CN114646690A - 一种枳实薤白桂枝汤中化学成分的检测方法及指纹图谱的建立方法 - Google Patents

一种枳实薤白桂枝汤中化学成分的检测方法及指纹图谱的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种枳实薤白桂枝汤中化学成分的检测方法。与现有技术相比，本发明无需对枳实薤白桂枝汤进行稀释，仅通过采用乙醚萃取，然后经高效液相色谱即可得到分离度高的指纹图谱，有利于更准确地实现枳实薤白桂枝汤的质量控制，同时还可实现枳实薤白桂枝汤中成分尤其是桂皮醛的定量检测，从而能够得到更加准确的质量检测结论。

Description

一种枳实薤白桂枝汤中化学成分的检测方法及指纹图谱的建 立方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，尤其涉及一种枳实薤白桂枝汤中化学成分的检测方法及指纹图谱的建立方法。
背景技术
枳实薤白桂枝汤是中药经典名方，具有很好的治疗效果。而中药与化学药品等的区别在于，中药的由于种植地域的不同以及气候等影响导致了相同的药材不同的药效，因此中药需要严格的质量控制。
中药指纹图谱是目前中药产品质量控制主要手段之一，可更全面的反映中药产品整体特征。目前指纹图谱研究常用的有高效液相色谱法、气相色谱法和薄层色谱法等，其中高效液相色谱法方法重复性好、准确性高，便于推广与执行。
现有技术公开了采用液相色谱和轨道肼高分辨质谱进行成分测定，但是其分离度不佳，造成了指纹图检测结果不准确，不利于枳实薤白桂枝汤产品质量的控制。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种枳实薤白桂枝汤中化学成分的检测方法及指纹图谱的建立方法，该方法结果准确、分离度较高、稳定性良好。
本发明提供了一种枳实薤白桂枝汤中化学成分的检测方法，包括：
S1)将枳实薤白桂枝汤供试品用乙醚萃取，得到萃取液；将萃取液除去溶剂后，再用有机溶剂溶解，得到待测液；
S2)将所述待测液进行高效液相色谱分析，得到待测液的色谱图；
所述高效液相色谱分析的色谱条件为：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相流速为0.8～1.2mL/min；流动相采用梯度洗脱；
流动相A为乙腈；流动相B为0.2％～1％的甲酸溶液。
进一步，以体积百分比计，所述梯度洗脱的程序为：
0～5min，流动相A由5％增加至10％；
5～10min，流动相A由10％增加至15％；
10～15min，流动相A由15％增加至20％；
15～20min，流动相A由20％增加至30％；
20～35min，流动相A由30％增加至35％；
35～50min，流动相A由35％增加至90％；
50～60min，流动相A为90％；
或0～15min，流动相A由5％增加至20％；
15～20min，流动相A由20％增加至30％；
20～40min，流动相A由30％增加至45％；
40～55min，流动相A由45％增加至90％；
55～65min，流动相A为90％；
或0～15min，流动相A由5％增加至20％；
15～20min，流动相A由20％增加至30％；
20～40min，流动相A由30％增加至40％；
40～55min，流动相A由40％增加至90％；
55～65min，流动相A为90％；
或0～15min，流动相A由5％增加至20％；
15～20min，流动相A由20％增加至30％；
20～30min，流动相A由30％增加至35％；
30～40min，流动相A由35％增加至45％；
40～55min，流动相A由45％增加至90％。
优选的，以体积百分比计，所述梯度洗脱的程序为：
0～15min，流动相A由5％增加至20％；
15～20min，流动相A由20％增加至30％；
20～30min，流动相A由30％增加至35％；
30～40min，流动相A由35％增加至45％；
40～55min，流动相A由45％增加至90％。
进一步地，将桂皮醛与有机溶剂混合，得到桂皮醛对照品溶液；
将所述桂皮醛对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，得到桂皮醛对照品的色谱图；
根据所述桂皮醛对照品溶液的浓度、所述桂皮醛对照品溶液在色谱图中的峰面积以及待测液中桂皮醛在色谱图中的峰面积，以外标法计算枳实薤白桂枝汤中桂皮醛的含量。
与现有技术相比，本发明无需对枳实薤白桂枝汤进行稀释，仅通过采用乙醚萃取，然后经高效液相色谱即可得到分离度高的指纹图谱，有利于更准确地实现枳实薤白桂枝汤的质量控制，同时还可实现枳实薤白桂枝汤中成分尤其是桂皮醛的定量检测，从而能够得到更加准确的质量检测结论。
在上述方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
在本发明中，所述枳实薤白桂枝汤供试品为本领域技术人员熟知的枳实薤白桂枝汤(水煎液即可)并无特殊的限制。
