CN108593833B - 一种宽叶羌活的hplc检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种宽叶羌活的HPLC检测方法。本发明的宽叶羌活HPLC检测方法，能同时检测宽叶羌活药材中的5种成分，且本法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高，可以有效地评价宽叶羌活药材的质量。

Description

一种宽叶羌活的HPLC检测方法
技术领域
本发明具体涉及一种宽叶羌活的HPLC检测方法。
背景技术
宽叶羌活Notopterygium franchetii H.de Boiss.为伞形科羌活属多年生草本植物，俗称黑药，药用部位主要为其干燥根茎及根，主要分布在四川西北部、青海、甘肃、西藏东部等高原地区。在临床上常用于治疗风寒感冒、头痛、风湿痹痛等症。现代研究表明宽叶羌活药材具有抗炎、镇痛解热、抗心律失常、抗心肌缺血和抗菌等作用。挥发油、香豆素类、有机酸类化合物是宽叶羌活中最主要的三大类活性成分。研究发现阿魏酸具有抗炎、抗氧化、抗辐射和抗肿瘤等作用；羌活醇和异欧前胡素具有镇痛、舒张血管、抗病毒活性作用；紫花前胡苷有镇痛、抗炎、改善学习记忆等作用；佛手柑内酯有抗衰老、抗肿瘤等作用。
关于宽叶羌活药材的成分含量测定已有许多报道，但只是测定其中的2或3种成分，如高建邦，宋平顺，郁霞.HPLC法同时测定羌活中异欧前胡素和阿魏酸含量[J].中药材，2010,33(02):231-233.，同时测定了异欧前胡素和阿魏酸的含量。目前中国药典2015年版一部主要以羌活醇和异欧前胡素的含量之和控制宽叶羌活药材的质量。众所周知中药的多效性源于其复杂的化学成分，仅靠一两个成分的含量测定不能反映其他成分的情况，难以真正控制其质量。选择更多的成分作为指标进行质量控制研究，更能合理、全面评价宽叶羌活药材质量。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种宽叶羌活的HPLC检测方法。
本发明的宽叶羌活HPLC检测方法，包括如下操作步骤：
1)对照品溶液制备：取对照品，溶解，即得对照品溶液；
2)供试品溶液制备：取宽叶羌活药材，提取，即得供试品溶液；
3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：310～320nm；流动相：0.2～0.4％醋酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；梯度洗脱程序如下：
Figure BDA0001681184790000011
Figure BDA0001681184790000021
其中，步骤1)所述对照品包括：紫花前胡苷对照品、阿魏酸对照品、佛手柑内酯对照品、羌活醇对照品、异欧前胡素对照品。
其中，步骤1)所述溶解是加入甲醇溶解。
其中，步骤2)所述提取是指：加入甲醇，超声提取。
其中，步骤2)所述提取方法如下：
取宽叶羌活药材，加入药材60～100w/v(g/ml)倍的甲醇，超声提取10～60分钟，放冷，用甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
进一步地，所述提取方法如下：
取宽叶羌活药材粉末，置具塞锥形瓶中，精密加入药材83w/v(g/ml)倍的甲醇，称定其质量，超声提取30分钟，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
其中，所用色谱柱为GL Sciences Wondasil C18色谱柱；规格为4.6mm×250mm，5μm。
其中，所述检测波长为315nm。
其中，所述流动相A为0.3％醋酸水溶液。
其中，所述色谱条件还包括：
流速为1.0mL/min；和/或，柱温为25℃；和/或，进样量为10μL。
本发明的宽叶羌活HPLC检测方法，能同时定量检测宽叶羌活药材中的5种成分，且本法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高，可以有效地评价宽叶羌活药材的质量。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1对照品HPLC图，1.紫花前胡苷；2.阿魏酸；3.佛手柑内酯；4.羌活醇；5.异欧前胡素
图2供试品HPLC图，1.紫花前胡苷；2.阿魏酸；3.佛手柑内酯；4.羌活醇；5.异欧前胡素
具体实施方式
仪器与试药
1仪器
Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；KQ5200E型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；SQP型电子分析天平(万分之一赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
2试药
有机溶剂包括甲醇(分析纯)、冰醋酸(成都市科隆化学品有限公司)；色谱乙腈(成都市科隆化学品有限公司)；纯净水。
