CN107860832B - 复方大黄清胰汤指纹图谱的建立方法 - Google Patents
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Abstract
复方大黄清胰汤指纹图谱的建立方法，步骤：供试品溶液、单味药材供试品溶液和对照品溶液的制备，HPLC色谱条件的确定，指纹图谱的确定；所述高效液相色谱条件为UItimate LP‑C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长237 nm，乙腈(A)－0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱。本发明采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》建立的复方大黄清胰汤剂指纹图谱，由42个共有峰色谱信息构成，并通过与各组方药材及对照品保留时间和紫外光谱图比对，对共有峰进行归属并指认了部分色谱峰，改变了单一成分或其中几种有效成分进行质量控制的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及复方大黄清胰汤指纹图谱的建立方法，以及利用上述方法建立的复方大黄清胰汤指纹图谱。
背景技术
中药指纹图谱能更全面的反映药品中化学成分的信息，广泛用于中药材或中成药的质量控制。中药及其制剂均属于多组分复杂体系，评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材、半成品以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。
复方大黄清胰汤剂是遵义医学院附属医院经验方剂，由大黄、赤芍、栀子、延胡索、丹皮、木香、厚朴及芒硝8味药材组成，具有疏肝利胆、清热泻火、止痛通便的功效，临床常用于治疗AP和SAP，疗效显著。现代医学研究表明，清胰复方的作用机制是多方面的，能抑制胰酶释放及其活性，增加肠蠕动；短期内促进肠排空，减轻胃肠压力及腹压；改善胃肠道功能和毛细血管通透性；还可以阻断炎症因子释放，减少炎症因子对患者胰腺等器官的损害；防止细菌移位；清除氧自由基，防止过氧化损伤等。清胰Ⅱ号汤剂所含化学成分复杂，含挥发油、蒽醌类、萜类、甾醇类、木脂素类、生物碱等成分。但目前仅有《中国药典》中采用薄层色谱、HPLC鉴别其中药材和检测主要药效成分的含量，难以全面综合评价该复方制剂的内在质量。
发明内容
本发明的第一目的是提供复方大黄清胰汤指纹图谱的建立方法。
本发明的第二目的是提供一种复方大黄清胰汤指纹图谱。
为了实现上述第一目的，本发明提供复方大黄清胰汤指纹图谱的建立方法，其包括以下步骤：
步骤一：制备对照品溶液：分别配制栀子苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、延胡索乙素对照品储备溶液；再分别精密取上述对照品储备液，加甲醇溶液制得每1 mL含栀子苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、延胡索乙素分别为6～100μg的混合对照品溶液。
步骤二：制备供试品溶液 ：称取复方大黄清胰汤于离心管中，加入适量甲醇，称定重量，超声，放冷，甲醇补足减少的重量， 离心，取全部上清，挥去溶剂，残渣加甲醇溶解并定容至一定体积，摇匀，滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；同法分别制备大黄、赤芍、木香、丹皮、厚朴、栀子、延胡索单味药材供试品溶液；
步骤三：对供试品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取样品溶液与参照物溶液各10μL，注入液相色谱仪测定，记录150min图谱；高效液相色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为220~400nm；柱温为25~40 ℃; 流速为0 .8~1 .2 mL/min。流动相A和B分别为，甲醇－水、甲醇－0.2v/v％冰醋酸水溶液、甲醇－0.2%磷酸水溶液、乙腈－水、乙腈－0 .1v/v％磷酸水溶液、乙腈－0 .2v/v％磷酸水溶液、乙腈－0 .1v/v％冰醋酸水溶液、乙腈－0 .1v/v％甲酸水溶液。流动相进行梯度洗脱，洗脱程序以如下体积浓度配制进行：0～100min，2%～30% 流动相A，98%～70% 流动相B；100～150 min，30%～85%流动相 A，70%～15%流动相 B。
优选地，所述对照品溶液具体配制方法为：
A.栀子苷对照品溶液的制备 ：精密称取栀子苷对照品适量，用甲醇配制成每 1ml含盐酸小檗碱 0.1～2mg的溶液；
B. 芍药苷对照品溶液的制备 ：精密称取芍药苷对照品适量，用甲醇配制成每1ml 含芍药苷0.1～2mg的溶液；
C.丹皮酚对照品溶液的制备 ：精密称取丹皮酚对照品适量，用甲醇配制成每 1ml含丹皮酚0.1～2mg的溶液；
D.芦荟大素对照品溶液的制备 ：精密称取芦荟大黄素对照品适量，用甲醇配制成每 1ml 含芦荟大素0.1～2mg的溶液；
E.大黄酸对照品溶液的制备 ：精密称取大黄酸对照品适量，用甲醇配制成每 1ml含大黄酸0.1～2mg的溶液；
F.大黄素对照品溶液的制备 ：精密称取大黄素对照品适量，用甲醇配制成每 1ml含大黄素0.1～2mg的溶液；