在步骤S1)中，将枳实薤白桂枝汤供试品用乙醚萃取；所述萃取的次数优选为2～4次，更优选为3次；每次萃取时所述枳实薤白桂枝汤供试品与乙醚的体积比优选为1：(1～4)，更优选为1：(2～3)，再优选为1：2。
萃取后，将有机相除去溶剂，再用有机溶剂溶解定容，得到待测液。
进一步地，所述步骤S1)中的有机溶剂优选为甲醇；所述枳实薤白桂枝汤供试品与待测液的体积比优选为1：(0.8～1.2)，更优选为1：(0.9～1.1)，再优选为1：1。
将桂皮醛与有机溶剂混合，得到桂皮醛对照品溶液；所述有机溶剂优选为甲醇；在建立枳实薤白桂枝汤中化学成分指纹图谱时，所述桂皮醛对照品溶液中桂皮醛的含量优选为5～15μg/mL，更优选为8～12μg/mL，再优选为10μg/mL。
将所述待测液与桂皮醛对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，得到待测液与桂皮醛对照品的色谱图。
在本发明中，所述待测液与桂皮醛对照品溶液的进样量各自独立地优选为10～20μL，更优选为10μL。
所述高效液相色谱分析的色谱条件为：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；进一步地，所述色谱柱的理论塔板数按桂皮醛计不低于3000。
进一步地，所述高效液相色谱分析的色谱柱优选为C18；4.6mm×250mm，5μm(理论塔板数按桂皮醛计不低于3000)；更优选为ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm；再优选为Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm。本发明采用上述色谱柱，可以对样品成分进行很好的保留及得到较好的峰型。
所述色谱柱的柱温优选为25℃～35℃。
进一步地，在所述步骤S2)中高效色谱分析时流动相的流速优选为0.8～1.2mL/min，更优选为1mL/min。
流动相采用梯度洗脱，其中流动相A为乙腈；流动相B为0.2％～1％的甲酸溶液，优选为0.2％～0.5％的甲酸溶液，更优选为0.2％的甲酸溶液。
进一步地，以体积百分比计，所述梯度洗脱的程序为：
0～15min，流动相A由5％增加至20％；
15～20min，流动相A由20％增加至30％；
20～30min，流动相A由30％增加至35％；
30～40min，流动相A由35％增加至45％；
40～55min，流动相A由45％增加至90％。
该洗脱梯度为最优梯度，在此条件下，各个色谱峰分量情况良好，检测结果更加准确、可靠。
进一步地，所述高效液相色谱分析的检测波长优选为286nm。
进一步地，在定量检测中，所述桂皮醛对照品溶液的进样浓度优选为2.66052～133.026μg/ml；在此范围内，所述桂皮醛的含量与其色谱峰峰面积积分值呈良好的线性关系；所述桂皮醛含量的回归方程优选为：y＝100029.6635x-3074.3230，r＝1.0000。
在本发明中，所述高效液相色谱分析的色谱条件最优选为：
色谱柱温度为30℃；
所述检测器波长为286nm；
所述色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm；
所述流动相流速为1.0mL/min；
所述进样量为10μL。本发明在上述色谱条件下，各成分与相邻色谱峰分离效果较好，从而能够得到很好的指纹图谱。
本发明还提供了一种枳实薤白桂枝汤中化学成分指纹图谱的建立方法，包括：采用上述枳实薤白桂枝汤中化学成分的检测方法，得到枳实薤白桂枝汤中化学成分的指纹图谱。
进一步地，采用上述枳实薤白桂枝汤中化学成分的检测方法得到枳实薤白桂枝汤中化学成分的色谱图，按中药色谱指纹图谱相似性评价系统，经相似度计算，相似度不低于0.90。本发明得到的指纹图谱相似度高，结果准确。
进一步地，所述枳实薤白桂枝汤中化学成分的指纹图谱有31个共有峰，以20号峰为对照峰，共有峰的相对保留时间分别为：1号峰0.1705±0.00025，2号峰0.1767±0.0002，3号峰0.217±0.0005，4号峰0.2637±0.00035，5号峰0.3573±0.00025，6号峰0.4271±0.0003，7号峰为0.5341±0.0005，8号峰为0.5533±0.0003，9号峰为0.5983±0.0003，10号峰为0.63275±0.0002，11号峰为0.6491±0.00023，12号峰为0.6581±0.00025，13号峰为0.7118±0.00013，14号峰为0.7366±0.00025，15号峰为0.7507±0.00022，16号峰为0.7625±0.00022，17号峰为0.7701±0.00022，18号峰为0.85855±0.0001，19号峰为0.9406±0.00005，20号峰为1.000，21号峰为1.03095±0.0002，22号峰为1.0446±0.0005，23号峰为1.1411±0.00021，24号峰为1.18555±0.00023，25号峰为1.20004±0.0002，26号峰为1.287±0.00025，27号峰为1.30856±0.0004，28号峰为1.3198±0.00055，29号峰为1.38604±0.00064，30号峰为1.467±0.001，31号峰为1.527±0.0011。
