CN113125573A - 一种治疗肾病的中药组合物中5种大黄蒽醌类成分的检测方法 - Google Patents

一种治疗肾病的中药组合物中5种大黄蒽醌类成分的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种治疗肾病的中药组合物中5种大黄蒽醌类成分的检测方法，其通过高效液相色谱法可同时测定治疗肾病的中药组合物中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚中的一种或多种的含量。该检测方法能够简便、高效地定量检测出治疗肾病的中药组合物的有效成分含量，从而实现客观、全面、准确的评价治疗肾病的中药组合物的质量，对控制肾病的中药组合物的质量和保证疗效具有重要意义。

Description

一种治疗肾病的中药组合物中5种大黄蒽醌类成分的检测 方法
技术领域
本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种治疗肾病的中药组合物中5种大黄蒽醌类成分含量的检测方法。
背景技术
肾功能衰竭等肾脏疾病是临床常见重病，通常采用透析和肾移植治疗，但医疗费用过高，一般家庭经济无法负担，且透析治疗过程中易引发并发症。肾移植手术后还普遍存在排斥反应，对此，患者及其家属普遍较难承受。应用传统中药如肾衰宁胶囊等则能够有效避免上述情况发生，其能够有效缓解症状，减少患者痛苦，但为保障临床疗效更显著，还需对其进行改进。为保障以高质量的例如肾衰宁胶囊的这些治疗肾病的中药进行治疗，并使其在临床中充分发挥功效，使患者尽早恢复健康，此类药物的质量控制至关重要，而现有的治疗肾病的药物—肾衰宁胶囊的质量控制方法未纳入君药大黄的有效成分的定量检测，不能很好的反应制剂的质量，导致大黄的有效成份未得以充分利用和监控。因此，为了维护患者利益，很有必要在现有的技术基础之上研究和设计出能同时测定大黄中有效成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量的检测方法。
在防病治病方面，中药及其提取制剂占据着重要的位置，其质量控制方法主要是显微鉴别、薄层鉴别与含量测定等。为排除干扰，样品的前处理程序多复杂、烦琐，需用大量的有机试剂反复纯化处理，费力、费时、费试剂、污染环境，危害健康，检测周期长。一个包含5～6项鉴别和一项含量测定的质量标准检测完成，一般要花费4～5天的时间，如遇复试花费时间更长，检测速度严重制约着中药现代化生产速度。所以寻找简便、快捷、全方位的用于控制质量的含量检测方法，成为中药生产必须突破的难关。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种用于同时测定治疗肾病的中药组合物芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚中的一种或多种的含量的检测方法，其中所述检测方法通过高效液相色谱法进行测定，所述高效液相色谱法条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，按0～40分钟内流动相A与流动相B的体积比从35：65变化至80：20的梯度进行洗脱。
优选地，所述的检测方法包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：分别取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取所述中药组合物，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液，即得各种游离蒽醌的供试品溶液；和/或
取所述中药组合物，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液，减压蒸干，加体积比为4％的盐酸，水浴加热回流，加乙醚萃取，减压蒸干，残渣加甲醇使溶解，滤过，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液；
(3)测定方法：分别精密吸取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照所述高效液相色谱法条件测定供试品溶液和对照品溶液的色谱，所述高效液相色谱法的条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，按0～40分钟内流动相A与流动相B的体积比从35：65匀速变化至80：20的梯度进行洗脱。
更优选地，所述的检测方法包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：分别取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取所述中药组合物，精密称定，精密加入甲醇，称定重量，超声处理10-60分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得各种游离蒽醌的供试品溶液；优选地，超声处理60分钟；和/或
取所述中药组合物，精密称定，精密加入甲醇，称定重量，超声处理60分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，减压蒸干，加体积比为4％的盐酸，水浴加热回流30-60分钟，立即冷却，加乙醚萃取，减压蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移于量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液；优选地，水浴加热回流60分钟；
(3)测定方法：分别精密吸取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照所述高效液相色谱法条件测定供试品溶液和对照品溶液的色谱。
根据本发明的一个实施方案，所述中药组合物包含丹参、大黄、太子参、黄连、牛膝、半夏、红花、茯苓、陈皮、甘草。
根据本发明的一个优选实施方案，其中按重量份数计，所述中药组合物包含：太子参20-30份，半夏20-30份，茯苓16-24份，丹参56-84份，红花8-12份，黄连8-12份，陈皮8-12份，大黄32-48份，牛膝16-24份和甘草8-12份。
根据本发明的一个更优选实施方案，所述半夏为法半夏。