对照品阿魏酸、佛手柑内酯、紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素均购自于成都曼斯特生物科技有限公司，各对照品纯度都达99％及其以上。
样品分别来自四川白玉县、小金县；青海祁连县、班玛县；甘肃宕昌县；共计13批。经成都中医药大学蒋桂华教授鉴定均为伞形科植物宽叶羌活Notopterygium franchetiiH.de Boiss.的干燥根及根茎，具体信息见表1。
表1不同批次宽叶羌活药材样品信息
Figure BDA0001681184790000031
Figure BDA0001681184790000041
实施例1本发明检测方法用于宽叶羌活药材的定量检测
1对照品溶液制备：取对照品紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素，精密称定，以甲醇溶解，摇匀并定容，制成含紫花前胡苷(239.00μg·mL-1)、阿魏酸(174.00μg·mL-1)、佛手柑内酯(237.00μg·mL-1)、羌活醇(270.00μg·mL-1)和异欧前胡素(217.00μg·mL-1)的混合对照品贮备液。
2供试品溶液制备：取宽叶羌活粉末(过三号筛)0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定其质量，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
3分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：色谱柱为GL Sciences Wondasil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；乙腈(B)-0.3％醋酸水(A)为流动相；流速1.0mL·min-1；柱温25℃；检测波长为315nm；梯度洗脱如下：
Figure BDA0001681184790000042
4制作标准曲线：以对照品峰面积为纵坐标(Y)，以对照品进样量X(μg)为横坐标。根据标准曲线，分别计算供试品中紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素的含量。对照品高效液相色谱图参见图1，供试品高效液相色谱图参见图2。
实施例2本发明检测方法用于宽叶羌活药材的定性检测
1对照品溶液制备：取对照品紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素，精密称定，以甲醇溶解，摇匀并定容，制成含紫花前胡苷(239.00μg·mL-1)、阿魏酸(174.00μg·mL-1)、佛手柑内酯(237.00μg·mL-1)、羌活醇(270.00μg·mL-1)和异欧前胡素(217.00μg·mL-1)的混合对照品贮备液。
2供试品溶液制备：取宽叶羌活粉末(过三号筛)0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定其质量，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
3分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：色谱柱为GL Sciences Wondasil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；乙腈(B)-0.3％醋酸水(A)为流动相；流速1.0mL·min-1；柱温25℃；检测波长为315nm；梯度洗脱如下：
Figure BDA0001681184790000051
以下通过实验例来说明本发明的有益效果：
实验例1线性关系考察
分别精密吸取实施例1混合对照品溶液4，8，12，16，20μL，按实施例1中的色谱条件进行分析，测定峰面积。以对照品峰面积为纵坐标(Y)，以对照品进样量X(μg)为横坐标，得线性回归方程，结果见表2。
表2 5个成分的线性回归方程、相关系数和线性范围
Figure BDA0001681184790000052
Figure BDA0001681184790000061
从表2可以看出，本发明的检测方法，五种成分的检出限最低为0.70μg/mL，最高为1.08μg/mL，说明本发明检测方法的灵敏度高；线性范围皆较大，说明准确度好。
实验例2精密度试验
取同一宽叶羌活药材(3号)样品0.3g，精密称定，实施例1的制样方法制备样品，在同一色谱条件下连续进样6次，进样体积均为10μL，记录5个成分的色谱峰面积。结果紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素峰面积RSD分别是1.87％，0.71％，0.53％，1.89％，1.87％。表明本发明检测方法精密度良好。
实验例3稳定性试验