与现有技术相比，本发明无需对枳实薤白桂枝汤进行稀释，仅通过采用乙醚萃取，然后经高效液相色谱即可得到分离度高的指纹图谱，有利于更准确地实现枳实薤白桂枝汤的质量控制，同时还可实现枳实薤白桂枝汤中成分尤其是桂皮醛的定量检测，从而能够得到更加准确的质量检测结论。
附图说明
图1为本发明实施例1中得到的枳实薤白桂枝汤的指纹图谱；
图2为本发明实施例1中得到的枳实薤白桂枝汤指纹图谱与其他标准样品对照谱图；
图3为本发明实施例2中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图4为本发明对比例1中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图5为本发明实施例1与对比例1色谱比较图；
图6为本发明实施例3中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图7为本发明实施例4中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图8为本发明实施例5中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图9为本发明实施例2中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图10为本发明对比例2中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图11为本发明对比例3中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图12为本发明实施例3～6及对比例2～3色谱比较图；
图13为本发明实施例7中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图14为本发明对比例4中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图15为本发明对比例5中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图16为本发明实施例7、对比例4与对比例5的色谱比较图；
图17为本发明实施例11中6批样品相似度检测的色谱图；
图18为本发明实施例12中桂皮醛含量线性图；
图19为本发明实施例17中枳实薤白桂枝汤供试品溶液、桂皮醛对照片溶液及空白溶剂色谱比较图；
图20为本发明实施例18中按照药典方法得到的桂皮醛对照品色谱图；
图21为本发明实施例18中按照药典方法得到的枳实薤白桂枝汤供试品的色谱图；
图22为本发明实施例18中按照药典方法得到的枳实薤白桂枝汤萃取后水液样品的色谱图；
图23为本发明对比例6中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图24为本发明对比例7中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图25为本发明对比例8中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图26为本发明对比例6～对比例8的色谱比较图；
图27为本发明对比例9中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图28为本发明对比例10中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图29为本发明对比例11中得到的枳实薤白桂枝汤的色谱图；
图30为本发明对比例9～对比例11的色谱比较图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
对照品溶液的制备：取桂皮醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：精密量取待测枳实薤白桂枝汤供试品5ml，加乙醚萃取3次，每次10ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇溶解，并转移至5ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。
测定法(按照高效液相色谱法(通则0512)测定)：分别精密吸取对照品溶液和待测枳实薤白桂枝汤供试品溶液各10μL，注入色谱仪，测定，记录得到的枳实薤白桂枝汤的指纹图谱如图1所示。
按中药色谱指纹图谱相似度评价系统(中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版))，经相似度计算，相似度不得低于0.90，得到枳实薤白桂枝汤的指纹图谱如图1所示。
色谱参数：
色谱柱温度为30℃；
检测器波长为286nm；