根据本发明的一个最优选实施方案，所述中药组合物为肾衰宁胶囊。
优选地，在所述的检测方法中，所述高效液相色谱条件还包括：柱温为20-40℃；流速为每分钟0.95-1.05ml；紫外检测波长为250-260nm；理论板数按大黄素峰计算不低于4000。
进一步优选地，在所述的检测方法中，所述高效液相色谱条件还包括柱温为40℃；流速为每分钟1ml；紫外检测波长：254nm。
根据本发明的一个具体实施方案，所述的检测方法包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：分别取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素或大黄酚各100μg，大黄素甲醚50μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各10ml，置于100ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，即得每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素或大黄酚各10μg，含大黄素甲醚5μg的对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取所述中药组合物0.5g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，功率为250W且频率为50kHz的超声处理60分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得游离蒽醌供试品溶液；和
取所述中药组合物0.5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，功率为250W且频率为50kHz的超声处理60分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25ml，减压蒸干，加4％(体积比)盐酸50ml，水浴加热回流1小时，立即冷却，加乙醚萃取3次，每次50ml，合并乙醚层，减压蒸干，残渣加甲醇20ml使溶解，转移于25ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液。
(3)高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％(体积比)磷酸水溶液为流动相B，按下表中规定梯度的进行匀速洗脱，其中柱温为40℃，流速为每分钟1ml，紫外检测波长为254nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于4000。
Figure BDA0002348705730000041
(4)测定方法：分别精密称取吸取步骤(1)制备的对照品溶液和步骤(2)制备的供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定供试品溶液与对照品溶液的色谱。
本发明依据国家确保制剂安全有效的政策，利用高效液相色谱技术，制定了治疗肾病的中药组合物(例如肾衰宁胶囊)的有效成分检测方法，实现了中药处方中的君药—大黄的有效成分的定量测定，既保证了制剂的安全性，又保证了制剂的有效性。该检测方法与常规方法相比，无需浓缩、萃取和蒸发步骤，简便、快捷、效率高、成本低、无污染，有效提高了结果的准确性与重现性，可用于控制治疗肾病的中药组合物质量。
具体来说，本发明建立的高效液相色谱法检测治疗肾病的中药组合物(例如肾衰宁胶囊)中5种大黄游离蒽醌和总蒽醌类成分的含量测定方法可实现一次进样，同时分离5种成分，并精确定量。该方法专属性强，准确度高，可用于控制中药质量。总蒽醌供试品制备过程中不用三氯甲烷等毒性大的试剂，符合环保和安全要求。并且，本发明提供的检测方法，结合多年的医药检测研究和临床经验而设计，其线性关系、精密度、重复性、稳定性、准确度、专属性良好，稳定可靠，能够客观、全面、准确的评价治疗肾病的中药组合物的质量，为控制中药组合物(例如肾衰宁胶囊)的质量和保证临床疗效提供了保障。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为芦荟大黄素的紫外吸收图；
图2为大黄酸的紫外吸收图；
图3为大黄素的紫外吸收图；
图4为大黄酚的紫外吸收图；
图5为大黄素甲醚的紫外吸收图；
图6为大黄中5种蒽醌对照品的HPLC色谱图；
图7为测定5个游离蒽醌供试品的HPLC色谱图；
图8为测定总蒽醌供试品的HPLC色谱图；
图9为缺少大黄游离蒽醌空白样品的HPLC色谱图；
图10为缺少大黄总蒽醌空白样品的HPLC色谱图；
图11为芦荟大黄素的标准曲线图；
图12为大黄酸的标准曲线图；
图13为大黄素的标准曲线图；
图14为大黄酚的标准曲线图；
图15为大黄素甲醚标准曲线图；
图16为大黄总蒽醌水解方法二的HPLC色谱图；
图17为大黄总蒽醌水解方法一的HPLC色谱图。
图18为对比例1中大黄中5种蒽醌对照品的HPLC色谱图；
图19为对比例1中测定样品1的5个游离蒽醌供试品的HPLC色谱图；
图20为对比例1中测定样品1的总蒽醌供试品的HPLC色谱图；
图21为对比例2中大黄中5种蒽醌对照品的HPLC色谱图；
图22为对比例2中测定样品1的5个游离蒽醌供试品的HPLC色谱图；
图23为对比例2中测定样品1的5个总蒽醌供试品的HPLC色谱图；
图24为对比例3中大黄中5种蒽醌对照品的HPLC色谱图；
图25为对比例3中测定样品1的5个游离蒽醌供试品的HPLC色谱图；
图26为对比例3中测定样品1的总蒽醌供试品的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的描述，根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应容易理解的是，以下实施例只是描述性的，不意味着将本发明局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该意识到，本发明涵盖了权利要求书范围内所可能包括的所有改进方案、备选方案和等效方案。
实施例1大黄游离蒽醌和总蒽醌的含量测定
1.1仪器及试药
1.1.1仪器及试验条件
Agilent-1260液相色谱仪(HP-1260系列四元泵，DAD检测器，自动进样器)
依利特ODS-BP色谱柱(4.6×250mm，5μm)
