CN104758515A - 一种治疗肾病的中药组合物及其制备方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗肾病的中药组合物及其制备方法和检测方法,通过原料大黄、太子参、黄连、法半夏、陈皮、茯苓、丹参、牛膝、红花、甘草，以水提与醇提相结合进行制备，并进行了稳定性和质量含量检测。本发明对现有的肾衰宁经典配方进行了研究改进，使原料中的有效成分得到充分提取和作用发，减少患者的相对用药量且制备方法简便易操作；在检测方法中增加了君药大黄及臣药丹参的含量测定，建立了同时测定大黄以及丹参有效成分含量的高效液相色谱法，该检测方法能够简便高效地定性和定量检测出治疗肾病的中药组合物的有效成分含量，从而实现客观、全面、准确的评价肾衰宁类药物的质量，对控制肾衰宁类药物的质量和保证疗效具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种治疗肾病的中药组合物及其制备方法和检测方法。
背景技术
肾功能衰竭等肾脏疾病是临床常见重病，通常采用透析和肾移植治疗，但医疗费用过高，一般家庭经济无法负担，且透析治疗过程中易引发并发症，肾移植手术后还普遍存在排斥反应，对此，患者及其家属普遍较难承受。传统中药的应用则能够有效避免上述情况发生，如肾衰宁胶囊等，能够有效缓解症状，减少患者痛苦，但为保障临床疗效显著，还需进行改进。为保障以高质量的肾衰宁这些治疗肾病的中药进行治疗，并使其在临床中充分发挥功效，使患者尽早恢复健康，此类药物的制备方法及质量控制至关重要，而现有的治疗肾病的药物肾衰宁的制备方法，其君药大黄及黄连的有效成份未得以充分利用，其质量控制方法未纳入君药大黄及臣药丹参的定量检测，不能很好的反应制剂的质量，因此为了维护患者利益，很有必要在现有的技术基础之上研究设计出能同时测定大黄中有效成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和丹参中有效成分丹参素钠、丹酚酸B的含量的检测方法。
发明内容
本发明的目的是，针对现有技术存在的问题，提供一种治疗肾病的中药组合物及其制备方法和检测方法，改进提高现有肾衰宁制剂的疗效，提高药效检测的准确度，并以新检测方法客观、全面、准确的评价肾衰宁制剂的质量，从而利于严格控制投入治疗使用的药量，进而保障用药患者获得预期的治疗效果。
本发明解决问题的技术方案是：提供一种治疗肾病的中药组合物，含有以下重量配比的原料：大黄350～400份、太子参200～250份、黄连70～100份、法半夏230～250份、陈皮90～100份、茯苓190～200份、丹参670～700份、牛膝190～200份、红花80～100份、甘草85～100份。
在本发明治疗肾病的中药组合物中，含有全部或部分所述原料的提取物，所述提取物为醇提取物或者水提取物。
本发明治疗肾病的中药组合物作为药剂的剂型为颗粒剂、胶囊剂、汤剂、膏剂或者丸剂，优选为颗粒剂或者胶囊剂。
本发明治疗肾病的中药组合物能够采用现有中药的常规制备方法来制备，为保障相对现有肾衰宁等药物的疗效得到明显提高，将上述各原料制成本发明治疗肾病的中药组合物包括如下步骤：
(1)按照上述治疗肾病的中药组合物的原料配比称取大黄、太子参、黄连、法半夏、陈皮、茯苓、丹参、牛膝、红花、甘草；
(2)将步骤(1)所称取大黄质量的一半粉碎成大黄粉待用，将所余另一半大黄浸渍，提取待用；将步骤(1)所称取的太子参、法半夏、陈皮、茯苓、丹参、牛膝、红花和甘草这八味药进行水煎提取，收集所得提取液待用；将步骤(1)所称取的黄连进行水煎提取，收集所得提取液待用；
(3)将步骤(2)所得原料药的药粉及渗漉液和煎液混合均匀，即得治疗肾病的中药组合物。
优选地，在本发明治疗肾病的中药组合物的制备方法中，在所述步骤(2)中，所得大黄粉过200目筛；在所述步骤(2)中，将步骤(1)所称取大黄质量的一半先用质量百分含量为70％的乙醇浸渍，浸渍时间为24小时以上，然后，缓缓渗漉，收集所得渗漉液，将所得渗漉液于90～95℃下浓缩成相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；在所述步骤(2)中，将步骤(1)所称取的太子参、法半夏、陈皮、茯苓、丹参、牛膝、红花和甘草这八味药进行水煎，水煎三次，其中，第一次水煎时间为2.5～3.5小时，第二次水煎时间为1.5～2.5小时，第三次水煎时间为1～1.5小时，将每次水煎滤过所得煎液合并，然后，将所得煎液于60～70℃下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20g/cm3的清膏，再加入乙醇混合，使混合物的含醇量达到60％，充分搅拌后静置72小时以上，滤过，将所得滤液于95～98℃下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；在所述步骤(2)中，将步骤(1)所称取的黄连进行水煎，水煎三次，其中，第一次水煎时间为2.5～3.5小时，第二次水煎时间为1.5～2.5小时，第三次水煎时间为1～1.5小时，将每次水煎滤过所得煎液合并，然后，将所得煎液于60～70℃下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20g/cm3的清膏，再加入乙醇混合，使混合物的含醇量达到60％，充分搅拌后静置72小时以上，滤过，将所得滤液于95～98℃下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；在所述步骤(3)中，将上述步骤(2)所得大黄稠膏、大黄粉末、八味药的稠膏以及黄连稠膏混匀，制颗粒，干燥，即得治疗肾病的中药组合物。
优选地，在本发明治疗肾病的中药组合物的制备方法中，在所述步骤(2)中，所得大黄粉过200目筛；在所述步骤(2)中，将步骤(1)所称取大黄质量的一半先用质量百分含量为30％～60％的乙醇浸渍，浸渍时间为40小时以上，然后，将浸渍后所得大黄及其浸渍液进行加热回流提取，加热温度为85～95℃，提取时间为1.5～2.5小时，收集所得提取液，将所得提取液于90～95℃下浓缩成相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；在所述步骤(2)中，将步骤(1)所称取的太子参、法半夏、陈皮、茯苓、丹参、牛膝、红花和甘草这八味药进行水煎，水煎三次，其中，第一次水煎时间为2.5～3.5小时，第二次水煎时间为1.5～2.5小时，第三次水煎时间为1～1.5小时，将每次水煎滤过所得煎液合并，然后，将所得煎液于60～70℃下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20g/cm3的清膏，再加入乙醇混合，使混合物的含醇量达到60％，充分搅拌后静置72小时以上，滤过，将所得滤液于95～98℃下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；在所述步骤(2)中，将步骤(1)所称取的黄连进行水煎，水煎三次，其中，第一次水煎时间为2.5～3.5小时，第二次水煎时间为1.5～2.5小时，第三次水煎时间为1～1.5小时，将每次水煎滤过所得煎液合并，然后，将所得煎液于60～70℃下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20g/cm3的清膏，再加入乙醇混合，使混合物的含醇量达到60％，充分搅拌后静置72小时以上，滤过，将所得滤液于95～98℃下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；在所述步骤(3)中，将上述步骤(2)所得大黄稠膏、大黄粉末、八味药的稠膏以及黄连稠膏混匀，制颗粒，干燥，即得治疗肾病的中药组合物。