色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm；
流动相流速为1.0mL/min；
流动相A为乙腈；流动相B为0.2％甲酸溶液；
梯度洗脱程序：
Figure BDA0002842465340000071
Figure BDA0002842465340000081
由图1可以看出本发明实施例1的方法分离色谱峰数量多，各色谱峰分离度较高，分离效果好，能最好的展现枳实薤白桂枝汤整体物质基础情况；图1中有31个共有峰，其中10号峰为柚皮苷，12号峰为新橙皮苷，18号峰为肉桂酸，20号峰为桂皮醛，30号峰为和厚朴酚，31号峰为厚朴酚。
图2为枳实薤白桂枝汤指纹图谱与其他标准样品对照谱图，图2中自下而上依次为枳实薤白桂枝汤、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、槲皮素、肉桂酸、桂皮醛、和厚朴酚与厚朴酚。
为了说明色谱柱选择的重要性，特做如下实验：
实施例2
供试品溶液的制备：精密量取待测枳实薤白桂枝汤供试品5ml，加乙醚萃取3次，每次10ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇溶解，并转移至5ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。
测定法(按照高效液相色谱法(通则0512)测定)：精密吸取待测枳实薤白桂枝汤供试品溶液10μL，注入色谱仪，测定，记录色谱图，如图3所示。
色谱参数：
色谱柱温度为30℃；
检测器波长为286nm；
色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm；
流动相流速为1.0mL/min；
流动相A为乙腈；流动相B为0.2％甲酸溶液；
梯度洗脱程序：
Figure BDA0002842465340000082
对比例1
其余同实施例1，区别为：色谱柱为Waters Symmetry ShieldTM RP18(4.6*250mm，5μm)。
得到色谱图如图4所示；实施例1与对比例1色谱比较图如图5所示，图5中，从下至上依次为Waters色谱柱与Agilent色谱柱。由图5可知，Waters色谱柱两个最大色谱峰峰分裂，样品过载，而Agilent色谱柱峰型较好。
为了说明洗脱程序的重要性，特做如下实验：
实施例3
其余同实施例2，区别为：洗脱程序为：
Figure BDA0002842465340000091
得到色谱图如图6所示。
实施例4
其余同实施例2，区别为：洗脱程序为：
Figure BDA0002842465340000092
得到色谱图如图7所示。
实施例5
其余同实施例2，区别为：洗脱程序为：
Figure BDA0002842465340000093
Figure BDA0002842465340000101
得到色谱图如图8所示。
实施例6
条件与实施例2相同，得到局部的色谱图如图9所示。
对比例2
其余同实施例2，区别为：洗脱程序为：
Figure BDA0002842465340000102
得到色谱图如图10所示。
对比例3
其余同实施例2，区别为：洗脱程序为：
Figure BDA0002842465340000103
得到色谱图如图11所示。
图12为实施例3～6及对比例2～3色谱比较图，其中从下至上依次为对比例2、对比例3、实施例3、实施例4、实施例5与实施例6。由图12可知，随着流动相梯度的调整，色谱各峰分离度及峰型变得更好。
为了说明萃取溶剂种类的重要性，特做如下实验：
实施例7
条件与实施例2相同，得到色谱图如图13所示。
对比例4
其余同实施例7，区别为：供试品溶液制备：精密量取枳实薤白桂枝汤5ml，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次10ml，合并水饱和的正丁醇液，50℃水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，过滤，即得。
得到色谱图如图14所示。
对比例5
其余同实施例7，区别为：供试品溶液制备：精密量取枳实薤白桂枝汤5ml，用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并乙酸乙酯液，50℃水浴蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，过滤，即得。
得到色谱图如图15所示。
图16为实施例7、对比例4与对比例5的色谱比较图，其中，由下至上依次为实施例7、对比例4与对比例5。由图16可知，乙醚萃取的样品消减了柚皮苷与新橙皮苷峰的高度，使各峰高度相差不大，各峰均能得到较好的呈现，并使极性较小的成分得到较好的提取。
实施例8
精密度实验:取同一枳实薤白桂枝汤，按实施例1的方法制备供试品溶液，按实施例2的色谱条件连续进6针。桂皮醛即20号峰为参照峰，计算31个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值，得到结果见表1与表2。由表1与表2结果显示各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3.0％，表明仪器精密度良好。