Agilent EC-C18(4.6×250mm，4μm)
紫外光谱测定用HP-1260液相色谱仪
乙腈(色谱纯，默克)、甲醇(色谱纯，默克)，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
天平：OHAUS AR224-N电子天平(万分之一)，EX125ZH电子分析天平(十万分之一)，奥豪斯仪器(常州)有限公司；
仪器：DK-98ⅡA电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；
超声仪：SB25-12DTD超声仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；
1.1.2试药及样品
芦荟大黄素对照品(编号：110795-201710、中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用，98.3％)
大黄酸对照品(编号：110757-201607、中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用，99.3％)
大黄素对照品(编号：110796-2011512、中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用，98.7％)
大黄酚对照品(编号：110756-201621、中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用，99.2％)
大黄素甲醚对照品(编号：110758-201616、中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用，99.0％)
肾衰宁胶囊：均由云南雷允上理想药业有限公司提供(批号：20190303、20190403、20190404、20190507、20170703、20190520、20190523、20190524、20190605、20190615、20190812、20190414、20190419、20190421、20190705、20190708、20190711、20190714、20190716、20190720)
制备阴性对照的药材：所使用药材均统一采购于昆明井田药业有限公司，按制法制备。
1.2测定方法：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％(体积比)磷酸水溶液为流动相B，按下表中规定的梯度进行匀速洗脱；柱温：40℃；流速为每分钟1ml；检测波长：254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于4000。
Figure BDA0002348705730000071
对照品溶液的制备：取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各100μg，大黄素甲醚50μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各10ml，置于100ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各10μg，含大黄素甲醚5μg)。
供试品溶液的制备：
游离蒽醌：取内容物0.5g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理60分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得游离蒽醌供试品溶液。
总蒽醌：取内容物0.5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理60分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25ml，减压蒸干，加4％(v/v)盐酸50ml，水浴加热回流1小时，立即冷却，加乙醚萃取次，每次50ml，合并乙醚层，减压蒸干，残渣加甲醇20ml使溶解，转移于25ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
1.3色谱条件及系统适用性试验
1.3.1色谱条件选择
1.3.1.1流动相选择
HPLC测定大黄游离蒽醌类成分方法，常用流动相多为甲醇-缓冲盐溶液和甲醇-磷酸水溶液系统，本实验选择甲醇-磷酸水溶液系统作为流动相。流动相比例受到色谱柱品牌和柱长的影响，本实验考察了甲醇-磷酸水溶液系统和乙腈-磷酸水溶液系统，其中甲醇-磷酸水溶液在75∶25(体积比)至85∶15(体积比)时对芦荟大黄素有干扰，且拖尾因子T值偏离1.0更大。而乙腈-磷酸水溶液体积比在35：65至80：20梯度洗脱时，5个大黄蒽醌成分均达到很好分离效果，且拖尾因子T值偏离1.0更小(见表1)。
表1不同流动相比例的分离效果比较
Figure BDA0002348705730000081
1.3.1.2检测波长的选择
在190-400nm波长下对供试品溶液和对照品溶液中待测成分进行了全波长扫描，结果5个大黄蒽醌类成分在254nm波长附近有明显吸收峰，此波长条件下，各待测成分色谱峰分离度良好(参见图1至图5)，因此选择254nm作为检测波长。
在1.2项下色谱条件下对大黄蒽醌类对照品溶液、供试品溶液进行测定，结果均较为理想，按同法制备的缺少大黄的阴性溶液测定结果为阴性，且对样品测定无干扰(参见图6至图10)。
1.3.2系统适用性试验
根据《中国药典》2015年版四部通则0512“高效液相色谱法”中的相关规定进行试验。
1.3.2.1色谱柱的理论板数
采用不同品牌、不同柱长的色谱柱，测定供试品溶液时，理论板数均在80000以上，考虑到柱子新旧程度的影响，在保证分离效果的前提下，规定理论板数按大黄素峰计算应不低于4000。
表2不同品牌色谱柱检测大黄素的柱效
Figure BDA0002348705730000091
由上表结果表明，大黄素在本发明的色谱条件下测定，三种不同色谱柱的柱效基本一致，说明大黄素对色谱柱的适用性良好。
1.3.2.2重复性
取对照品溶液连续进样5次，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD(n＝5)均不大于2.0％(见表3)，表明仪器精密度良好。
表3对照品溶液的重复性试验结果