优选地，因本发明治疗肾病的中药组合物为口服给药，在本发明治疗肾病的中药组合物的制备方法中，为便于服用，在所述步骤(3)后，能够将步骤(2)所得产物混合制成颗粒剂、胶囊剂、汤剂、膏剂或者丸剂等药剂。较佳地，根据患者患病的程度和实际需要，为便于服用，将步骤(2)所得混合产物中加入填充剂、矫味剂，混匀，制成颗粒剂、胶囊剂等剂型的治疗肾病的中药组合物，其中，所述矫味剂优选为甜菊素，以改善中药较苦的口感，而且甜菊素不参与胰岛素代谢，更有利于人体康复。
本发明还提供了另一种治疗肾病的中药组合物的检测方法，在含量检测中，通过高效液相色谱法同时测定大黄中的有效成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。
优选地，在本发明治疗肾病的中药组合物的检测方法中，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各20μg和大黄素甲醚10μg的溶液，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取权利要求1至3中任一项所述的治疗肾病的中药组合物样品0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(75∶25至85:15)为流动相，即以甲醇与磷酸水溶液组成的混合液为流动相，其中，磷酸水溶液中磷酸的质量百分含量为0.1％，甲醇与0.1％磷酸水溶液的体积比为75:25至85:15；检测波长为254nm；柱温为30℃；理论板数按大黄素峰计算应不低于4000；
(4)测定方法：分别精密称取吸取步骤(1)所得对照品溶液与步骤(2)所得供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定供试品溶液与对照品溶液色谱保留时间相同的色谱峰。
本发明还提供了一种治疗肾病的中药组合物的检测方法，在含量检测中，通过高效液相色谱法同时测定丹参中有的效成分丹参素钠、丹酚酸B的含量。
优选地，在本发明治疗肾病的中药组合物的检测方法中，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取丹参素钠、丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含丹参素钠、丹酚酸B各40μg的溶液，即得对照品溶液；
(2)供式品溶液的制备：取权利要求1至3中任一项所述的治疗肾病的中药组合物样品0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供品溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以质量百分含量为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长280nm；柱温30℃；流速为每分钟1.0ml；理论板数按丹参素峰计算应不低于3500；其中，优选地，梯度洗脱程序如下表所示：
(4)测定方法：分别精密吸取步骤(1)所得对照品溶液与步骤(2)所得供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定供试品溶液与对照品溶液色谱保留时间相同的色谱峰。
为改进提高现有肾衰宁类药物的疗效，充分发挥中药经典配方的功效，在本发明中精选的上述原料药基于现有的中药典籍肾衰宁经典配方选取，发明人做了多次实验和配方调整并根据中药理论进行研制而得本发明治疗肾病的中药组合物及其制备方法，从配方到制备方法和检测方法均进行了改进。在本发明治疗肾病的中药组合物是以大黄为君药的治疗肾病的中药组合物，在本发明治疗肾病的中药组合物的制备方法中，在现有的治疗肾病的中药组合物的基本制备方法基础上进行了改进，使原料中的有效成分得到充分提取，尤其是对君药大黄采取了大黄粉与浸渍提取相结合的处理方法，使大黄的有效成分得到充分利用，并改善大黄性寒对药物整体作用效果的影响；对方中黄连采取了单独水煎的方式，有效地避免了黄连中有效成分在与其它药材同时水煎过程的结合反应，使黄连的有效成分得到充分利用。在本发明治疗肾病的中药组合物的检测方法中，在现有肾衰宁药物检测方法的基础上，在含量测定中增加了君药大黄的5个有效成分(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)的含量测定，建立了高效液相色谱法同时测定君药大黄中5个有效成分(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)的含量以及臣药丹参中两个有效成分(丹参素、丹酚酸B)的含量，建立了高效液相色谱法通过梯度洗脱同时测定丹参素及丹酚酸B的含量，用于评价本发明的产品质量。该检测方法能够客观、全面、准确的评价肾衰宁类药物的质量，利于增强肾衰宁类药物的质量控制和疗效保证。
附图说明
图1为芦荟大黄素对照品的紫外吸收光谱图；
图2为大黄酸对照品的紫外吸收光谱图；
图3为大黄素对照品的紫外吸收光谱图；
图4为大黄酚对照品的紫外吸收光谱图；
图5为大黄素甲醚对照品的紫外吸收光谱图；
图6为缺大黄空白样品指纹图谱；
图7为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚指纹图谱；
图8为供试品大黄指纹图谱；
图9为芦荟大黄素线性关系图；
图10为大黄酸线性关系图；
图11为大黄素线性关系图；
图12为大黄酚线性关系图；
图13为大黄素甲醚线性关系图；
图14为丹参素钠对照品的紫外吸收光谱图；
图15为丹酚酸B对照品的紫外吸收光谱图；
图16为缺丹参空白样品指纹图谱；
图17为丹参素钠、丹酚酸B指纹图谱；
图18为供试品丹参指纹图谱；
图19为丹参素钠线性关系图；
图20为丹酚酸B线性关系图。
具体实施方式
本发明提供的治疗肾病的中药组合物，基于现有的中药典籍肾衰宁经典配方进行研究改进，结合多年医药研究及临床经验和现代医学机理，并经临床观察百余例，对于肾病患者服用本发明的治疗肾病的中药组合物，相较现有肾衰宁药物具有用量少，见效快，疗效稳定可靠且无副作用的显著效果。
下面通过具体实施例进行说明。在本发明实施例中未进行详细介绍的中药活性组分提取的操作为中药制备领域常规技术。本发明实施例的目的是说明本发明的中药组合物可以制成的常规剂型，而非用于限制其保护范围或者影响其公开充分。
实施例1
按下述配比称取原料(g)：大黄400g、太子参250g、黄连100g、法半夏250g、陈皮100g、茯苓200g、丹参700g、牛膝200g、红花100g、甘草100g。
制备方法如下：
(1)将所称各原料药大黄质量的一半即200g大黄粉碎成大黄粉待用，将所余200g大黄先用乙醇浸渍，然后，缓缓渗漉，收集所得渗漉液待用；将所称取的太子参、法半夏、陈皮、茯苓、丹参、牛膝、红花和甘草这八味药进行水煎，收集所得煎液待用；将所称取的黄连进行水煎，收集所得煎液待用；
(2)将步骤(1)所得原料药的药粉及渗漉液和八味药以及黄连水煎液混合均匀，即得治疗肾病的中药组合物。