表1精密度试验结果(相对保留时间)
Figure BDA0002842465340000121
表2精密度试验结果(相对峰面积)
Figure BDA0002842465340000122
实施例9
稳定性试验：取同批枳实薤白桂枝汤，按实施例1中的方法制备供试品溶液，按实施例2中的色谱条件在0h、2h、4h、8h、12h、16h、24h时间点进样,每次10μL,记录色谱图。计算31个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值，得到结果见表3与表4。结果各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3.0％，表明样品在24h内较稳定。
表3稳定性试验结果(相对保留时间)
Figure BDA0002842465340000131
表4稳定性试验结果(相对峰面积)
Figure BDA0002842465340000132
Figure BDA0002842465340000141
实施例10
重现性试验：取同一样品6份,按实施例1中的方法分别提取后进样,以桂皮醛为参照物,测定其31个共有峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值，得到结果见表5与表6。结果各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于3.0％，表明测定方法的重现性较好。
表5重现性试验结果(相对保留时间)
Figure BDA0002842465340000142
表6重现性试验结果(相对峰面积)
Figure BDA0002842465340000143
Figure BDA0002842465340000151
实施例11
按照实施例1的方法对6批待测样品进行检测，得到结果见表7与图17所示。由表7与图17可知，6批样品相似度均大于0.98，说明样品间相识度良好。
表7 6批样品相似度
样品 1 2 3 4 5 6
相似度 0.983 1 0.999 0.997 0.995 0.998
实施例12
枳实薤白桂枝汤含量线性关系的考察：精密吸取各浓度对的桂皮醛对照品溶液，各进样10μl，按照实施例1的色谱条件进行检测，得到桂皮醛对照品浓度与峰面积结果如表8所示；以进样浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，如图18所示，得回归方程：y＝100,029.6635x-3,074.3230，r＝1.0000。表明桂皮醛在0.0266052～1.33026μg的范围内与其色谱峰面积积分值呈良好的性线关系。
表8对照品浓度与峰面积
浓度μg/ml 2.66052 6.6513 13.3026 26.6052 53.2104 133.026
峰面积 267159.7 669192.6 1326674 2642508 5324184 13304423
实施例13
枳实薤白桂枝汤含量精密度试验：分别精密吸取重复性供试品溶液1(按照实施例1中的方法制备)，进样6次，每次10μl，按照实施例1的色谱条件测定其峰面积，得到结果见表9，由表9可知其RSD值为0.5％，表明结果精密准确。
表9精密度试验结果
样品 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
峰面积 905590.4 909220.7 910144.4 91不1383.7 915796.3 915667.7 0.432184654
实施例14
枳实薤白桂枝汤含量稳定性试验：取同一枳实薤白桂枝汤溶液制备供试品溶液，按照实施例1的方法分别于0、2、4、8、12、16、24h进样测定，得到结果见表10，由表10可知其峰面积RSD值0.7％，结果24h内测定结果稳定。
表10稳定性试验结果
样品 0h 2h 4h 8h 12h 16h 24h RSD
峰面积 885627.0 887498.4 892293.2 896770.4 898024.0 898824.5 905590.4 0.63003
实施例15
重复性考察：取同一批(20091701)样品，按照实施例1的方法分别制备6份供试品溶液，测定桂皮醛含量，结果桂皮醛的平均含量为9.0μg/ml，RSD＝0.5％(n＝6)。结果表明本方法重现性较好。结果见表11。
表11重复性试验结果
样品 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
含量μg/ml 8.95 8.98 9.03 9.03 8.98 9.04 0.5
实施例16
回收率试验：采用加样回收法，取已知含量的枳实薤白桂枝汤样品6份，分别精密添加一定量的桂皮醛对照品，按实施例1中供试品的制备与测定方法在上述色谱条件下进行含量测定，得到结果见表12。
表12回收率试验结果