Figure BDA0002348705730000092
1.4供试品溶液制备方法
1.4.1提取方法考察
采用回流提取60分钟及超声提取60分钟进行试验。
方法一(参见《中国药典》2015年版一部)：
取肾衰宁胶囊内容物(批号20190108)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。
方法二：
取肾衰宁胶囊内容物(批号20190108)0.5g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)1小时，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液，即得。按本发明液相色谱条件测定，结果见下表4。
表4提取方法试验结果
Figure BDA0002348705730000101
从表4可知，回流提取和超声提取，试验结果差别不大，所以我们选择超声提取制制备供试品。
1.4.2提取时间的确定
取肾衰宁胶囊内容物(批号20190108)5份，每份0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)提取不同的时间，分别为10、20、30、40、60分钟，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液，按本发明液相色谱条件测定，结果见下表5。
表5提取时间试验结果
Figure BDA0002348705730000102
由实验结果分析确定大黄游离蒽醌供试品溶液制备方法：取内容物约0.5g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理60分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.4.3大黄总蒽醌水解方法选择
方法一：取肾衰宁胶囊内容物(批号20190108)2份，每份0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理60分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液25ml，加36％(v/v)盐酸5ml，水浴加热回流60分钟，立即冷却，转移于25ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按本发明液相色谱条件测定。
方法二：取肾衰宁胶囊内容物(批号20190108)2份，每份0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理60分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液25ml，减压蒸干，加4％(v/v)盐酸50ml，水浴加热回流60分钟，立即冷却，加乙醚萃取3次，每次50ml，合并乙醚层，减压蒸干，残渣加甲醇20ml使溶解，转移于25ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按本发明液相色谱条件测定。
方法一处理得到的样品的色谱图多出不明峰，说明水解产物比较多，而且5种大黄蒽醌的峰面积均减少。
方法二处理得到的样品的色谱图干扰峰少，说明水解产物比较少，而且5种大黄蒽醌的峰面积均增多(参见图16和17)。
1.4.4大黄总蒽醌水解时间选择
取肾衰宁胶囊内容物(批号20190108)4份，每份0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理60分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液25ml，减压蒸干，加4％(v/v)盐酸50ml，水浴加热回流30、40、50、60分钟，立即冷却，加乙醚萃取3次，每次50ml，合并乙醚层，减压蒸干，残渣加甲醇20ml使溶解，转移于25ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按本发明液相色谱条件测定，结果见下表6。
表6大黄总蒽醌水解时间试验结果
Figure BDA0002348705730000111
Figure BDA0002348705730000121
由实验结果分析确定大黄总蒽醌供试品溶液制备方法：取肾衰宁胶囊内容物0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理60分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液25ml，减压蒸干，加4％(v/v)盐酸50ml，水浴加热回流60分钟，立即冷却，加乙醚萃取3次，每次50ml，合并乙醚层，减压蒸干，残渣加甲醇20ml使溶解，转移于25ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.5专属性
根据本处方和工艺制法制得缺少大黄的阴性样品，再依照供试品溶液的制备方法制得阴性样品溶液，按本发明液相色谱条件注入液相色谱仪进行测定，结果阴性样品无干扰(见图9和图10)，说明此方法具有一定的专属性。
1.6线性关系考察
分别精密称取芦荟大黄素对照品10.47mg、大黄酸对照品10.18mg、大黄素对照品10.57mg、大黄酚对照品10.04mg分别置100ml量瓶中，大黄素甲醚对照品9.65mg置250ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，配成芦荟大黄素对照品溶液(0.1029mg/ml)，大黄酸对照品溶液(0.1011mg/ml)，大黄素对照品溶液(0.1043mg/ml)，大黄酚对照品溶液(0.09960mg/ml)，大黄素甲醚对照品溶液(0.007643mg/ml)的对照品溶液；精密量取上述对照品溶液各10ml置量瓶中，摇匀，即得(每1ml中含芦荟大黄素0.02058mg、大黄酸0.02022mg、大黄素0.02087mg、大黄酚0.01992mg，含大黄素甲醚0.0077643mg)。
分别精密吸取混合对照品溶液1、2、3、5、10ml置10ml量瓶中，分别精密吸取混合对照品溶液10、15ml置25ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，按本发明液相色谱条件注入液相色谱仪，测定峰面积，以测得峰面积积分值对被测物的进样量，用最小二乘法进行线性回归，得5种大黄蒽醌成分的回归方程及线性范围，结果见表7和图11至图15。