在上述实施例中，为保障药物整体的效力一致性及患者更好地进行吸收，大黄粉碎后的颗粒度过200目筛，较佳地，大黄粉为75μm以下的颗粒；同时，为保障药效充分得到发挥，在所述步骤(1)中，浸渍200g大黄用质量百分含量为70％的乙醇浸渍，浸渍24小时，以使大黄中的有效成分充分溶出，而后以渗漉法收集提取液保障收集完全，避免流失，在此过程中，缓缓渗漉收集，将所得渗漉液于90～95℃下浓缩成相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；此外，为保障原料药的有效成分得到充分利用，在所述步骤(1)中，将所称取的太子参、法半夏、陈皮、茯苓、丹参、牛膝、红花和甘草这八味药进行水煎，水煎次数优选为三次以上，较佳地，水煎三次，其中，第一次水煎时间优选为2.5～3.5小时，较佳地，第一次水煎2小时；第二次水煎1.5小时；第三次水煎时间为1～1.5小时，较佳地，第三次水煎1小时，将三次水煎滤过所得煎液合并，然后，将所得煎液于60～70℃下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20g/cm3的清膏，再加入乙醇混合，所用乙醇优选为质量百分含量为65％以上的乙醇，使加入乙醇后的清膏混合物中含醇量达到60％，充分搅拌后静置72小时以上，静置时间优选为72小时，静置后滤过，将所得滤液于95～98℃下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；在所述步骤(1)中，将所称取的黄连进行水煎，水煎次数优选为三次以上，较佳地，水煎三次，其中，第一次水煎2小时；第二次水煎时间优选为1.5～2.5小时，较佳地，第二次水煎1.5小时；第三次水煎时间为1～1.5小时，较佳地，第三次水煎1小时，将三次水煎滤过所得煎液合并，然后，将所得煎液于60～70℃下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20g/cm3的清膏，再加入乙醇混合，所用乙醇优选为质量百分含量为65％以上的乙醇，使加入乙醇后的清膏混合物中含醇量达到60％，充分搅拌后静置72小时以上，静置时间优选为72小时，静置后滤过，将所得滤液于95～98℃下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；在随后的所述步骤(2)中，将上述所得大黄稠膏及大黄粉末和八味药以及黄连的稠膏混匀，即得治疗肾病的中药组合物，为便于服用，还能够将所得混合物制成颗粒剂、胶囊剂、汤剂、膏剂或者丸剂等药剂；优选地，根据患者患病的程度和实际需要，为便于服用，将步骤(1)所得混合产物中加入填充剂、矫味剂，混匀，制成颗粒剂、胶囊剂等剂型的治疗肾病的中药组合物，其中，所述矫味剂优选为甜菊素，以改善中药较苦的口感，而且甜菊素不参与胰岛素代谢，更有利于人体康复；在本实施例中，将步骤(1)所得大黄稠膏及大黄粉末和八味药以及黄连的稠膏混匀，制得治疗肾病的中药组合物颗粒剂1000g，分别进行袋装或者胶囊装填。
黄连的有效成份为小檗碱等碱性物质，与其它药味同时煎煮易与酸性成份反应成盐，在上述实施例中，黄连的处理方法能够使原料中的有效成分得到更充分的利用，通过常规液相色谱检测，小檗碱的提取率高达70％，而常规方法生产的肾衰宁药物小檗碱的提取率仅为50％，本发明的产品与传统方法生产的肾衰宁药物相比较，服用量减少，效果相同，其生产成本降低10％，按照传统方法生产的肾衰宁颗粒服用剂量是每次的10克，每日3～4次，本发明的产品每次4～6克，每日2～3次，效果相同，并经百余例患者临床验证。
实施例2
按下述配比称取原料(g)：大黄400g、太子参250g、黄连100g、法半夏250g、陈皮100g、茯苓200g、丹参700g、牛膝200g、红花100g、甘草100g；基本制备方法同实施例1，其中，不同的是：在步骤(1)的200g大黄浸渍提取中，采用如下方法：将200g大黄先用质量百分含量为30％～60％的乙醇浸渍，浸渍时间为40小时以上，然后，将浸渍后所得大黄及其浸渍液进行加热回流提取，加热温度为85～95℃，提取时间为1.5～2.5小时，收集所得提取液，将所得提取液于90～95℃下浓缩成相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏。
在上述实施例中，大黄的处理方法能够使原料中的有效成分更充分地活化，通过常规液相色谱检测，提取率达到27.1％，其中，大黄蒽醌类有效成分的提取率为25.8％，总多糖的提取率达到0.8％，大黄素的提取率达到0.5％，相较于现有技术，有效成分的提取率最高提高达4倍，因此，与应用现有的肾衰宁药物相比，相同效果的药物，生产成本降低至少10％，对于现有药物需每次10克、每日3～4次实现的治疗效果，服用本发明的药物只需每次5克、每日2次，临床验证120例，显著减少患者的负担，且疗效稳定。
实施例3
按下述配比称取原料(g)：大黄350g、太子参200g、黄连70g、法半夏230g、陈皮90g、茯苓190g、丹参670g、牛膝190g、红花80g、甘草85g；基本制备方法及服用方法同实施例1。
实施例4
按下述配比称取原料(g)：大黄350g、太子参200g、黄连70g、法半夏230g、陈皮90g、茯苓190g、丹参670g、牛膝190g、红花80g、甘草85g；基本制备方法及服用方法同实施例2。
实施例5
按下述配比称取原料(g)：大黄370g、太子参230g、黄连85g、法半夏240g、陈皮95g、茯苓195g、丹参685g、牛膝195g、红花90g、甘草95g；基本制备方法及服用方法同实施例1。
实施例6
按下述配比称取原料(g)：大黄370g、太子参230g、黄连85g、法半夏240g、陈皮95g、茯苓195g、丹参685g、牛膝195g、红花90g、甘草95g；基本制备方法及服用方法同实施例2。
本发明提供的治疗肾病的中药组合物检测方法，结合多年医药检测研究及临床经验设计，其线性关系、精密度、重复性、稳定性、准确度、专属性良好，稳定可靠，能够客观、全面、准确的评价治疗肾病的中药组合物的质量，为控制治疗肾病的中药组合物的质量和保证临床疗效提供了保障。下面通过具体实验分别进行说明。
1、大黄的检测
1.1仪器及试剂：
HP-1260液相色谱仪，依利特ODS－BP色谱柱(4.6×250mm，5μm)，HP-1260系列四元泵，VWD可变波长检测器，自动进样器。紫外光谱测定用HP-1260液相色谱仪。
1.2芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品：
中国药品生物制品检定所提供，编号分别为110795-201007、110757-200206、110796-201118、110756-200110、110758-201013，供含量测定用；所用溶剂均为分析纯，流动相配制用色谱纯溶剂。
1.3色谱条件选择：
HPLC测定大黄游离蒽醌类成分的流动相多为甲醇-缓冲盐溶液和甲醇-磷酸溶液系统，由于缓冲盐溶液对色谱柱使用效果及寿命影响较大，故选择甲醇－磷酸溶液系统作为流动相。流动相比例随色谱柱品牌和柱长的影响，需作一定调整，多在(75∶25)至(85∶15)范围内，故标准正文中以75∶25列入。
在190-800nm波长下对供试品溶液和对照品溶液中欲测成分进行了全波长扫描，如图1-5所示，结果表明，5个大黄蒽醌类成分在254nm波长附近有明显吸收峰，此波长条件下，各待测成分色谱峰分离度良好，因此，选择254nm作为检测波长。
在上述条件下，对大黄蒽醌类对照品溶液、供试品溶液进行测定，如图6-8所示，结果表明，按同法制备的空白溶液测定结果为阴性，且对样品测定无干扰。因此，本发明提供的色谱条件能够用于同时检测治疗肾病的中药组合物中有效成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。
1.4测定方法：
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。
1.4.1色谱条件与系统适用性试验：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(75∶25)为流动相；检测波长为254nm；柱温为30℃。理论板数按大黄素峰计算应不低于4000。
1.4.2对照品溶液的制备：
取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各20μg和大黄素甲醚10μg的溶液，即得对照品溶液。
1.4.3供试品溶液制备：
取本发明实施例2所制备的治疗肾病的中药组合物样品4份，每份0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml或50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)提取不同的时间，分别为10分钟、20分钟、30分钟、40分钟，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按上述液相色谱条件测定，结果见下表1。
