按照上述“黄芪甲苷含量测定”项下“供试品制备方法”制备成供试品溶液,按照上述色谱条件进行测定。结果见表4。
表4 黄芪甲苷测定重复性试验结果
颗粒剂中黄芪甲苷含量为0.86mg/g,RSD值为1.71%,表明方法重复性良好。
2.7 加样回收率试验
取已知含量的同一批号的颗粒剂6份,精密称定2.0g,分别精密加入一定量的黄芪甲苷对照品,按照上述“黄芪甲苷含量测定”项下“供试品制备方法”制备成供试品溶液,按照上述色谱条件进行测定,计算加样回收率,结果见表5。计算公式为:
表5 黄芪甲苷的回收率试验结果
黄芪甲苷6次试验的平均回收率为99.84%,RSD值为1.99%,表明本方法具有良好回收率。
以上试验结果显示,本发明所建立的黄芪甲苷的含量测定方法具有良好的专属性、线性、精密度、稳定性、重现性和回收率,操作方法准确、可靠简便、易行,可用于本颗粒剂的质量控制。
3.小檗碱含量测定方法学考察
3.1 系统适应性试验
从附图6、7和8所示出的盐酸小檗碱对照品溶液和样品溶液的色谱图可以看出,在本发明所述色谱条件下盐酸小檗碱与颗粒剂中其它组分色谱峰的分离度均大于1.5,能够达到基线分离,且阴性对照无干扰。
3.2 线性关系考察
精密称取盐酸小檗碱对照品适量,加甲醇制成每1ml含盐酸小檗碱68.60μg的溶液,摇匀。分别精密吸取4、6、8、10、12、14μl按照上述的色谱条件进样,测定峰面积。以对照品进样量(X)为横坐标,以峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。结果见表6,回归方程为Y=4.8867x-42.933(r=0.9999)。
表6 盐酸小檗碱线性关系的考察
结果表明,盐酸小檗碱在273.6-957.6μg范围内线性良好。
3.3 精密度试验
分别准确吸取68.60μg/ml对照品溶液10μl,按照上述色谱条件重复进样6次。结果见表7。
表7 盐酸小檗碱精密度试验结果
盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.82%,表明本方法精密度良好。
3.4 稳定性试验
精密量取浓度为68.60μg/ml对照品溶液10μl,每隔一定时间进样1次,结果见表8。
表8 盐酸小檗碱稳定性试验结果
盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.70%,表明供试品溶液在5h内基本稳定。
3.5 重现性试验
取同一批号的颗粒剂6份,按照上述“小檗碱含量测定”项下“供试品制备方法”制备成供试品溶液,按照该项下色谱条件进行测定。结果如表9。
表9 盐酸小檗碱测定重复性试验结果
颗粒剂中小檗碱含量以盐酸小檗碱计为4.39mg/g,RSD值为1.98%,表明方法重复性良好。
3.6 加样回收率试验
取已知含量的同一批号的颗粒剂6份,精密称定0.3g,分别精密加入一定量的盐酸小檗碱对照品,按照上述“小檗碱含量测定”项下“供试品制备方法”制备成供试品溶液,按照该项下色谱条件进行测定,计算加样回收率,结果如表10。计算公式为:
表10 盐酸小檗碱的回收率试验结果
盐酸小檗碱6次试验的平均回收率为99.58%,RSD值为1.89%,表明本方法具有良好回收率。
以上试验结果显示,本发明所建立的小檗碱的含量测定方法具有良好的专属性、线性、精密度、稳定性、重现性和回收率,操作方法准确、可靠简便、易行,可用于本颗粒剂的质量控制。
4.蒙花苷含量测定方法学考察
4.1 系统适应性试验
从附图9、10和11示出的蒙花苷对照品溶液和样品溶液的色谱图可以看出,在此色谱条件下蒙花苷与颗粒剂中其它组分色谱峰的分离度均大于1.5,能够达到基线分离,且阴性对照无干扰。
4.2 线性关系考察
精密称取蒙花苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含蒙花苷50.3μg的溶液,摇匀。分别精密吸取4、6、8、10、12、14μl按照上述的色谱条件进样,测定峰面积。以对照品进样量(X)为横坐标,以峰面积(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。结果见表11,回归方程为Y=2.0033x+8.9714(r=0.9999)。
表11 蒙花苷线性关系的考察
结果表明,蒙花苷在201.2-704.2μg范围内线性良好。
4.3 精密度试验
分别准确吸取50.3μg/ml对照品溶液10μl,按照上述色谱条件重复进样6次,结果见表12。
表12 蒙花苷精密度试验结果
蒙花苷峰面积的RSD为0.95%,表明本方法精密度良好。
4.4 稳定性试验
精密量取浓度为50.3μg/ml对照品溶液10μl,每隔一定时间进样1次,结果见表13。
表13 蒙花苷稳定性试验结果
蒙花苷峰面积的RSD为0.70%,表明供试品溶液在5h内基本稳定。
4.5 方法的重现性试验
取同一批号的颗粒剂6份,按照上述“蒙花苷含量测定”项下“供试品制备方法”制备成供试品溶液,按照该项下色谱条件进行测定,结果见表14。
表14 蒙花苷测定重复性试验结果
颗粒剂中蒙花苷含量为1.32mg/g,RSD值为0.92%,表明方法重复性良好。