表7大黄蒽醌类成分线性关系测定
Figure BDA0002348705730000131
1.7精密度试验
1.7.1重复性考察
1.7.1.1游离蒽醌
取同一批肾衰宁胶囊(批号20190108)约0.5g，平行6份，精密称定，按“1.2项含量测定方法”操作并测定，结果见表8。
表8游离蒽醌供试品溶液重复性测试结果
Figure BDA0002348705730000132
测得肾衰宁胶囊中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均含量分别为0.035％，0.067％，0.024％，0.056％，0.017％，RSD(n＝6)分别为0.77％，0.53％，0.76％，0.23％，0.48％，表明该方法的重复性良好。
1.7.1.2总蒽醌
取同一批肾衰宁胶囊(批号20190108)约0.5g，平行6份，精密称定，按“1.2项含量测定方法”操作并测定，结果见表9。
表9总蒽醌供试品溶液重复性测试结果
Figure BDA0002348705730000141
测得肾衰宁胶囊中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均含量分别为1.38mg/g、2.24mg/g、0.90mg/g、2.22mg/g、0.70mg/g、7.44mg/g，RSD(n＝6)分别为1.17％、1.74％、0.84％、0.94％、1.48％、1.12％，表明该方法的重复性良好。
1.7.2中间精密度考察
在同一实验室，不同操作人员于不同日期、不同色谱柱(A：2019年7月1日测定，Agilentl260液相色谱仪，Agilent EC-C18色谱柱；B：2019年6月17日测定，Agilentl260液相色谱仪，依利特ODS-BP色谱柱)对3批样品用本发明的含量测定方法操作，并且计算。实验结果显示，本发明确定的方法中间精密度良好(见表10和表11)。
表10游离蒽醌中间精密度考察结果(n＝3)
Figure BDA0002348705730000142
表11总蒽醌中间精密度考察结果(n＝3)
Figure BDA0002348705730000143
Figure BDA0002348705730000151
1.8准确度的试验
1.8.1大黄游离蒽醌
采用加样回收法。精密量取芦荟大黄素(0.01544mg/ml)，大黄酸(0.03033mg/ml)，大黄素(0.01043mg/ml)，大黄酚(0.02490mg/ml)，大黄素甲醚(0.00764mg/ml)混合对照品溶液9份，按加入量0.5、1.0、1.5倍分成三组，每组3.0ml，5.0ml，10.0ml，分别置于锥形瓶中，低温挥干，取已知含量的肾衰宁胶囊(批号20180108)粉末0.25g，精密称定，分别加入上述9个锥形瓶中，照1.2项供试品溶液制备方法制备供试品溶液，再按1.2项下色谱条件测定含量，同时取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品溶液浓度为0.010292、0.010109、0.010433、0.00996、0.003821mg/ml，平均峰面积为478.601、386.740、352.830、490.451、132.358进行计算。得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均回收率RSD(n＝9)为0.54％、1.77％、0.96％、1.31％、1.98％，结果见表12。结果表明该方法的准确度良好。
表12肾衰宁胶囊中大黄游离蒽醌类成分的加样回收率试验
Figure BDA0002348705730000152
Figure BDA0002348705730000161
Figure BDA0002348705730000171
1.8.2大黄总蒽醌
采用加样回收法。精密量取芦荟大黄素(0.033697mg/ml)，大黄酸(0.055091mg/ml)，大黄素(0.022029mg/ml)，大黄酚(0.054401mg/ml)，大黄素甲醚(0.017026mg/ml)混合对照品溶液9份，分成三组，每组5.0ml，10.0ml，15.0ml，分别置于锥形瓶中，低温挥干，取已知含量的肾衰宁胶囊(批号20180108)粉末0.25g，精密称定，分别加入上述9个锥形瓶中，照1.2项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液和色谱条件测定含量，同时取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品溶液浓度为0.010292、0.010109、0.010433、0.00996、0.003821mg/ml，平均峰面积为477.540、393.780、355.816、489.093、132.381进行计算。得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的平均回收率RSD(n＝9)为3.16％、2.81％、1.90％、1.84％、2.94％，结果见表13。结果表明该方法的准确度良好。
表13肾衰宁胶囊中大黄总蒽醌类成分的加样回收率试验
Figure BDA0002348705730000172
Figure BDA0002348705730000181
1.9含量限度的确定
对肾衰宁胶囊二十批样品进行测定，结果见表14。
表14二十批样品含量测定结果
Figure BDA0002348705730000191
根据二十批样品的实际含量测定结果，游离蒽醌和总蒽醌含量平均值分别为0.90、2.38mg/粒，暂订本品含大黄以游离蒽醌中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的总量计，每粒不得少于0.60mg；以总蒽醌中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的总量计，每粒不得少于1.80mg。
1.10耐用性试验
1.10.1柱温考察
由于柱温的高低对分离效果的影响比较大，为了试验方法的稳定性，我们选择20℃、25℃、30℃、35℃和40℃进行试验，试验结果表明其理论塔板效和分离度均达到要求。
表15不同柱温比较结果