表1提取条件选择结果
由上表可见，样品超声处理(功率250W，频率50kHz)提取30分钟，已经提取完全，最终确定供试品溶液的制备方法为：精密称取样品约0.2g，置于锥型瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液，即得。
1.4.4测定方法：
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定供试品溶液与对照品溶液色谱保留时间相同的色谱峰。
1.5方法学验证
1.5.1线性分析：
分别精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品(中国药品生物制品检定所提供，编号分别为110795-201007、110757-200206、110756-200110、110796-201118、110758-201013，供含量测定用，纯度分别为：98.0％，100.0％，100.0％，99.5％，99.8％)，芦荟大黄素9.99mg，大黄酸10.32mg，大黄素9.61mg，大黄酚10.03mg，大黄素甲醚9.33mg，分别置于100ml、100ml、100ml、100ml、250ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，配成质量浓度分别为0.09790mg/ml、0.1032mg/ml、0.1003mg/ml、0.09562mg/ml、0.03725mg/ml的对照品溶液；精密量取上述对照品溶液各2ml置量瓶中，摇匀，配成质量浓度分别为0.01958mg/ml、0.02064mg/ml、0.02006mg、0.01912mg/ml、0.007449mg/ml的混合对照品溶液；
分别精密吸取混合对照品溶液1μl、2μl、3μl、5μl、7μl、10μl、15μl、20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以测得峰面积积分值对被测物的进样量，用最小二乘法进行线性回归，得各成分的回归方程及线性范围，结果见表3及图9-13。
表3大黄蒽醌类成分线性关系测定
| 成分 | 回归方程 | r | 线性范围 |
| 芦荟大黄素 | y＝5.04461x+1.34076 | 1.00000 | 0.01958-0.3916μg |
| 大黄酸 | y＝4.40009x+0.620266 | 1.00000 | 0.02064-0.4128μg |
| 大黄素 | y＝3.81512x+0.0015089 | 1.00000 | 0.02006-0.4012μg |
| 大黄酚 | y＝5.37618x-0.359095 | 1.00000 | 0.01912-0.3824μg |
| 大黄素甲醚 | y＝4.43883x-1.33777 | 0.99999 | 0.007449-0.1490μg |
从上表可见，各化合物的标准曲线的线性关系良好，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚的r值达到了1，大黄素甲醚的r值达到了0.99999。
1.5.2精密度试验：
精密吸取同一份供试品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，结果见表4。
表4供试品溶液精密度测试结果
| 连续进样次数 | 芦荟大黄素 | 大黄酸 | 大黄素 | 大黄酚 | 大黄素甲醚 |
| 1 | 233.18143 | 87.02828 | 99.28551 | 497.54529 | 100.26102 |
| 2 | 235.84946 | 87.67124 | 98.81831 | 497.45993 | 101.38302 |
| 3 | 236.93431 | 88.14819 | 99.13194 | 498.43719 | 100.36610 |
| 4 | 237.00003 | 88.34483 | 99.22095 | 499.00082 | 101.91142 |
| 5 | 238.72925 | 88.81197 | 100.18150 | 499.84280 | 101.81254 |
| 6 | 238.43753 | 88.86058 | 99.71533 | 499.57772 | 102.86207 |
上述5种蒽醌类成分峰面积的RSD(n＝6)分别为0.86％，0.80％，0.49％，0.20％，0.98％，表明仪器的精密度良好。
1.5.3重复性试验：
取本发明实施例2所制备的治疗肾病的中药组合物样品0.2g，平行6份，精密称定，按含量测定方法操作并测定，结果见表5。
表5供试品溶液重复性测试结果
| 序号 | 芦荟大黄素，％ | 大黄酸，％ | 大黄素，％ | 大黄酚，％ | 大黄素甲醚，％ |
| 1 | 0.092961 | 0.052331 | 0.045983 | 0.198451 | 0.042815 |
| 2 | 0.093568 | 0.052583 | 0.046106 | 0.199119 | 0.042896 |
| 3 | 0.093958 | 0.052694 | 0.046165 | 0.199710 | 0.043406 |
| 4 | 0.094157 | 0.052763 | 0.046429 | 0.199933 | 0.043371 |
| 5 | 0.094310 | 0.052807 | 0.046916 | 0.200095 | 0.043217 |
| 6 | 0.094281 | 0.052921 | 0.047075 | 0.199231 | 0.043048 |
测得上述的治疗肾病的中药组合物样品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均含量分别为0.0939％，0.0527％，0.0464％，0.199％，0.0431％，RSD(n＝6)分别为0.56％，0.39％，0.98％，0.31％，0.57％，表明该方法的重复性良好。
1.5.4稳定性试验：
取本发明实施例2所制备的治疗肾病的中药组合物0.2g制成供试溶液，放置于室温、不避光条件下，间隔不同时间进行多次测定，以峰面积计算，结果RSD(n＝8)分别为1.17％，0.98％，0.74％，0.66％，1.31％，所得的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积基本一致，说明样品在24小时内基本稳定，结果见表6。
表6供试品溶液稳定性测试结果
1.5.5加样回收试验
取已知含量的实施例2所制备的治疗肾病的中药组合物样品粉末约0.1g，精密称定，平行6份，分别按成分含量-对照品加入量(1:1)的比例加入芦荟大黄素(0.09790mg/ml)，大黄酸(0.1032mg/ml)，大黄素(0.1003mg)，大黄酚(0.09562mg/ml)，大黄素甲醚(0.03725mg/ml)对照品溶液各1.0ml、0.5ml、0.5ml、2.0ml、1.1ml，按前述1.4.3方法制备供试品溶液，分别精密吸取5μl进样，测定峰面积，计算加样回收率及RSD。结果见表7，结果表明，该方法的准确度良好。
表7治疗肾病的中药组合中大黄蒽醌类成分的加样回收率试验
1.5.6专属性检测
不含大黄的其他味药按处方比例及制法制备空白样品，并按正文方法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，结果如图6所示，在与对照品主峰保留时间相同的位置上无色谱峰出现，证明此方法专属性良好。
1.6治疗肾病的中药组合物中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的检测结果见表8
表8治疗肾病的中药组合物含量测定结果