G.大黄酚对照品溶液的制备 ：精密称取大黄酚对照品适量，用甲醇配制成每 1ml含大黄酚0.1～2mg的溶液；
H.大黄素甲醚对照品溶液的制备 ：精密称取大黄素甲醚对照品适量，用大黄素甲醚配制成每 1ml 含大黄酚0.1～2mg的溶液；
I.和厚朴酚对照品溶液的制备 ：精密称取和厚朴酚对照品适量，用和厚朴酚配制成每 1ml 含和厚朴酚0.1～2mg的溶液；
J.厚朴酚对照品溶液的制备 ：精密称取厚朴酚对照品适量，用厚朴酚配制成每1ml 含厚朴酚0.1～2mg的溶液；
K.木香烃内酯对照品溶液的制备 ：精密称取木香烃内酯对照品适量，用木香烃内酯配制成每 1ml 含木香烃内酯0.1～2mg的溶液；
L.去氢木香烃内酯对照品溶液的制备 ：精密称取去氢木香烃内酯对照品适量，用去氢木香烃内酯配制成每 1ml 含去氢木香烃内酯0.1～2mg的溶液；
M.延胡索乙素对照品溶液的制备 ：精密称取去延胡索乙素对照品适量，用延胡索乙素配制成每 1ml 含延胡索乙素0.1～2mg的溶液；
N.再分别精密取上述各对照品储备液，加甲醇溶液制得每1 mL含栀子苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、延胡索乙素分别为6～100μg的混合对照品溶液。
优选地，所述供试品溶液制备方法为精密量取复方大黄清胰汤剂5 mL于50 mL离心管中，加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，甲醇补足减少的重量，3500 r/min 离心10 min，取全部上清，挥去溶剂，残渣加的甲醇溶液溶解并定容至5 mL ，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。同法分别制备大黄、赤芍、木香、丹皮、厚朴、栀子、延胡索单味药材供试品溶液。
优选地，所述步骤三中色谱条件所述柱温为30 ℃。
优选地，所述步骤三中色谱条件所述检测波长为327 nm。
优选地，所述步骤三中色谱条件所述流速为1.0 mL/min。
优选地，所述步骤三中流动相流动相A为乙腈，流动相B为0 .1v/v％磷酸水溶液，进行梯度洗脱，洗脱程序以如下：
0～10 min，2%～10% 流动相A，98%～90% 流动相B；
10～100 min，10%～30%流动相 A,90%～70% 流动相B；
100～130 min，30%～55%流动相 A，70%～45% 流动相 B；
130～150 min，55%～85% 流动相A，45%～15% 流动相B。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种复方大黄清胰汤剂指纹图谱，它含有42个共有峰，其中11、13、23、31、36、37、38、39、40、41、42号峰，分别为栀子苷、芍药苷、延胡索乙素、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、和厚朴酚、去氢木香烃内酯、厚朴酚、大黄酚，其保留时间分别为26.184±0.085 min、33.525±0.136 min、58.342±0.307 min、93.147±0.284 min、114.825±0.255 min、120.578±0.120、132.655±0.100 min、134.646±0.055min、137.236±0.066 min、138.921±0.042 min、141.183±0.073 min。清胰Ⅱ号汤剂指纹图谱还包括1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰、12号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰、22号峰、24号峰、25号峰、26号峰、27号峰、28号峰、29号峰、30号峰、32号峰、33号峰、34号峰、35号峰，其保留时间分别为9.480±0.092 min、12.480±0.049 min、13.940±0.043 min、14.784±0.039 min、15.319±0038 min、15.635±0.050 min、15.930±0.096 min、17.818±0.058 min、20.684±0.099 min、21.139±0.073 min、29.832±0.112min、38.848±0.147 min、43.836±0.187 min、44.764±0.170 min、47.082±0.240 min、50.097±0.187 min、50.931±0.114min、53.425±0.139 min、55.379±0.274 min、56.877±0.158 min、60.651±0.498 min、64.134±0.129 min、69.730±0.313 min、75.022±0.199 min、83.640±0.115 min、84.596±0.242 min、86.764±0.130 min、95.933±0.089 min、98.745±0.108 min、101.488±0.094 min、111.159±0.030 min。
用本发明所提供的方法所建立的复方大黄清胰汤指纹图谱，能有效地表征复方大黄清胰汤的质量，有利于全面监控制剂的质量。指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而判定复方大黄清胰汤整体质量的片面性，又减少了为质量达标而认为处理的可能性。