Figure BDA0002348705730000201
Figure BDA0002348705730000211
1.10.2流速的考察
为了考察不同流速对试验结果的影响程度，我们选择0.95ml/min、1.0ml/min和1.05ml/min进行试验，试验结果表明其理论塔板数和分离度均达到要求。
表16不同流速比较结果
Figure BDA0002348705730000212
1.10.4检测波长的考察
为了考察不同的检测波长对试验结果的影响程度，我们选择250nm、254nm和260nm进行试验，试验结果表明其理论塔板数和分离度均达到要求。
经试验，说明上述试验条件的微小变化变动对系统适用性试验影响不大，表明我们选择的方法可行。
1.10.5不同色谱柱考察
表17不同色谱柱比较结果
Figure BDA0002348705730000221
1.10.6稳定性考察
取同一份供试品，按含量测定方法制成供试溶液，放置于室温、不避光条件下，间隔不同时间进行多次测定，以峰面积计算，结果RSD(n＝12)分别为0.72％，0.27％，0.78％，0.19％，0.24％，所得的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积基本一致，说明供试品在42小时内稳定，结果见表18。
表18供试品溶液稳定性测试结果
Figure BDA0002348705730000222
Figure BDA0002348705730000231
对比例1：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸水溶液(体积比为75∶25)为流动相；柱温：30℃；检测波长：254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备：取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各100μg，大黄素甲醚50μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各2ml，混匀，即得(每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各20μg，含大黄素甲醚10μg)。
供试品溶液的制备：取内容物约0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理20分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
总蒽醌：取内容物0.5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理60分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25ml，减压蒸干，加4％(v/v)盐酸50ml，水浴加热回流1小时，立即冷却，加乙醚萃取3次，每次50ml，合并乙醚层，减压蒸干，残渣加甲醇20ml使溶解，转移于25ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
对肾衰宁胶囊五批样品进行测定，结果见表19和附图18-20。
表19五批样品含量测定结果
Figure BDA0002348705730000232
Figure BDA0002348705730000241
对比例2：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸水溶液(体积比80∶20)为流动相；柱温：30℃；检测波长：254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备：取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各100μg，大黄素甲醚50μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各2ml，混匀，即得(每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各20μg，含大黄素甲醚10μg)。
供试品溶液的制备：取内容物约0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理20分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
总蒽醌：取内容物0.5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理60分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25ml，减压蒸干，加4％(v/v)盐酸50ml，水浴加热回流1小时，立即冷却，加乙醚萃取3次，每次50ml，合并乙醚层，减压蒸干，残渣加甲醇20ml使溶解，转移于25ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
对肾衰宁胶囊五批样品进行测定，结果见表20和图21至图23。
表20五批样品含量测定结果
Figure BDA0002348705730000242
对比例3：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸水溶液(体积比85∶15)为流动相；柱温：30℃；检测波长：254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备：取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各100μg，大黄素甲醚50μg的溶液；分别精密量取上述对照品溶液各2ml，混匀，即得(每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各20μg，含大黄素甲醚10μg)。
供试品溶液的制备：取内容物约0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理20分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