取同一宽叶羌活药材(3号)样品0.3g，精密称定，实施例1的制样方法制备样品，在同一色谱条件下，分别在0，2，4，8，16，24h进样，分别计算5成分峰面积的RSD。结果紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素峰面积RSD分别是0.84％，1.59％，1.11％，1.77％，1.24％。表明供试品溶液24h内稳定性良好。
实验例4重复性试验
分别称取6份同一宽叶羌活药材(3号)样品，各0.3g，精密称定，实施例1的制样方法制备样品，并进行测定。结果表明，紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素6次测定值的RSD分别为2.57％，2.56％，1.83％，2.98％，1.17％。表明方法的重复性良好。
实验例5加样回收率试验
取同一宽叶羌活药材(3号)样品0.1g，精密称定，取混合对照溶液2ml，用甲醇定容至25ml，得紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素浓度分别为19.20mg·L-1、13.98mg·L-1、19.00mg·L-1、21.6mg·L-1、17.4mg·L-1的新混合对照品溶液，分别取0.5、1.0、2.0ml作为加标溶液，每个浓度平行3次。按实施例1的方法制样，按实施例1的色谱条件进样分析，计算回收率，结果见下表3。
表3加样回收率试验(n＝3)
Figure BDA0001681184790000071
从表3可以看出，五种成分的回收率均位于97％～103％之间，本发明检测方法回收率良好，说明本发明检测方法准确度好。
实施例6检测方法条件优化
1提取溶剂和提取方法的选择
比较了甲醇(25ml、50ml)、乙醇、甲醇水(80％)、乙醇水(75％)四种提取溶剂。提取方法比较了超声提取和加热回流以及不同提取时间(30min、45min、60min)。水提取使样品中香豆素类峰面积降低，且明显低于醇提样品所得峰面积；甲醇提取时总色谱峰面积大于乙醇提取得到的总峰面积；超声提取易操作。故最终提取溶剂和方法为：加甲醇25ml超声30min。
2测定波长的确定
采用二极管阵列检测器，对5个被测成分进行190～400nm全波长扫描，图谱结果显示在315nm处均有较大吸收，出峰数量多，故选315nm作为检测波长。
3色谱条件优化
对常用流动相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.3％醋酸水、乙腈-0.3％醋酸水)及流动相梯度分别进行了考察，结果表明乙腈-0.3％醋酸水、梯度洗脱效果好。并在此基础上考察了柱温(25℃、30℃)和体积流量(0.8、1ml/min)对分离效果的影响，柱温25℃，体积流量0.8mL/min时分离效果好。
综上，本发明的宽叶羌活HPLC检测方法，能同时检测宽叶羌活药材中的5种成分，且本法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高，可以有效地评价宽叶羌活药材的质量。

Claims (5)

1.一种宽叶羌活的HPLC检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：
1）对照品溶液制备：取对照品，加甲醇溶解，即得对照品溶液；所述对照品包括：紫花前胡苷对照品、阿魏酸对照品、佛手柑内酯对照品、羌活醇对照品、异欧前胡素对照品；
2）供试品溶液制备：取宽叶羌活药材，加甲醇超声提取，即得供试品溶液；
3）分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：315nm；流动相：0.3%醋酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；梯度洗脱程序如下：
时间/分钟 流动相A/% 流动相B/% 0 85 15 14 65 35 20 65 35 35 40 60 40 25 75 42 85 15 50 85 15
。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2）所述超声提取方法如下：
取宽叶羌活药材，加入药材60～100 w/v，g/ml倍的甲醇，超声提取10～60分钟，放冷，用甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述提取方法如下：
取宽叶羌活药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入药材83 w/v，g/ml倍的甲醇，超声提取30 分钟，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所用色谱柱为GL Sciences WondasilC18色谱柱；规格为 4.6mm×250 mm，5μm。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件还包括：
流速为1.0mL/min；和/或，柱温为25℃；和/或，进样量为10µ L。
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