本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点，可准确地鉴别产品的真伪优劣。
附图说明
图1为9批复方大黄清胰汤剂HPLC 特征谱图（S1～S9）和对照图谱（R）。
图2为混合对照品的HPLC色谱图。
图3为复方大黄清胰汤剂、大黄、木香、厚朴、延胡索、赤芍、丹皮、栀子的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
复方大黄清胰汤指纹图谱的建立方法，其包括以下步骤：
步骤一：制备对照品溶液：分别配制栀子苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、延胡索乙素对照品储备溶液；再分别精密取上述对照品储备液，加甲醇溶液制得每1 mL含栀子苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、延胡索乙素分别为6～100μg的混合对照品溶液。
步骤二：制备供试品溶液 ：称取复方大黄清胰汤于离心管中，加入适量甲醇，称定重量，超声，放冷，甲醇补足减少的重量， 离心，取全部上清，挥去溶剂，残渣加甲醇溶解并定容至一定体积，摇匀，滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；同法分别制备大黄、赤芍、木香、丹皮、厚朴、栀子、延胡索单味药材供试品溶液；
步骤三：对供试品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取样品溶液与参照物溶液各10μL，注入液相色谱仪测定，记录150min图谱；高效液相色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为220~400nm；柱温为25~40 ℃; 流速为0 .8~1 .2 mL/min。流动相A和B分别为，甲醇－水、甲醇－0.2v/v％冰醋酸水溶液、甲醇－0.2%磷酸水溶液、乙腈－水、乙腈－0 .1v/v％磷酸水溶液、乙腈－0 .2v/v％磷酸水溶液、乙腈－0 .1v/v％冰醋酸水溶液、乙腈－0 .1v/v％甲酸水溶液。流动相进行梯度洗脱，洗脱程序以如下体积浓度配制进行：0～100min，2%～30% 流动相A，98%～70% 流动相B；100～150 min，30%～85%流动相 A，70%～15%流动相 B。
优选地，所述对照品溶液具体配制方法为：
A.栀子苷对照品溶液的制备 ：精密称取栀子苷对照品适量，用甲醇配制成每 1ml含盐酸小檗碱 0.1～2mg的溶液；
B. 芍药苷对照品溶液的制备 ：精密称取芍药苷对照品适量，用甲醇配制成每1ml 含芍药苷0.1～2mg的溶液；
C.丹皮酚对照品溶液的制备 ：精密称取丹皮酚对照品适量，用甲醇配制成每 1ml含丹皮酚0.1～2mg的溶液；
D.芦荟大素对照品溶液的制备 ：精密称取芦荟大黄素对照品适量，用甲醇配制成每 1ml 含芦荟大素0.1～2mg的溶液；
E.大黄酸对照品溶液的制备 ：精密称取大黄酸对照品适量，用甲醇配制成每 1ml含大黄酸0.1～2mg的溶液；
F.大黄素对照品溶液的制备 ：精密称取大黄素对照品适量，用甲醇配制成每 1ml含大黄素0.1～2mg的溶液；
G.大黄酚对照品溶液的制备 ：精密称取大黄酚对照品适量，用甲醇配制成每 1ml含大黄酚0.1～2mg的溶液；
H.大黄素甲醚对照品溶液的制备 ：精密称取大黄素甲醚对照品适量，用大黄素甲醚配制成每 1ml 含大黄酚0.1～2mg的溶液；
I.和厚朴酚对照品溶液的制备 ：精密称取和厚朴酚对照品适量，用和厚朴酚配制成每 1ml 含和厚朴酚0.1～2mg的溶液；
J.厚朴酚对照品溶液的制备 ：精密称取厚朴酚对照品适量，用厚朴酚配制成每1ml 含厚朴酚0.1～2mg的溶液；
K.木香烃内酯对照品溶液的制备 ：精密称取木香烃内酯对照品适量，用木香烃内酯配制成每 1ml 含木香烃内酯0.1～2mg的溶液；
L.去氢木香烃内酯对照品溶液的制备 ：精密称取去氢木香烃内酯对照品适量，用去氢木香烃内酯配制成每 1ml 含去氢木香烃内酯0.1～2mg的溶液；
M.延胡索乙素对照品溶液的制备 ：精密称取去延胡索乙素对照品适量，用延胡索乙素配制成每 1ml 含延胡索乙素0.1～2mg的溶液；
N；再分别精密取上述对照品储备液，加甲醇溶液制得每1 mL含栀子苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、延胡索乙素分别为6～100μg的混合对照品溶液。
优选地，所述供试品溶液制备方法为精密量取复方大黄清胰汤剂5 mL于50 mL离心管中，加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，甲醇补足减少的重量，3500 r/min 离心10 min，取全部上清，挥去溶剂，残渣加的甲醇溶液溶解并定容至5 mL ，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。同法分别制备大黄、赤芍、木香、丹皮、厚朴、栀子、延胡索单味药材供试品溶液。
优选地，所述步骤三中色谱条件所述柱温为30 ℃。
优选地，所述步骤三中色谱条件所述检测波长为327 nm。