总蒽醌：取内容物0.5g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理60分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液25ml，减压蒸干，加4％(v/v)盐酸50ml，水浴加热回流1小时，立即冷却，加乙醚萃取3次，每次50ml，合并乙醚层，减压蒸干，残渣加甲醇20ml使溶解，转移于25ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
对肾衰宁胶囊五批样品进行测定，结果见表21和图24至图26。
表21五批样品含量测定结果
Figure BDA0002348705730000251
对比例1至3测定结果均比本发明的结果偏高，是由于测定游离蒽醌时芦荟大黄素出峰时间比较快，与其它成分产生严重干扰，导致测定结果偏高，而在测定总蒽醌时，由于有甲醇参与水解，水解产物丰富，同时对比例1至3的色谱条件不能将其他水解产物分离，导致测定结果偏高。
无论是游离蒽醌还是总蒽醌，本发明均可以将5个蒽醌成分与其他成分或者水解产物成分干扰峰完全分离，排除干扰峰的影响，且峰形拖尾因子T值更接近1.0，峰形对称性好，定量结果更准确。

Claims (10)

1.一种用于同时测定治疗肾病的中药组合物中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚中的一种或多种的含量的检测方法，其中所述检测方法通过高效液相色谱法进行测定，所述高效液相色谱法的条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，按0～40分钟内流动相A与流动相B的体积比从35：65变化至80：20的梯度进行洗脱。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：分别取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取所述中药组合物，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液，即得各种游离蒽醌的供试品溶液；和/或
取所述中药组合物，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液，减压蒸干，加体积比为4％的盐酸，水浴加热回流，加乙醚萃取，减压蒸干，残渣加甲醇使溶解，滤过，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液；
(3)测定方法：分别精密吸取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照所述高效液相色谱法条件测定供试品溶液和对照品溶液的色谱，所述高效液相色谱法的条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积比浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，按0～40分钟内流动相A与流动相B的体积比从35：65匀速变化至80：20的梯度进行洗脱。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：分别取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取所述中药组合物，精密称定，精密加入甲醇，称定重量，超声处理10-60分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得各种游离蒽醌的供试品溶液；优选地，超声处理60分钟；和/或
取所述中药组合物，精密称定，精密加入甲醇，称定重量，超声处理60分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，减压蒸干，加体积比为4％的盐酸，水浴加热回流30-60分钟，立即冷却，加乙醚萃取，减压蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移于量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得总蒽醌供试品溶液；优选地，水浴加热回流60分钟；
(3)测定方法：分别精密吸取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照所述高效液相色谱法条件测定供试品溶液和对照品溶液的色谱。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述中药组合物包含丹参、大黄、太子参、黄连、牛膝、半夏、红花、茯苓、陈皮、甘草。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其中按重量份数计，所述中药组合物包含：太子参20-30份，半夏20-30份，茯苓16-24份，丹参56-84份，红花8-12份，黄连8-12份，陈皮8-12份，大黄32-48份，牛膝16-24份和甘草8-12份。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其中按重量份数计，所述中药组合物包含：太子参25份，半夏25份，茯苓20份，丹参70份，红花10份，黄连10份，陈皮10份，大黄40份，牛膝20份和甘草10份。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其中所述半夏为法半夏。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的检测方法，其中所述中药组合物是肾衰宁胶囊。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的检测方法，其中所述高效液相色谱条件还包括：柱温为20-40℃；流速为每分钟0.95-1.05ml；紫外检测波长为250-260nm；理论板数按大黄素峰计算不低于4000。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其中所述高效液相色谱条件还包括柱温为40℃；流速为每分钟1ml；紫外检测波长为254nm。
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