4.6 加样回收率试验
取已知含量的同一批号的颗粒剂6份,精密称定0.3g,分别精密加入一定量的蒙花苷对照品,按照上述“蒙花苷的含量测定”项下“供试品制备方法”制备成供试品溶液,按照该项下色谱条件进行测定,计算加样回收率,结果如表15。计算公式为:
蒙花苷6次试验的平均回收率为99.19%,RSD值为1.35%,表明本方法具有良好回收率。
表15 蒙花苷的回收率试验结果
以上试验结果显示,本发明所建立的颗粒剂中蒙花苷的含量测定方法具有良好的专属性、线性、精密度、稳定性、重现性和回收率,操作方法准确、可靠简便、易行,可用于本颗粒剂的质量控制。
上述试验,以颗粒剂为例,详细说明了本发明所述中药组合物中黄芪甲苷、小檗碱和蒙花苷含量测定方法的建立,三种测定方法都具有良好的专属性、线性、精密度、稳定性、重现性和回收率,操作方法准确、可靠简便、易行,可用于本发明所述中药组合物的质量控制。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1按本发明方法制得供试品I的HPLC色谱图,图中标注数字的为黄芪甲苷的吸收峰,数字为黄芪甲苷的保留时间。
图2按2010版中国药典方法制得供试品II的HPLC色谱图,图中标注数字的为黄芪甲苷的吸收峰,数字为黄芪甲苷的保留时间。
图3黄芪甲苷对照品HPLC色谱图,图中的数字为黄芪甲苷的保留时间。
图4颗粒剂中黄芪甲苷含量测定HPLC色谱图,图中标注数字的为黄芪甲苷的吸收峰,数字为黄芪甲苷的保留时间。
图5不含黄芪的阴性颗粒剂的HPLC色谱图。
图6盐酸小檗碱对照品HPLC色谱图,图中的数字为盐酸小檗碱的保留时间。
图7颗粒剂中盐酸小檗碱含量测定HPLC色谱图,图中标注数字的为盐酸小檗碱的吸收峰,数字为盐酸小檗碱的保留时间。
图8不含黄连的阴性颗粒剂的HPLC色谱图。
图9蒙花苷对照品HPLC色谱图,图中的数字为蒙花苷的保留时间。
图10颗粒剂中蒙花苷含量测定HPLC色谱图,图中标注数字的为蒙花苷的吸收峰,数字为蒙花苷的保留时间。
图11不含密蒙花的阴性颗粒剂的HPLC色谱图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解,这些实施例仅用于说明本发明,其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等,如无特殊说明,均为市售购买产品。
实施例1一种治疗糖尿病视网膜病变的中药片剂的质量检测方法
1、原料药量
黄芪3000g、女贞子900g、益母草900g、乌梅300g、黄连200g、肉桂200g、密蒙花300g。
2、制备方法
(1)按照处方准备各味药材。
(2)取肉桂,加药材重量10倍的水,用水蒸气蒸馏法提取挥发油,蒸馏后的水溶液另器收集,药渣备用;挥发油加2倍体积的无水乙醇溶解;取重量10倍于挥发油体积的β-环糊精,加β-环糊精重量25倍的水制成的β-环糊精水溶液;在转速150转/分钟下,缓慢向所述β-环糊精水溶液加入挥发油乙醇液,加入完毕后,继续搅拌1.5小时,冷藏12小时,过滤,将滤得物在45℃下低温烘干,得白色疏松的挥发油包合物。
(3)步骤(2)得到的肉桂药渣与黄芪、女贞子、密蒙花、乌梅合并,加体积为药材重量10倍的体积百分浓度为60%的乙醇溶液回流提取2次,每次1.5小时,滤过,合并两次乙醇提取液,回收乙醇至无醇味,加入步骤(2)得到蒸馏后的水溶液,继续减压浓缩至80℃时测定相对密度为1.10-1.20的浸膏,得提取浸膏1。
(4)步骤(3)得到的提取浸膏1上AB-8大孔树脂,用5倍柱体积的水洗脱,弃去水洗液,再用5倍柱体积的体积百分浓度为70%的乙醇溶液洗脱,收集乙醇洗脱部分,回收乙醇,减压干燥,得浸膏粉1。
(5)益母草、黄连加药材重量10倍的60%乙醇溶液提取3次,每次1.5小时,滤过,合并三次乙醇提取液,回收乙醇,减压浓缩至80℃时测定相对密度为1.10-1.20的浸膏,得提取浸膏2;
(6)提取浸膏2调节pH值2,上(732)001×7阳离子交换树脂,用10倍柱体积的水洗脱,弃去水洗液,再用8倍柱体积含5%氨水的50%乙醇溶液进行洗脱,收集洗脱液,回收乙醇,减压浓缩,干燥,得浸膏粉2;
(7)取浸膏粉1和浸膏粉2,加入糊精75g和羧甲基淀粉钠18g,混合均匀,以水为粘合剂,采用喷雾制粒的方法,制得颗粒,整粒,加入步骤(2)得到的挥发油包合物和微粉硅胶1.5g,混合均匀,压片,0.42g/片,共得到800片。
同法制备三批样品。
3、质量检测
3.1 鉴别
(1)黄芪薄层鉴别 取所述片剂粉末(过四号筛)4.5g,粉碎,加甲醇100ml,回流提取1小时,滤过,取滤液50ml,蒸干,残渣加水25ml使溶解,用水饱和正丁醇振摇提取3次,每次25ml,合并正丁醇液,用氨试液洗涤3次,每次40ml,弃去氨水层,正丁醇层蒸干,残渣加甲醇5ml使溶解,作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各4μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以氯仿-甲醇-水(13:7:2)的下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,日光下显相同的棕褐色斑点,紫外光灯(365nm)下显相同的橙黄色荧光斑点。