优选地，所述步骤三中色谱条件所述流速为1.0 mL/min。
优选地，所述步骤三中流动相流动相A为乙腈，流动相B为0 .1v/v％磷酸水溶液，进行梯度洗脱，洗脱程序以如下：
0～10 min，2%～10% 流动相A，98%～90% 流动相B；
10～100 min，10%～30%流动相 A,90%～70% 流动相B；
100～130 min，30%～55%流动相 A，70%～45% 流动相 B；
130～150 min，55%～85% 流动相A，45%～15% 流动相B。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种复方大黄清胰汤指纹图谱，它含有42个共有峰，其中11、13、23、31、36、37、38、39、40、41、42号峰，分别为栀子苷、芍药苷、延胡索乙素、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、和厚朴酚、去氢木香烃内酯、厚朴酚、大黄酚，其保留时间分别为26.184±0.085 min、33.525±0.136 min、58.342±0.307 min、93.147±0.284 min、114.825±0.255 min、120.578±0.120、132.655±0.100 min、134.646±0.055min、137.236±0.066 min、138.921±0.042 min、141.183±0.073 min。清胰Ⅱ号汤剂指纹图谱还包括1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰、12号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰、22号峰、24号峰、25号峰、26号峰、27号峰、28号峰、29号峰、30号峰、32号峰、33号峰、34号峰、35号峰，其保留时间分别为9.480±0.092 min、12.480±0.049 min、13.940±0.043 min、14.784±0.039 min、15.319±0038 min、15.635±0.050 min、15.930±0.096 min、17.818±0.058 min、20.684±0.099 min、21.139±0.073 min、29.832±0.112min、38.848±0.147 min、43.836±0.187 min、44.764±0.170 min、47.082±0.240 min、50.097±0.187 min、50.931±0.114min、53.425±0.139 min、55.379±0.274 min、56.877±0.158 min、60.651±0.498 min、64.134±0.129 min、69.730±0.313 min、75.022±0.199 min、83.640±0.115 min、84.596±0.242 min、86.764±0.130 min、95.933±0.089 min、98.745±0.108 min、101.488±0.094 min、111.159±0.030 min。
1、材料
1.1、仪器
1260型液相色谱仪，包括DAD检测器（美国Agilent公司），BT125D电子天平（德国Sartorius公司），JA1002电子天平（上海浦春计量仪器有限公司），Exceed-Cd-20 型实验室超纯水机（成都艾科水处理设备有限公司），DL-820D超声仪（上海之信仪器有限公司）。
1.2、试剂
大黄素、大黄酸、丹皮酚（购自中国食品药品检定研究院，批号分别为（110756-201512、110757-201607、110708-201407 ，纯度98.7%、99.3%、99.9%），芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、栀子苷、芍药苷、延胡索乙素、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯（购自成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为MUST-17030605、MUST-17030603、MUST-17030622、MUST-17020401、MUST-16041901、MUST-17022720、MUST-17031102、MUST-17020205、MUST-16050705、MUST-16041601，纯度98.64%、99.01%、99.27%、99.03%、99.30%、99.86%、99.71%、99.34%、98.29%、99.69%），9批清胰Ⅱ号汤剂（遵义医学院附属医院药剂科代煎，依次标记为S1～S9）。
1.3、药材
大黄（产地四川，批号160301）、赤芍（产地四川，批号160301）、炒栀子（产地四川，批号160601）、丹皮（产地四川，批号160801）、姜厚朴（产地四川，批号160701）、醋延胡索（产地浙江，批号160801）、木香（产地云南，批号160601）均购自重庆慧远药业有限公司，芒硝（产地青海，批号160302121 ）康美药业股份公司，经遵义医学院杨建文主任药师鉴定以上中药饮片均合格。甲醇、乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。
2、方法与结果