| 样品批号 | 含量(mg/g) |
| 20130420 | 4.40 |
| 20130421 | 4.28 |
| 20130422 | 4.37 |
| 20130423 | 4.91 |
| 20130424 | 5.00 |
| 20130425 | 5.03 |
| 20130505 | 5.11 |
| 20130506 | 2.71 |
| 20130507 | 4.57 |
| 20130503 | 3.80 |
以上实验表明，本发明提供的治疗肾病的中药组合物检测方法其线性关系、精密度、重复性、稳定性、准确度、专属性良好，能够同时检测芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5个蒽醌类化合物，5个蒽醌类化合物在色谱柱上能同时分开，具有良好的分离度，且各化合物的保留时间和对照品具有很好的匹配度，因此采用本发明提供的检测方法只要一针进样即可定性和定量检测出治疗肾病的中药组合物的5个蒽醌类化合物(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)，本发明提供的检测方法能够客观、全面、准确的评价治疗肾病的中药组合物的质量，为控制治疗肾病的中药组合物的质量和保证临床疗效提供保障。
2、丹参的检测
2.1仪器及试剂：
HP-1260液相色谱仪，依利特ODS－BP色谱柱(4.6×250mm，5μm))，HP-1260系列四元泵，VWD可变波长检测器，自动进样器。紫外光谱测定用HP-1260液相色谱仪。
丹参素钠、丹酚酸B对照品：中国药品生物制品检定所提供，编号分别为110855-201210，111562-201002，供含量测定用；所用溶剂均为分析纯；流动相配制用色谱纯溶剂。
2.2色谱条件选择：
丹参素和丹酚酸B是丹参药材中主要药效成分，均为水溶性成分。HPLC测定流动相通常为乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.05％磷酸和甲醇-水溶液，结果发现，甲醇-水系统各峰拖尾严重，影响峰的识别和定量；而乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.05％磷酸均显著改善各物质峰形，只是在丹参素附近，乙腈-0.05％磷酸对杂质峰的分离不如乙腈-0.1％磷酸。因此，最终选择乙腈-0.1％磷酸作为流动相。
由于本品为十味药组成的复方制剂，成分较复杂，综合考虑最大吸收波长及其吸收值，选择280nm作为检测波长，检测结果如图14-15所示。
在此条件下，对丹参素钠、丹酚酸B对照品溶液、供试品溶液进行测定，如图16-18所示，按同法制备的空白溶液测定结果为阴性，且对样品测定无干扰。因此，本发明提供的色谱条件能够用于同时检测治疗肾病的中药组合物中有效成分丹参素和丹酚酸B。
2.3测定方法：
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VID)测定。
2.3.1色谱条件与系统适用性试验：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长280nm；柱温30℃；流速为每分钟1.0ml。理论板数按丹参素峰计算应不低于3500。
梯度洗脱程序表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～6 | 5→13 | 95→87 |
| 6～13 | 13→23 | 87→77 |
| 13～15 | 23→25 | 77→75 |
| 15～30 | 25 | 75 |
2.3.2对照品溶液的制备：
取丹参素钠、丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含丹参素钠、丹酚酸B各20μg的溶液，即得。
2.3.3供试品溶液的制备：
取本发明实施例2所制备的治疗肾病的中药组合物样品4份，每份0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)提取不同的时间，分别为10分钟、20分钟、30分钟、40分钟，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按上述液相色谱条件测定，结果见表9。
表9提取条件选择结果
| 取样量 | 溶剂体积 | 超声时间 | 丹参素钠 | 丹酚酸B | 总量 |
| g | ml | 分钟 | mg/g | mg/g | mg/g |
| 0.2065 | 25 | 10 | 4.632 | 6.210 | 10.842 |
| 0.2003 | 25 | 20 | 5.777 | 7.853 | 13.630 |
| 0.1979 | 25 | 30 | 6.308 | 8.530 | 14.837 |
| 0.2098 | 25 | 40 | 6.342 | 8.540 | 14.882 |
| 0.1916 | 25 | 60 | 6.039 | 8.210 | 14.249 |
由上表结果表明，样品超声处理(功率250W，频率50kHz)提取30分钟，已经提取完全，最终确定供试品溶液的制备方法为：精密称取样品约0.2g，置于锥型瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液，即得。
2.3.4测定法：
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定供试品溶液与对照品溶液色谱保留时间相同的色谱峰。
2.4方法学考察：
2.4.1线性关系考察：
分别精密称取丹参素钠、丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所提供，编号分别为110855-201210、111562-200807，供含量测定用，纯度分别为91.2％，95.4％)10.15mg，8.31mg，分别置25ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，配成质量浓度分别为0.3653mg/ml，0.3171mg/ml的对照品溶液；精密量取上述对照品溶液各5ml置10ml量瓶中，摇匀，配成质量浓度分别为0.1826mg/ml，0.1586mg/ml的混合对照品溶液；
分别精密吸取混合对照品溶液1μl、2μl、3μl、5μl、7μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以测得峰面积积分值对被测物的进样量，用最小二乘法进行线性回归，得各成分的回归方程及线性范围：
丹参素钠：Y＝0.67964X+2.70801，r＝0.99998
丹酚酸B：Y＝1.23382X+5.93886，r＝0.99996，
如图19-20所示，可见丹参素钠、丹酚酸B分别在0.18267～1.2787μg和0.1586～1.1099μg范围内线性关系良好。
2.4.2精密度试验：
精密吸取同一份供试品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，测定丹参素钠和丹酚酸B的峰面积，结果见表11。
表11供试品溶液精密度测试结果
| 序号 | 丹参素钠 | 丹酚酸B |
| 1 | 156.98836 | 114.39414 |
| 2 | 156.38402 | 113.81815 |
| 3 | 156.34431 | 113.92716 |
| 4 | 156.21367 | 113.76439 |
| 5 | 156.46170 | 113.99313 |
| 6 | 156.36528 | 114.17730 |
上述丹参素钠和丹酚酸B峰面积的RSD(n＝6)分别为0.17％、0.21％，表明仪器的精密度良好。
2.4.3重复性试验:
取本发明实施例2所制备的治疗肾病的中药组合物样品约0.2g，平行6份，精密称定，按含量测定方法操作并测定，结果见表12。