(2)女贞子薄层鉴别 取所述本片剂粉末(过四号筛)5g,粉碎,加甲醇20ml,超声处理20min,滤过,滤液蒸干,残渣加水5ml使溶解,通过D101型大孔树脂柱(内径1.5cm,长10cm),先后以水20ml,20%乙醇20ml洗脱,弃去洗脱液,继续用40%乙醇20ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取特女贞苷对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以氯仿-甲醇-水(6:3:1)下层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,紫外下观察(254nm)。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(3)益母草薄层鉴别 取所述片剂粉末(过四号筛)15g,粉碎,加甲醇40ml,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水25ml,盐酸1ml,超声处理30min,离心(4000转,10分钟),取上清液缓慢通过预处理好的强酸型阳离子交换色谱柱(内径1.5cm,长15cm),用水50ml洗脱,弃去水洗脱液。另取一定浓度的氨水溶液(1体积氨水加入6体积水)50ml进行洗脱,弃去洗脱液,色谱柱继续用50ml相同浓度的氨水溶液洗脱,收集该部分洗脱液,蒸干,加1ml1%盐酸甲醇使溶解,作为供试品。另取盐酸水苏碱,加1%盐酸甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以丙酮-无水乙醇-盐酸(10:6:1)为展开剂,展开,取出,晾干,在105℃加热15分钟,放冷,喷以稀碘化铋钾-三氯化铁试液(10:1)混合溶液至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(4)乌梅薄层鉴别 取所述片剂粉末(过四号筛)0.2g,粉碎,加无水乙醇10ml,盐酸0.1ml,超声处理30min,过滤,作为供试品溶液。另取乌梅对照药材0.2g,同法制成对照药材溶液。另取枸橼酸对照品,加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各4μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以正丁醇-甲酸-水(4:1:5)上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以0.1%溴甲酚绿至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(5)黄连薄层鉴别 取所述片剂粉末(过四号筛)0.2g,粉碎,加甲醇50ml,超声处理15min,过滤,作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.2g,同法制成对照药材溶液。另取盐酸小檗碱对照品,加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液,作为对照品溶液。吸取上述三种溶液各1μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-氯仿-甲醇-氨水-三乙胺(8:2:2:1.5:1)为展开剂,展开,取出,晾干,在紫外灯365nm下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(6)密蒙花薄层鉴别 取所述片剂粉末(过四号筛)2g,粉碎,加无水乙醇20ml,超声处理30min,过滤,滤液蒸干,残渣加水30ml,加0.6M盐酸2ml使溶解,用乙酸乙酯25ml,振摇提取1次,弃去水层,乙酸乙酯层蒸干,残渣加1ml甲醇使溶解,作为供试品溶液。另取密蒙花对照药材0.5g,加无水乙醇5ml,浸泡10分钟,超声处理20分钟,过滤,滤液作为对照药材溶液。吸取上述两种溶液各1μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(20:1:0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(7)肉桂薄层鉴别 取所述片剂粉末(过四号筛)4g,加水20ml,超声处理10min,过滤,滤液用乙醚15ml,振摇提取1次,弃去水层,乙醚层蒸干,残渣加1ml无水乙醇使溶解,作为供试品溶液。另取肉桂对照药材约0.5g,加入无水乙醇10ml,冷浸20分钟(不断振摇),过滤,得对照药材溶液。另取桂皮醛对照品,加无水乙醇制成每1ml含0.6mg的溶液,作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各3μl,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(17:3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以2,4-二硝基苯肼乙醇试液。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