2.1、色谱条件
UItimate LP-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序：0～10 min，2%～10% A；10～100 min，10%～30% A；100～130min，30%～55% A；130～150 min，55%～85% A；柱温：30℃；流速：1 mL/min，检测波长：237nm，进样量10 μL。
2.2、溶液的制备
2.2.1单个对照品溶液的制备
精密称取栀子苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、延胡索乙素对照品5.03、4.95、5.06 、4.94、4.90、4.83、4.71、5.29、5.11、5.14、5.15、5.16、5.21 mg，加甲醇溶解分别定容至5mL，得单个对照品溶液。
2.2.2 混合对照品溶液的制备
分别精密量取上述单个对照品溶液150、150、35、120、100、40、50、230、230、470、90、90、90 μL，加甲醇稀释至5 mL，得栀子苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、延胡索乙素的含量分别为94.63、45.56、46.57、6.92、23.53、19.30、7.54、10.58、30.93、30.99、18.41、18.52、18.74 μg/mL的混合对照品溶液。
2.2.3供试品溶液的制备
精密量取复方大黄清胰汤剂5 mL于50 mL离心管中，加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，甲醇补足减少的重量，3500 r/min 离心10 min，取全部上清，挥去溶剂，残渣加甲醇溶解并定容至5 mL ，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，即得。
2.2.4 单味药材供试品溶液的制备
按复方大黄清胰汤剂制备方法分别制得大黄、赤芍、木香、丹皮、厚朴、栀子、延胡索提取液。按2.2.3项下方法制备单味药材供试品溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.3、指纹图谱建立
2.3.1、精密度、稳定性、重复性试验
按2.1项下色谱条件，取同一供试品溶液，连续进样6次考察精密度，分别在0、3、6、9、12、24、36 h进样测定考察稳定性，均记录主要色谱峰的相对保留时间和峰面积，并计算RSD。重复性试验中，取同一批供试品，按2.2.3项下方法平行制备6 份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样检测，记录主要色谱峰的相对保留时间和峰面积，并计算RSD。结果，精密度、稳定性和重复性试验中，42个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别均小于0.37%、9.33%，0.84%、8.34%和0.71%、7.95%，结果表明建立的分析方法精密度、重复性良好，供试品溶液在36 h 内稳定。
2.3.2、指纹图谱的建立与相似度分析
按2.1项下色谱条件检测9批复方大黄清胰汤剂供试品溶液（S1～S9）、混合对照品溶液和单味药材供试品溶液，通过色谱峰的对比分析，对主要色谱峰进行药材来源和化学指认。将各批次供试品溶液的色谱图导入 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2012版》，选择S1作为参照图谱，进行多点校正、谱峰匹配，并生成对照图谱，进一步计算各批次供试品的相似度。
结果，9批复方大黄清胰汤剂的HPLC指纹图谱（图1 S1～S9）经相似度软件匹配，共确认42个共有峰，并生成对照品图谱，（图1R）。将供试品溶液色谱图与大黄、木香、厚朴、延胡索、赤芍、丹皮、栀子、混合对照品色谱图（图3）进行对比分析，2~7、10、11、15 、19、20、25、26、27、35 号峰来源于栀子，12 号来源于赤芍，共有峰 16、18 、24、28、29、30、33、34、37、38、42 号来源于大黄，23号来源于延胡索，31 号来源于丹皮，36、39、41 号来源于厚朴，40号来源于木香，1号来源于栀子和赤芍，8、22号来源于栀子和大黄，9号来源于丹皮、木香和厚朴，14号来源于丹皮、大黄和厚朴，13、17、21、32号来源于赤芍和丹皮；通过与混合对照品色谱图（图2 ）对比分析，对供试品色谱图中11个色谱峰进行化学指认，其中11、13、23、31、36、37、38、39、40、41、42号峰分别为栀子苷、芍药苷、延胡索乙素、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、和厚朴酚、去氢木香烃内酯、厚朴酚、大黄酚，其中栀子苷峰面积较大且稳定，选择11号峰（栀子苷）作为参照峰，计算各批次样品共有峰的均值相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPA），结果分别见表1、2，相似度结果见表3。结果表明，9批清胰Ⅱ号汤剂的相似度较高，达到0.892～1.000，说明样品质量较一致，符合指纹图谱相似度的要求。
表1 9批复方大黄清胰汤共有峰相对保留时间
表2 9批复方大黄清胰汤共有峰相对峰面积