表12供试品溶液重复性测试结果
| 序号 | 丹参素钠，％ | 丹酚酸B，％ |
| 1 | 0.445825 | 0.641257 |
| 2 | 0.44716 | 0.64104 |
| 3 | 0.443594 | 0.634865 |
| 4 | 0.443803 | 0.635262 |
| 5 | 0.445518 | 0.637712 |
| 6 | 0.444343 | 0.636642 |
丹参素钠的均含量为0.445％，RSD(n＝6)为0.31％，丹酚酸B的均含量为0.638％，RSD(n＝6)为0.44％。
2.4.4稳定性试验:
取本发明实施例2所制备的治疗肾病的中药组合物样品按含量测定方法制成供试溶液，放置于室温、不避光条件下，间隔不同时间进行多次测定，以峰面积计算，如表13所示，RSD(n＝9)分别为1.07％，1.47％，所得的丹参素和丹酚酸B峰面积基本一致，说明样品在30小时内基本稳定。
表13供试品溶液稳定性测试结果
| 测定时间 | 放置时间(小时) | 丹参素 | 丹酚酸B |
| 18:39 | 0 | 156.98836 | 114.39414 |
| 19:52 | 1 | 156.34431 | 113.92716 |
| 20:29 | 2 | 156.21367 | 113.76439 |
| 21:42 | 3 | 156.36528 | 114.17730 |
| 1:59 | 7 | 154.39941 | 111.92003 |
| 5:39 | 11 | 157.26170 | 115.25043 |
| 9:56 | 15 | 159.63992 | 116.04066 |
| 17:54 | 23 | 159.70430 | 117.95531 |
| 0:38 | 30 | 157.60751 | 114.06878 |
| 峰面积平均值 | — | 157.17 | 114.61 |
| RSD，％ | — | 1.07 | 1.47 |
2.4.5加样回收率实验：
取已知含量的本发明实施例2所制备的治疗肾病的中药组合物样品粉末约0.1g，精密称定，平行6份，分别按成分含量-对照品加入量为1:1的比例加入0.3653mg/ml丹参素钠对照储备液1.2ml和0.3171mg/ml丹酚酸B对照储备液2.0ml，照前述1.4.3方法制备供试品溶液，分别精密吸取5μl进样，测定峰面积，计算加样回收率及RSD。结果见表14，丹参素回收率为104.53％，RSD(n＝6)为1.82％；丹酚酸B回收率为103.23％，RSD(n＝6)为1.60％，由此可见，此检测方法准确度良好。
表14加标回收率实验结果
2.4.6专属性检测
不含丹参的其他药味按处方比例及制法制备空白样品，并按正文方法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，结果如图12所示，在与对照品主峰保留时间相同的位置上无色谱峰出现，证明此方法具有良好的专属性。
2.5治疗肾病的中药组合物中丹参素钠和丹酚酸B的检测结果
表13治疗肾病的中药组合物含量测定结果
| 样品批号 | 含量(mg/g) |
| 20130420 | 11.26 |
| 20130421 | 10.86 |
| 20130422 | 11.63 |
| 20130423 | 11.03 |
| 20130424 | 11.2 |
| 20130425 | 11.00 |
| 20130503 | 8.63 |
| 20130505 | 7.6 |
| 20130506 | 8.08 |
| 20130507 | 8.14 |
以上实验表明，本发明提供的检测方法其线性关系、精密度、重复性、稳定性、准确度、专属性良好，能够同时检测两个丹参水溶性成分丹参素、丹酚酸B，且丹参素、丹酚酸B在色谱柱上能同时分开，具有良好的分离度，且各化合物的保留时间和对照品具有很好的匹配度，因此采用本发明提供的检测方法只要一针进样即能定性和定量检测出治疗肾病的中药组合物中丹参的2个水溶性成分(丹参素、丹酚酸B)，本发明提供的质量检测方法能够客观、
全面、准确的评价治疗肾病的中药组合物的质量，对控制治疗肾病的中药组合物的质量和保证临床疗效具有重要意义。
检测例
依据上述本发明的检测方法对上述实施例所制备的治疗肾病的中药组合物颗粒剂进行稳定性及含量检测，检测结果显示，稳定性良好，质量含量达标，符合药典的各项规定。下面以实施例2所得产品为样品，进行检测方法示例说明，其中，稳定性检测中采用的薄层色谱法试验，是按照2010版药典附录VIB试验；含量测定中采用的高效液相色谱法测定是按照2010版药典附录VID试验。具体检测如下：
1、含量检测
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定。
1.1大黄的含量检测
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(75∶25)为流动相；柱温:30℃；检测波长:254nm；理论板数按大黄素峰计算应不低于4000。
(2)对照品溶液的制备：取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各20μg和大黄素甲醚10μg的溶液，即得对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：取取实施例2制备的样品约0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理20分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪检测。
本品每粒含大黄以芦荟大黄素(C15H10O5)、大黄酸(C15H8O6)、大黄素(C15H10O5)、大黄酚(C15H10O4)、大黄素甲醚(C16H12O5)总量计，不少于1.2mg。
检测结果表明，理论板数按大黄素峰计算不低于4000，符合质量标准。
1.2丹参的含量测定
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长280nm；柱温30℃；流速为每分钟1.0ml；理论板数按丹参素峰计算应不低于3500。
梯度洗脱程序表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～6 | 5→13 | 95→87 |
| 6～13 | 13→23 | 87→77 |
| 13～15 | 23→25 | 77→75 |
| 15～30 | 25 | 75 |
(2)对照品溶液的制备：取丹参素钠、丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含丹参素钠、丹酚酸B各40μg的溶液，即得对照品。
(3)供试品溶液的制备：取实施例2制备的样品约0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品。
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪检测。
本品每粒含丹参以丹参素(C9H10O5)和丹酚酸B(C36H30O16)总量计，不少于2.7mg。
检测结果表明，理论板数按丹参素峰计算不低于3500，符合质量标准。
1.3黄连的含量测定
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.4％磷酸溶液(32：68)为流动盯；检测波长为345nm；柱温为40℃；理论板数按相盐酸小檗碱计算不低于4000。
(2)供式品溶液的制备：取实施例2制备的样品约0.3g，精密称定，精密加入盐酸与甲醇的混合溶液50ml，然后，进行超声处理40分钟，充分溶解后，冷却，用盐酸与甲醇的混合溶液补足减失的重量，摇匀、过滤、取滤液，即得供试品溶液；其中，所用盐酸与甲醇的混合溶液中，盐酸为质量百分含量为10％的盐酸，盐酸与甲醇的体积比为1：100，超声处理时超声仪功率为400W，频率为50KHZ；