Figure BDA0002842465340000171
实施例17
专属性测试：按照实施例1中的色谱条件，制备枳实薤白桂枝汤供试品溶液、桂皮醛对照片溶液及空白溶剂进行检测，得到色谱对照图如图19所示。
实施例18
指纹图谱含量测定方法与2015版药典桂枝桂皮醛含量测定方法的对比
指纹图谱含量测定方法：制备及检测条件同实施例2，得到结果见表13。
药典含量方法：按照高效液相色谱法(通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(32:68)为流动相；检测波长为290nm。理论板数按桂皮醛峰计算应不低于3000。色谱柱：AgilentZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm。
对照品溶液的制备：取桂皮醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含10μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：精密量取相同的待测枳实薤白桂枝汤供试品5ml，加乙醚萃取3次，每次10ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇溶解，并转移至5ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得色谱图，如图20～22所示；根据色谱图结果得到其中桂皮醛含量如表13所示。其中图20为按照药典方法得到的桂皮醛对照品色谱图；图21为按照药典方法得到的枳实薤白桂枝汤供试品的色谱图；图22为按照药典方法得到的枳实薤白桂枝汤萃取后水液样品的色谱图。
表13指纹图谱含量测定方法与2015版药典桂枝桂皮醛含量测定方法的对比结果
Figure BDA0002842465340000181
由表13可知，指纹图谱含量测定方法测得的桂皮醛含量比药典桂枝桂皮醛含量测定方法所测的桂皮醛更高，故可以证明本发明的检测方法不但符合药典的规定，而且检测方法更加灵敏和可靠。
对比例6
其余同实施例2，区别在于：供试品溶液的制备：取待测枳实薤白桂枝汤供试品5ml，离心，取上清液，过滤，即得。
得到色谱图如图23所示。
对比例7
其余同实施例2，区别在于：供试品溶液的制备：精密取待测枳实薤白桂枝汤供试品5ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，即得
得到色谱图如图24所示。
对比例8
其余同实施例2，区别在于：供试品溶液的制备：精密取待测枳实薤白桂枝汤供试品5ml，置10ml容量瓶中，加0.2％甲酸甲醇至刻度，摇匀，过滤，即得。
得到色谱图如图25所示。
图26为对比例6～对比例8的色谱比较图，其中由下至上依次为对比例6、对比例7与对比例8。由图26可知，枳实薤白桂枝汤(水煎液：甲醇50：50)与枳实薤白桂枝汤(水煎液：0.2％甲酸甲醇50：50)样品中厚朴酚峰大于枳实薤白桂枝汤(水煎液)样品中厚朴酚峰，说明在水煎液中，脂溶性成分的溶解性不好，样品中此类成分均匀度价差，而枳实薤白桂枝汤(水煎液：0.2％甲酸甲醇50：50)样品各峰保留时间漂移较大。
对比例9
其余同实施例2，区别在于：供试品溶液的制备：精密取待测枳实薤白桂枝汤供试品5ml，置10ml容量瓶中，加0.2％甲酸溶液至刻度，离心，取上清液，过滤，即得。
得到色谱图如图27所示。
对比例10
其余同实施例2，区别在于：供试品溶液的制备：精密取待测枳实薤白桂枝汤供试品5ml，置10ml容量瓶中，加0.5％甲酸溶液至刻度，离心，取上清液，过滤，即得。
得到色谱图如图28所示。
对比例11
其余同实施例2，区别在于：供试品溶液的制备：精密取待测枳实薤白桂枝汤供试品5ml，置10ml容量瓶中，加1.0％甲酸溶液至刻度，离心，取上清液，过滤，即得。
得到色谱图如图29所示。
图30为对比例9～对比例11的色谱比较图，其中由下至上依次为对比例9、对比例10与对比例11。此溶剂选择目的是为了去掉柚皮苷与新橙皮苷或减小柚皮苷与新橙皮苷峰高度，但由图30可知，结果显示效果不理想，需重新选择合适的方法来达到目的。

Claims (10)

1.一种枳实薤白桂枝汤中化学成分的检测方法，其特征在于，包括：
S1)将枳实薤白桂枝汤供试品用乙醚萃取，得到萃取液；将萃取液除去溶剂后，再用有机溶剂溶解定容，得到待测液；
S2)将所述待测液进行高效液相色谱分析，得到待测液的色谱图；
所述高效液相色谱分析的色谱条件为：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相流速为0.8～1.2mL/min；流动相采用梯度洗脱；
流动相A为乙腈；流动相B为0.2％～1％的甲酸溶液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
以体积百分比计，所述梯度洗脱的程序为：
0～5min，流动相A由5％增加至10％；
5～10min，流动相A由10％增加至15％；
10～15min，流动相A由15％增加至20％；