3.2含量测定
(1)片剂中黄芪甲苷的含量测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-水(35:65)为流动相;蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备 取本颗粒剂粉末(过四号筛)约4g,精密称定,加入70%乙醇100ml,称定重量,超声20min,放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液50ml,蒸干,残渣加水25ml使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取4次,每次25ml,合并正丁醇提取液,用氨试液提取3次,每次40ml,弃去氨洗液,正丁醇液回收溶剂至干,残渣加甲醇使溶解并转移至5ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl,供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,测定,用外标两点法对数方程计算,即得。
(2)片剂中小檗碱的含量测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以体积比50∶50的乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相,其中每100ml0.05mol/L磷酸二氢钾溶液中加十二烷基硫酸钠0.4g,再用磷酸调节PH值为4.0,然后与乙腈按照所述体积比混合;检测波长为345nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含20μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备 取所述片剂粉末(过四号筛)约0.6g,精密称定,置具塞锥形瓶,精密加入50%乙醇50ml,称定重量,超声处理20min放冷,再称定重量,用相应溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
(3)片剂中蒙花苷的含量测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水-醋酸(45:54.5:0.5)为流动相;检测波长为326nm。理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1000。
对照品溶液的制备 取蒙花苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含蒙花苷0.1mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备 采用上述进行小檗碱含量测定时制备的“供试品溶液”。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
4、测定结果
按上述制备方法制备三批样品,按质量检测方法进行含量测定,结果如表16所示,含量均符合规定,RSD均小于2%,说明该方法重现性良好。
表16 样品含量测定结果
实施例2一种治疗糖尿病视网膜病变的中药浓缩丸剂的质量检测方法
1、原料药量
黄芪4500g、女贞子1200g、益母草1200g、乌梅600g、黄连600g、肉桂350g、密蒙花600g。
2、制备方法
(1)按照处方准备各味药材。
(2)以上各味药材,用药材重量10倍的体积百分浓度为50%乙醇加热回流提取2次,每次1.5小时,滤过,合并两次乙醇提取液,回收乙醇,减压浓缩至80℃时测定相对密度为1.20-1.30的浸膏,得提取浸膏1,药渣备用;
(3)步骤(2)中药渣用药材重量8倍的水加热回流提取2次,每次2小时,滤过,合并两次滤液,静置,滤过,滤液浓缩至80℃时测定相对密度为1.20-1.30的浸膏,得提取浸膏2;
(4)将提取浸膏1和提取浸膏2合并,得总提取浸膏,喷雾干燥,所得干浸膏粉;
(5)步骤4得到的所述干浸膏粉,泛水为丸,得到浓缩丸2.38kg,装袋,每袋7g,共制得340袋。
同法制备三批样品。
3、质量检测
3.1 鉴别
(1)黄芪薄层鉴别 取所述浓缩丸粉末(过4号筛)5g,余下按照实施例1中“黄芪薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,日光下显相同的棕褐色斑点,紫外光灯(365nm)下显相同的橙黄色荧光斑点。