(3)对照品溶液的制备：称取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg盐酸小檗碱的溶液，即得对照品溶液；
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪检测。
本品每粒含盐酸小檗碱不少于3.0mg。
检测结果表明，理论板数按盐酸小喍碱峰计算不低于4000，符合质量标准。
2、针对君药大黄的稳定性检测
(1)供试品溶液的制备：取实施例2制备的样品2g，加甲醇30ml，浸泡1小时，过滤蒸干，残渣加水20ml，加质量百分含量为10％的盐酸2ml，于85～98℃加热回流30分钟后，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚提取液，待乙醚挥干，加三氯甲烷1ml使残渣溶解，作为供试品溶液；
(2)对照药材溶液的制备：取大黄对照药材1g，加甲醇30ml，浸泡1小时，过滤蒸干，残渣加水20ml，加质量百分含量为10％的盐酸2ml，85～98℃加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚提取液，待乙醚挥干，加三氯甲烷1ml使残渣溶解，制成对照药材溶液；
(3)对照品溶液的制备：取对照品大黄素，加甲醇制成每1ml含0.2mg大黄素的溶液，作为对照品溶液；
(4)薄层色谱法试验：分别吸取步骤(1)制备的供试品溶液、步骤(2)制备的对照药材溶液、步骤(3)制备的对照品溶液各5μ1，分别点于同一硅胶H薄层板上，以30-60℃下石油醚与甲酸乙酯和甲酸的混合液的上层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，置于365nm紫外光灯下检视；其中，展开剂中各组分的体积比为石油醚：甲酸乙酯：甲酸＝15:5:1。
检测结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；置氨蒸汽中熏后，日光下再检视，斑点变为红色。
3、针对臣药陈皮的稳定性检测
(1)供试品溶液的制备：取实施例2制备的样品6g，加乙醚30ml，85～98℃加热回流20min，弃乙醚液，药渣滤干，加甲醇30ml，85～98℃回流30min，过滤，滤液挥干，残渣加水30ml溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供式品溶液；
(2)对照品溶液的制备：取陈皮苷对照品，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液；
(3)薄层色谱法试验：分别吸取步骤(1)制备的供试品溶液10μ1、步骤(2)制备的对照品溶液5μ1，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以由醋酸乙酯和甲醇及水组成的混合溶液为展开剂，展开、提取、晾干，喷以质量百分含量为3％的三氯化铝溶液，热风吹干，置于365nm紫外灯下检视；其中，展开剂中各组分的体积比为醋酸乙酯：甲醇：水＝100:7:13。
检测结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
4、针对太子参的稳定性检测
(1)供试品溶液的制备：取实施例2制备的样品5g，加甲醇20ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液加10％硫酸溶液10ml，加热回流1小时，滤过，滤液加水20ml，蒸去甲醇，放冷，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：另取太子参对照药村2g，加甲醇20ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液加10％硫酸溶液10ml，加热回流1小时，滤过，滤液加水20ml，蒸去甲醇，放冷，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
3)薄层色谱法试验：分别吸取步骤(1)制备的供试品溶液和步骤(2)制备的对照品溶液各10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以由环己烷和丙酮组成的混合液为展开剂，展开、取出、晾干，喷以10％的硫酸乙醇溶液；在105℃加热至斑点显色清晰。其中，展开剂中各组分的体积比为环己烷：丙酮＝4:1。
检测结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
5、以原儿茶醛为对照品的稳定性检测
(1)供试品溶液的制备：取实施例2制备的样品20g，加水25ml，浸渍30分钟，再加乙醇80ml，加热回流2小时，放冷，过滤，滤液浓缩至约5ml，加水30ml，至水浴锅上加热10分钟使溶解，放冷、过滤，加质量百分含量为10％的盐酸调节滤液pH至2，用乙醚振摇提取2次，每次25ml，合并乙醚提取液，用水25ml洗涤1次，取乙醚液加活性炭脱色，过滤，滤液挥杆，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：另取原儿茶醛对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液；作为对照品溶液；
(3)薄层色谱法试验：分别吸取步骤(1)制备的供试品溶液和步骤(2)制备的对照品溶液各10μ1，分别点于以羧甲基纤维素纳为粘合剂的硅胶G薄层板上，以由三氯甲烷和丙酮及甲酸组成的混合液为展开剂，预饱和30min后展开、取出、晾干，喷以三氯化铁试液；其中，展开剂中各组分的体积比为三氯甲烷：丙酮：甲酸＝8:1:1。
检测结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
6、以齐墩果酸为对照品的稳定性检测
(1)供试品溶液的制备：取实施例2制备的样品3g，加甲醇50ml，加质量百分含量为10％盐酸5ml，加热水解2小时，趁热过滤，将药渣用20ml水洗涤，弃滤液及水洗液，滤渣70℃干燥，加甲醇50ml加热回流1小时，放冷、过滤，滤液浓缩至约5ml，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：另取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
(3)薄层色谱法试验：分别吸取步骤(1)制备的供试品溶液10μ1和步骤(2)制备的对照品溶液各5μ1，分别点于同一以羧甲基纤维素纳为粘合剂的硅胶G薄层板上，以由甲苯和乙醚及甲醇组成的混合液为展开剂，展开、取出、晾干，喷以硫酸与乙醇的混合溶液；在105℃加热至斑点显色清晰；其中，展开剂中各组分的体积比为甲苯：乙醚：甲醇＝10:2:1，硫酸与乙醇的混合溶液中硫酸的质量百分含量为10％。
检测结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
综上，检测结果符合中国药典2010年版中有关各项规定。
本发明不限于上述实施方式，本领域技术人员所做出的对上述实施方式任何显而易见的改进或变更，都不会超出本发明的构思和所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种治疗肾病的中药组合物，其特征在于，含有以下重量配比的原料：大黄350～400份、太子参200～250份、黄连70～100份、法半夏230～250份、陈皮90～100份、茯苓190～200份、丹参670～700份、牛膝190～200份、红花80～100份、甘草85～100份。
2.根据权利要求1所述的治疗肾病的中药组合物，其特征在于，含有全部或部分所述原料的提取物，所述提取物为醇提取物或者水提取物。