15～20min，流动相A由20％增加至30％；
20～35min，流动相A由30％增加至35％；
35～50min，流动相A由35％增加至90％；
50～60min，流动相A为90％；
或0～15min，流动相A由5％增加至20％；
15～20min，流动相A由20％增加至30％；
20～40min，流动相A由30％增加至45％；
40～55min，流动相A由45％增加至90％；
55～65min，流动相A为90％；
或0～15min，流动相A由5％增加至20％；
15～20min，流动相A由20％增加至30％；
20～40min，流动相A由30％增加至40％；
40～55min，流动相A由40％增加至90％；
55～65min，流动相A为90％；
或0～15min，流动相A由5％增加至20％；
15～20min，流动相A由20％增加至30％；
20～30min，流动相A由30％增加至35％；
30～40min，流动相A由35％增加至45％；
40～55min，流动相A由45％增加至90％；
优选的，以体积百分比计，所述梯度洗脱的程序为：
0～15min，流动相A由5％增加至20％；
15～20min，流动相A由20％增加至30％；
20～30min，流动相A由30％增加至35％；
30～40min，流动相A由35％增加至45％；
40～55min，流动相A由45％增加至90％。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1)中的有机溶剂为甲醇；所述枳实薤白桂枝汤供试品与待测液的体积比为1：(0.8～1.2)。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱分析的色谱柱为C18；4.6mm×250mm，5μm；
优选的，所述高效液相色谱分析的色谱柱为ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm；更优选的，所述高效液相色谱分析的色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相流速为1mL/min；所述流动相B为0.2％的甲酸溶液；所述高效液相色谱分析的检测波长为286nm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括：
将桂皮醛与有机溶剂混合，得到桂皮醛对照品溶液；
将所述桂皮醛对照品溶液分别进行高效液相色谱分析，得到桂皮醛对照品的色谱图；
根据所述桂皮醛对照品溶液的浓度、所述桂皮醛对照品溶液在色谱图中的峰面积以及待测液中桂皮醛在色谱图中的峰面积，以外标法计算枳实薤白桂枝汤中桂皮醛的含量。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述桂皮醛对照品溶液的进样浓度为2.66052～133.026μg/ml。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，桂皮醛含量的回归方程为：y＝100029.6635x-3074.3230。
9.一种枳实薤白桂枝汤中化学成分指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括：采用权利要求1～8任意一项所述的枳实薤白桂枝汤中化学成分的检测方法，得到枳实薤白桂枝汤中化学成分的指纹图谱。
10.根据权利要求9所述的建立方法，其特征在于，所述枳实薤白桂枝汤中化学成分的指纹图谱有31个共有峰，以20号峰为对照峰，共有峰的相对保留时间分别为：1号峰0.1705±0.00025，2号峰0.1767±0.0002，3号峰0.217±0.0005，4号峰0.2637±0.00035，5号峰0.3573±0.00025，6号峰0.4271±0.0003，7号峰为0.5341±0.0005，8号峰为0.5533±0.0003，9号峰为0.5983±0.0003，10号峰为0.63275±0.0002，11号峰为0.6491±0.00023，12号峰为0.6581±0.00025，13号峰为0.7118±0.00013，14号峰为0.7366±0.00025，15号峰为0.7507±0.00022，16号峰为0.7625±0.00022，17号峰为0.7701±0.00022，18号峰为0.85855±0.0001，19号峰为0.9406±0.00005，20号峰为1.000，21号峰为1.03095±0.0002，22号峰为1.0446±0.0005，23号峰为1.1411±0.00021，24号峰为1.18555±0.00023，25号峰为1.20004±0.0002，26号峰为1.287±0.00025，27号峰为1.30856±0.0004，28号峰为1.3198±0.00055，29号峰为1.38604±0.00064，30号峰为1.467±0.001，31号峰为1.527±0.0011。
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