(2)女贞子薄层鉴别 取所述浓缩丸粉末(过4号筛)5g,余下按照实施例1中“女贞子薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(3)益母草薄层鉴别 取所述浓缩丸粉末(过4号筛)15g,余下按照实施例1中“女贞子薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(4)乌梅薄层鉴别 取所述浓缩丸粉末(过4号筛)0.3g,余下按照实施例1中“乌梅薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(5)黄连薄层鉴别 取所述浓缩丸粉末(过4号筛)0.3g,余下按照实施例1中“黄连薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(6)密蒙花薄层鉴别 取所述浓缩丸粉末(过4号筛)3g,余下按照实施例1中“黄连薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(7)肉桂薄层鉴别 取所述浓缩丸粉末(过4号筛)5g,余下按照实施例1中“黄连薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
3.2 含量测定
(1)浓缩丸剂中黄芪甲苷的含量测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-水(35:65)为流动相;蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备 取所述浓缩丸粉末(过四号筛)约4g,余下与实施例1中“片剂中黄芪甲苷的含量测定”项下“供试品溶液的制备”所述操作相同。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl,供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,测定,用外标两点法对数方程计算,即得。
(2)浓缩丸剂中小檗碱的含量测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以体积比50∶50的乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相,其中每100ml0.05mol/L磷酸二氢钾溶液中加十二烷基硫酸钠0.4g,再用磷酸调节PH值为4.0,然后与乙腈按照所述体积比混合;检测波长为345nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含20μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备 取取所述浓缩丸粉末(过四号筛)约0.6g,余下与实施例1中“片剂中小檗碱的含量测定”项下“供试品溶液的制备”所述操作相同。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
(3)片剂中蒙花苷的含量测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水-醋酸(45:54.5:0.5)为流动相;检测波长为326nm。理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1000。
对照品溶液的制备 取蒙花苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含蒙花苷0.1mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备 采用上述进行小檗碱含量测定时制备的“供试品溶液”。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
4、测定结果
按上述制备方法制备三批样品,按质量检测方法进行含量测定,结果如表17所示,含量均符合规定,RSD均小于2%,说明该方法重现性良好。
表17 样品含量测定结果
实施例3 一种治疗糖尿病视网膜病变的中药颗粒剂的质量检测方法
1、原料药量
黄芪6000g、女贞子1500g、益母草3000g、乌梅1000g、黄连900g、肉桂500g、密蒙花900g。
2、制备方法
(1)按照处方准备各味药材。
(2)取肉桂,加12倍量水,用水蒸气蒸馏法提取挥发油,蒸馏后的水溶液另器收集,药渣备用;挥发油加3倍量无水乙醇溶解,用20倍于挥发油的β-环糊精加40倍量水制成的溶液进行包合,得到挥发油包合物。
(3)黄芪、女贞子、密蒙花加药材重量14倍的100%乙醇回流提取3次,每次2小时,滤过,合并滤液,滤液回收乙醇,减压浓缩至80℃时测定相对密度为1.20-1.30的浸膏,得提取浸膏1,药渣备用;
(4)肉桂、黄芪、女贞子、密蒙花药渣与乌梅,加药材重量16倍的水回流提取3次,每次3小时,静置,滤过,滤液减压浓缩至80℃时测定相对密度为1.20-1.30的浸膏,得提取浸膏2;
(5)益母草、黄连加药材重量14倍的100%乙醇提取3次,每次2小时,滤过,合并滤液,滤液回收乙醇,减压浓缩至80℃时测定相对密度为1.20-1.30的浸膏,得提取浸膏3;
(6)将提取浸膏1、2、3合并,得总提取浸膏;
(7)取步骤6得到的所述总浸膏,与适量甘露醇、阿斯巴甜混合,制成颗粒,加入步骤2得到的挥发油包合物,得到颗粒5000g,装袋,每袋5g,共制1000袋。同法制备三批样品。
3、质量检测
3.1 鉴别
(1)黄芪薄层鉴别 取所述颗粒剂5g,余下按照实施例1中“黄芪薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,日光下显相同的棕褐色斑点,紫外光灯(365nm)下显相同的橙黄色荧光斑点。
(2)女贞子薄层鉴别 取所述颗粒剂5g,余下按照实施例1中“女贞子薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(3)益母草薄层鉴别 取所述颗粒剂15g,余下按照实施例1中“女贞子薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(4)乌梅薄层鉴别 取所述颗粒剂0.3g,余下按照实施例1中“乌梅薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(5)黄连薄层鉴别 取所述颗粒剂0.3g,余下按照实施例1中“黄连薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(6)密蒙花薄层鉴别 取所述颗粒剂3g,余下按照实施例1中“黄连薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
(7)肉桂薄层鉴别 取所述颗粒剂5g,余下按照实施例1中“黄连薄层鉴别”所述操作进行。结果:供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
3.2含量测定
(1)颗粒剂中黄芪甲苷的含量测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-水(35:65)为流动相;蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备 取所述颗粒剂粉末(过四号筛)约4g,余下与实施例1中“片剂中黄芪甲苷的含量测定”项下“供试品溶液的制备”所述操作相同。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl,供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,测定,用外标两点法对数方程计算,即得。
(2)颗粒剂中小檗碱的含量测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以体积比50∶50的乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相,其中每100ml0.05mol/L磷酸二氢钾溶液中加十二烷基硫酸钠0.4g,再用磷酸调节PH值为4.0,然后与乙腈按照所述体积比混合;检测波长为345nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含20μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备 取所述颗粒剂粉末(过四号筛)约0.6g,余下与实施例1中“片剂中小檗碱的含量测定”项下“供试品溶液的制备”所述操作相同。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
(3)片剂中蒙花苷的含量测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水-醋酸(45:54.5:0.5)为流动相;检测波长为326nm。理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1000。
对照品溶液的制备 取蒙花苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含蒙花苷0.1mg的溶液,即得。
供试品溶液的制备 采用上述进行小檗碱含量测定时制备的“供试品溶液”。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
4、测定结果
按上述制备方法制备三批样品,按质量检测方法进行含量测定,结果如表18所示,含量均符合规定,RSD均小于2%,说明该方法重现性良好。
表18 样品含量测定结果
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明,本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变或变形,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明所附权利要求的范围。