表3 9批复方大黄清胰汤相似度结果
Claims (1)
1.一种复方大黄清胰汤指纹图谱的建立方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一，所述供试品溶液的制备为精密量取复方大黄清胰汤剂5 mL于50 mL离心管中，加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，甲醇补足减少的重量，3500 r/min 离心10 min，取全部上清，挥去溶剂，残渣加甲醇溶解并定容至5 mL ，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；同法分别制备大黄、赤芍、木香、丹皮、厚朴、栀子、延胡索单味药材供试品溶液；
步骤二，所述对照品溶液的制备为分别取栀子苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、延胡索乙素对照品适量，精密称定，分别加甲醇溶液制成每1 mL含栀子苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、延胡索乙素1 mg的单个对照品母液，再分别精密取上述对照品母液适量，加甲醇溶液制得每1 mL含栀子苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯、去氢木香烃内酯、延胡索乙素分别为6～100μg的混合对照品溶液；
步骤三，对供试品溶液和混合对照品溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取样品溶液与参照物溶液各10μL，注入液相色谱仪测定，记录150min图谱；高效液相色谱条件如下：
色谱柱：UItimate LP-C18 色谱柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；
检测器：二极管阵列检测器或紫外检测器；
流动相A和B分别为，乙腈和0.1v/v％磷酸水溶液；
流动相进行梯度洗脱，洗脱程序以如下体积浓度配制进行：
0～10 min，2%～10% 流动相A，98%～90% 流动相B；
10～100 min，10%～30%流动相 A,90%～70% 流动相B；
100～130 min，30%～55%流动相 A，70%～45% 流动相 B；
130～150 min，55%～85% 流动相A，45%～15% 流动相B；
流速为1.0 ml/min；
柱温为30 ℃；
检测波长为327 nm；
步骤四，将步骤三得到的色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，进行多点校正、谱峰匹配，并生成对照特征图谱，计算相似度，其指纹图谱特征在于：含有42个共有峰，其中11、13、23、31、36、37、38、39、40、41、42号峰，分别为栀子苷、芍药苷、延胡索乙素、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、和厚朴酚、去氢木香烃内酯、厚朴酚、大黄酚，其保留时间分别为26.184±0.085 min、33.525±0.136 min、58.342±0.307 min、93.147±0.284min、114.825±0.255 min、120.578±0.120、132.655±0.100 min、134.646±0.055 min、137.236±0.066 min、138.921±0.042 min、141.183±0.073 min；复方大黄清胰汤剂指纹图谱特征共有峰还包括1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰、12号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰、22号峰、24号峰、25号峰、26号峰、27号峰、28号峰、29号峰、30号峰、32号峰、33号峰、34号峰、35号峰，其保留时间分别为9.480±0.092 min、12.480±0.049 min、13.940±0.043 min、14.784±0.039 min、15.319±0038 min、15.635±0.050 min、15.930±0.096 min、17.818±0.058min、20.684±0.099 min、21.139±0.073 min、29.832±0.112min、38.848±0.147 min、43.836±0.187 min、44.764±0.170 min、47.082±0.240 min、50.097±0.187 min、50.931±0.114 min、53.425±0.139 min、55.379±0.274 min、56.877±0.158 min、60.651±0.498 min、64.134±0.129 min、69.730±0.313 min、75.022±0.199 min、83.640±0.115 min、84.596±0.242 min、86.764±0.130 min、95.933±0.089 min、98.745±0.108 min、101.488±0.094 min、111.159±0.030 min。
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