3.根据权利要求1或2所述的治疗肾病的中药组合物，其特征在于，所述治疗肾病的中药组合物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、汤剂、膏剂或者丸剂。
4.一种权利要求1至3中任一项所述的治疗肾病的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按照权利要求1至3中任一项所述的治疗肾病的中药组合物的原料配比称取大黄、太子参、黄连、法半夏、陈皮、茯苓、丹参、牛膝、红花、甘草；
(2)将步骤(1)所称取大黄质量的一半粉碎成大黄粉待用，将所余另一半大黄浸渍提取待用；将步骤(1)所称取的太子参、法半夏、陈皮、茯苓、丹参、牛膝、红花和甘草这八味药进行水煎提取，收集所得提取液待用；将步骤(1)所称取的黄连进行水煎提取，收集所得提取液待用；
(3)将步骤(2)所得原料药的药粉及提取液混合均匀，即得治疗肾病的中药组合物。
5.根据权利要求4所述的治疗肾病的中药组合物的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所得大黄粉过200目筛；
在所述步骤(2)中，将步骤(1)所称取大黄质量的一半先用质量百分含量为70％的乙醇浸渍，浸渍时间为24小时以上，然后，缓缓渗漉，收集所得渗漉液，将所得渗漉液于90～95℃下浓缩成相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；
在所述步骤(2)中，将步骤(1)所称取的太子参、法半夏、陈皮、茯苓、丹参、牛膝、红花和甘草这八味药进行水煎，水煎三次，其中，第一次水煎时间为2.5～3.5小时，第二次水煎时间为1.5～2.5小时，第三次水煎时间为1～1.5小时，将每次水煎滤过所得煎液合并，然后，将所得煎液于60～70℃下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20g/cm3的清膏，再加入乙醇混合，使混合物的含醇量达到60％，充分搅拌后静置72小时以上，滤过，将所得滤液于95～98℃下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；
在所述步骤(2)中，将步骤(1)所称取的黄连进行水煎，水煎三次，其中，第一次水煎时间为2.5～3.5小时，第二次水煎时间为1.5～2.5小时，第三次水煎时间为1～1.5小时，将每次水煎滤过所得煎液合并，然后，将所得煎液于60～70℃下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20g/cm3的清膏，再加入乙醇混合，使混合物的含醇量达到60％，充分搅拌后静置72小时以上，滤过，将所得滤液于95～98℃下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；
在所述步骤(3)中，将上述步骤(2)所得大黄稠膏、大黄粉末、八味药的稠膏及黄连稠膏混匀，制颗粒，干燥，即得治疗肾病的中药组合物。
6.权利要求4所述的治疗肾病的中药组合物的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所得大黄粉过200目筛；
在所述步骤(2)中，将步骤(1)所称取大黄质量的一半先用质量百分含量为30％～60％的乙醇浸渍，浸渍时间为40小时以上，然后，将浸渍后所得大黄及其浸渍液进行加热回流提取，加热温度为85～95℃，提取时间为1.5～2.5小时，收集所得提取液，将所得提取液于90～95℃下浓缩成相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；
在所述步骤(2)中，将步骤(1)所称取的太子参、法半夏、陈皮、茯苓、丹参、牛膝、红花和甘草这八味药进行水煎，水煎三次，其中，第一次水煎时间为2.5～3.5小时，第二次水煎时间为1.5～2.5小时，第三次水煎时间为1～1.5小时，将每次水煎滤过所得煎液合并，然后，将所得煎液于60～70℃下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20g/cm3的清膏，再加入乙醇混合，使混合物的含醇量达到60％，充分搅拌后静置72小时以上，滤过，将所得滤液于95～98℃下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；
在所述步骤(2)中，将步骤(1)所称取的黄连进行水煎，水煎三次，其中，第一次水煎时间为2.5～3.5小时，第二次水煎时间为1.5～2.5小时，第三次水煎时间为1～1.5小时，将每次水煎滤过所得煎液合并，然后，将所得煎液于60～70℃下减压浓缩至相对密度为1.10～1.20g/cm3的清膏，再加入乙醇混合，使混合物的含醇量达到60％，充分搅拌后静置72小时以上，滤过，将所得滤液于95～98℃下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30g/cm3的稠膏待用；
在所述步骤(3)中，将步骤(2)所得大黄稠膏、大黄粉末、八味药的稠膏及黄连稠膏混匀，制颗粒，干燥，即得治疗肾病的中药组合物。
7.一种权利要求1至3中任一项所述的治疗肾病的中药组合物的检测方法，其特征在于，在含量检测中，通过高效液相色谱法同时测定大黄中的有效成份芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。
8.根据权利要求7所述的治疗肾病的中药组合物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各20μg和大黄素甲醚10μg的溶液，即得对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取权利要求1至3中任一项所述的治疗肾病的中药组合物样品0.2g，加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇与磷酸水溶液组成的混合液为流动相，其中，磷酸水溶液中磷酸的质量百分含量为0.1％，甲醇与0.1％磷酸水溶液的体积比为75:25至85:15；检测波长为254nm；柱温为30℃；理论板数按大黄素峰计算不低于4000；
(4)测定方法：分别取步骤(1)所得对照品溶液与步骤(2)所得供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定供试品溶液与对照品溶液色谱保留时间相同的色谱峰。
9.一种权利要求1至3中任一项所述的治疗肾病的中药组合物的检测方法，其特征在于，在含量检测中，通过高效液相色谱法同时测定丹参中有的效成份丹参素钠、丹酚酸B的含量。
10.根据权利要求9所述的治疗肾病的中药组合物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取丹参素钠、丹酚酸B对照品，加甲醇制成每1ml含丹参素钠、丹酚酸B各40μg的溶液，即得对照品溶液；
(2)供式品溶液的制备：取权利要求1至3中任一项所述的治疗肾病的中药组合物样品0.2g，加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B；检测波长280nm；柱温30℃；流速为每分钟1.0ml；理论板数按丹参素峰计算不低于3500；
(4)测定方法：分别称取步骤(1)所得对照品溶液与步骤(2)所得供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定供试品溶液与对照品溶液色谱保留时间相同的色谱峰。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150708 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |