CN114646720B - 一种醋没药标准汤剂质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种醋没药标准汤剂质量检测方法，包括通过对醋没药标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及莪术酮含量测定，将醋没药标准汤剂含量标准限定为每1g含莪术酮为1.0～4.1mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及莪术酮含量测定均采用液相色谱法测定。本发明的醋没药标准汤剂质量检测方法，通过多方面测量，来评定醋没药标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立醋没药汤剂可行的质量标准，实现醋没药标准汤剂质量的有效控制。

Description

一种醋没药标准汤剂质量检测方法
技术领域
本发明涉及中药材质量控制技术领域，具体涉及一种醋没药标准汤剂质量检测方法。
背景技术
现代药物需要具有稳定均一、安全和有效的三大特性，中成药在这几个方面难以比拟西药，因此，更需要采用多种手段进行检测，保证检测结果的可靠性和稳定性。醋没药为橄榄科植物地丁树Commiphora myrrha Engl.或哈地丁树Commiphora molmol Engl.的干燥树脂，目前，关于醋没药的标准汤剂还未形成一个系统的质量检测方法，仅采用现有的检测手段来检测醋没药汤剂是不够全面的，无法达到中药配方颗粒质量控制要求。因此，建立一种用于药材质量控制的醋没药标准汤剂质量检测方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的就是要解决现有技术的不足，提供一种醋没药标准汤剂质量检测方法，以更好的控制醋没药汤剂的质量，表征药物质量，提高药物稳定性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种醋没药标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，
通过对醋没药标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及莪术酮含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含莪术酮为1.0～4.1mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及莪术酮含量测定均采用液相色谱法测定；
采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以天然没药对照药材制成的溶液作为参照物溶液b，以莪术酮对照品制成的溶液作为对照品溶液b，以醋没药标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液b，分别精密吸取参照物溶液b、对照品溶液b和供试品溶液b，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以体积比为53:47的乙腈:0.1％磷酸溶液作为流动相；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：210nm。
在其中一实施例中，所述煎煮法包括：取醋没药饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得醋没药标准汤剂干膏粉。
在其中一实施例中，所述照薄层色谱法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液a：取醋没药标准汤剂样品2g，加乙醇20mL，超声处理1小时，滤过，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，制得供试品溶液a；
(2)制备天然没药对照药材溶液a1：取天然没药对照药材1g，加乙醇20mL，超声处理1小时，滤过，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，制得对照药材溶液a1；
(3)制备胶质没药对照药材溶液a2：取胶质没药对照药材1g，加乙醇20mL，超声处理1小时，滤过，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，制得对照药材溶液a2；
(4)进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：吸取5uL供试品溶液a，吸取对照药材溶液a1与对照药材溶液a2各3uL；展开剂：体积比为19：1的苯-乙酸乙酯溶液；展开，取出，晾干，于紫外光灯365nm下检视。
在其中一实施例中，所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：
(1)制备参照物溶液b：取天然没药对照药材0.1g，精密加入70％甲醇50mL，称定重量，超声处理30min，滤过，取续滤液，作为参照物溶液b；
(2)制备对照品溶液b：取莪术酮对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为20ug/mL的对照品溶液b；
(3)制备供试品溶液b：取醋没药标准汤剂样品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液b。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定莪术酮含量包括：进行液相色谱仪分析，以莪术酮对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以醋没药标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：以体积比为53:47的乙腈:0.1％磷酸溶液作为流动相；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：210nm。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定莪术酮含量还包括如下步骤：
(1)制备对照品溶液：取莪术酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成含莪术酮的浓度为20ug/ml的溶液，作为对照品溶液c；
(2)制备供试品溶液：取醋没药标准汤剂样品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液c。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)通过对醋没药标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及莪术酮含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定醋没药标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立醋没药汤剂可行的质量标准，实现醋没药标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。
(2)醋没药饮片煎煮制得醋没药饮片标准汤剂，莪术酮平均含量为2.573mg/g，测得含量范围为1.223～3.590mg/g，SD(标准差)为0.519，按均值±3SD来算，莪术酮含量允许范围为1.02～4.13mg/g，故拟定本标准汤剂的莪术酮含量范围为：1.0mg/g～4.1mg/g；莪术酮平均转移率为4.972％，转移率范围为2.51％～7.71％，SD为1.598，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，莪术酮含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为3.48～6.46％，按照-2SD～+3SD来算，为1.78％～9.76％，故拟定本标准汤剂的莪术酮含量转移率范围为：1.78～9.76％，结果表明，本发明多个批次标准汤剂中莪术酮含量及其转移率均在允许范围之内，因此本发明可为醋没药配方颗粒质量标准研究提供参考依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一实施例中供试品醋没药、对照品天然没药、对照品胶质没药的液相色谱对比图；其中，S1为供试品醋没药的特征图谱，S2为对照品胶质没药的特征图谱，S3为对照品天然没药的特征图谱。
图2为本发明一实施例中3批醋没药标准汤剂样品分别与天然没药对照药材溶液、胶质没药对照药材溶液对比的薄层图谱；其中，A组图谱为阴性对照样品薄层图谱，S1组为天然没药对照药材薄层图谱，S2为胶质没药对照药材薄层图谱，1～3组表示3批醋没药标准汤剂样品薄层图谱。
图3为本发明一实施例中15批次醋没药标准汤剂薄层图谱；其中，A组图谱为阴性对照样品薄层图谱，S1组为天然没药对照药材薄层图谱，1～15组为15批次醋没药标准汤剂薄层图谱。
图4为醋没药饮片标准汤剂照薄层色谱法的检测波长考察中不同检测波长对比图；其中，S1的检测波长为290nm，S2的检测波长为254nm，S3的检测波长为210nm。
图5为醋没药饮片标准汤剂照薄层色谱法的流动相考察中不同流动相对比图；其中，S1的流动相为0.1％甲酸，S2的流动相为0.1％醋酸，S3的流动相为0.1％磷酸。
图6为醋没药饮片标准汤剂照薄层色谱法的柱温考察中不同柱温对比图；其中，S1的柱温为30℃，S2的柱温为32℃，S3的柱温为28℃。
图7为醋没药饮片标准汤剂照薄层色谱法的流速考察中不同流速对比图；其中，S1的流速为1.2mL/min，S2的流速为1.0mL/min，S3的流速为1.8mL/min。
图8为醋没药饮片标准汤剂照薄层色谱法的洗脱梯度考察中不同梯度对比图；其中，S1为梯度2(水相48)，S2为梯度3(水相46)，S3为梯度1(水相47)。
图9为本发明提取方法考察中不同提取方法对比图；其中，S1为回流提取供试品溶液特征图谱；S2为超声提取供试品溶液特征图谱。
图10为本发明提取时间考察中不同提取时间对比图；其中，S1为超声提取40min供试品溶液特征图谱；S2为超声提取30min供试品溶液特征图谱；S3为超声提取20min供试品溶液特征图谱。
图11为本发明提取溶剂考察中不同提取溶剂对比图；其中，S1为70％乙醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S2为10％甲醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S3为70％甲醇提取制备的供试品溶液特征图谱。
图12为本发明样品取用量考察中不同样品量对比图；其中，S1为样品取用量0.8g的供试品溶液特征图谱；S2为样品取用量0.5g的供试品溶液特征图谱；S3为样品取用量0.2g的供试品溶液特征图谱。
图13为本发明专属性考察中空白溶剂对比图；其中，S1为对照品溶液特征图谱；S2为供试品溶液特征图谱，S3为空白溶剂(70％甲醇)特征图谱。
图14为本发明重复性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为重复性1下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为重复性2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为重复性3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为重复性4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为重复性5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为重复性6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图15为本发明精密度试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为精密度1下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为精密度2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为精密度3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为精密度4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为精密度5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为精密度6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图16为本发明稳定性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为于0h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为于2h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为于4h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为于8h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为于12h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为于24h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图17为本发明不同色谱柱考察的特征图谱；其中，S1(3)为批号PF-127的色谱柱，S2(3)为批号PF-130的色谱柱。
图18为本发明不同柱温考察的特征图谱；其中，S1为柱温28℃的色谱柱，S2为柱温30℃的色谱柱，S3为柱温32℃的色谱柱。
图19为本发明不同流速考察的特征图谱；其中，S1(7)流速为0.8min/mL，S2(7)流速为1.0min/mL，S3(7)流速为1.2min/mL。
图20为本发明标准汤剂特征图谱测定中莪术酮对照品图谱。
图21为本发明标准汤剂特征图谱测定中天然没药对照药材图谱。
图22为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批醋没药中药饮片叠加图谱；其中，S1-S15分别表示1-15批醋没药中药饮片叠加图谱。
图23为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批醋没药中药材共有峰图谱。
图24为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批醋没药标准汤剂叠加图谱；其中，S1(1)-S15(1)表示从1-15批醋没药标准汤剂叠加图谱。
图25为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批醋没药标准汤剂拟合图。
图26为本发明含量测定方法学验证中专属性考察空白溶剂对比图；其中，S1为对照品溶液特征图谱；S2为供试品溶液特征图谱，S3为空白溶剂(70％甲醇)特征图谱。
图27为本发明线性范围试验中莪术酮对照品不同浓度线性曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
本发明提供一种醋没药标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，通过对醋没药标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及莪术酮含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含莪术酮为1.0～4.1mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及莪术酮含量测定均采用液相色谱法测定。
本实施例中：
醋没药为橄榄科植物地丁树Commiphora myrrha Engl.或哈地丁树Commiphoramolmol Engl.的干燥树脂经炮制并参照《医疗机构中药煎药室管理规范》制成，醋没药的来源分为天然没药与胶质没药，取供试品醋没药与对照品天然没药、对照品胶质没药进行对比，经高效液相色谱法对比，如图1所示，本品醋没药为天然没药。
制备醋没药标准汤剂：参照《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药管理局[2009]3号)中的煎煮法，取15批次醋没药饮片加水至没过药材约4-5cm，浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得15批次醋没药标准汤剂干膏粉。
1.干浸膏出膏率测试
取15批次醋没药饮片，按以上制法制得15批次标准汤剂干膏粉，以干膏粉计算干浸膏得率(见表1)，并计算平均得率为12.087％，按照标准限度允许范围(均值70％～130％)计算，出膏率允许范围为8.44％-15.71％，故拟定醋没药饮片标准汤剂出膏率允许范围为8.4％～15.5％。
表1：醋没药饮片标准汤剂出膏率
上述结果表明，15批次标准汤剂出膏率为10.3％～14.7％，均符合拟定限度范围8.4％～15.5％。
2.性状考察
根据15批次醋没药标准汤剂的实物性状特征，描述为黄棕色至棕黑色的粉末，有特异香气，味苦而微辛。
3.薄层鉴别
本品为单味饮片醋没药的干燥提取物，用天然没药对照药材作对照，建立本品薄层鉴别方法，经15批次样品试验，供试品斑点清晰，阴性对照样品无干扰，故拟定为本品[鉴别]项。
试验方法和结果如下：
3.1标准汤剂薄层鉴别
试验方法：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验
供试品溶液制备：取本品粉末2g，加乙醇20ml，超声处理1小时，滤过，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液制备：取天然没药对照药材、胶质没药对照药材各1g，同法制成对照药材溶液。取天然没药对照药材1g，加乙醇20mL，超声处理1小时，滤过，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，制得天然没药对照药材溶液；取胶质没药对照药材1g，加乙醇20mL，超声处理1小时，滤过，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，制得胶质没药对照药材溶液。
薄层色谱条件：薄层板：硅胶G薄层板；点样量：吸取供试品溶液5μL，天然没药对照药材溶液、胶质没药对照药材溶液各3μL；展开剂：苯-乙酸乙酯(19:1)；检视：紫外光灯(365nm)下检视。
实验情况：先取3批醋没药标准汤剂样品(来自3个产地各1批)，分别与天然没药对照药材溶液、胶质没药对照药材溶液对比，拟定本品为天然没药。在15批标汤供试品色谱中，在与天然没药对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，15批次标准汤剂TLC图谱见图2。
3.2拟定薄层鉴别方法
取本品粉末2g，加乙醇20ml，超声处理1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取天然没药对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》附录ⅥB)试验，分别吸取上述对照药材溶液3μL、供试品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯(19:1)为展开剂，展开，取出，晾干，于紫外光灯(365nm)下检视。如图3所示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
4.浸出物测定
取15批次标准汤剂，以乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定，结果详见表2。
表2：醋没药饮片标准汤剂浸出物测定结果
上述结果表明，15批次标准汤剂浸出物均值为19.87％，参考标准限度允许范围(均值70％～130％)的下限，拟定本品醇溶性浸出物不得少于14％。15批次标准汤剂测定结果均符合拟定限度要求。
5.特征图谱测试
5.1仪器、试剂与试药
(1)仪器：岛津高效液相色谱仪(LC-2030puls，日本岛津有限公司)；岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)，编号为PF-130、PF-132、PF-85、PF-127；恒温水浴锅(HMTD-7000，北京市永光明医疗仪器有限公司)；超声波清洗器(KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司)；万分之一天平(PX224ZH，奥豪斯仪器有限公司)；百万分之一天平(AWU220D，日本岛津有限公司)。
(2)试剂：乙醇(天津市致远化学试剂有限公司)、甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)色谱纯；、乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司)为色谱纯，水为超纯水(实验室自制)。
(3)对照品信息：莪术酮(批号：CFS202003，含量：99.6％，ChemFaces)、天然没药对照药材(批号：120967-201706，中国食品药品检验研究院)。
5.2试验方法
5.2.1色谱条件的确定
(1)最佳吸收波长的确定
根据文献对醋没药特征图谱的研究，其醋没药特征图谱测定波长为210nm，因210nm属于前端吸收，峰信息较多，为增大特征峰响应值，减小干扰，使基线平稳，故对较少峰信息的检测波长254nm、210nm、290nm进行研究，确定最佳吸收波长。
取醋没药标准汤剂适量，约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：乙腈：0.1％磷酸溶液(53:47)为流动相；流速：每分钟1.0ml；柱温：30℃；检测波长：210nm。
结果显示，通过对比3种检测波长色谱图，选取210nm作为检测波长时，各特征峰响应值较大，基线平稳，干扰较小，故选取210nm作为检测波长，详见图4。
(2)流动相的考察
本次实验选取0.1％冰醋酸溶液、0.1％甲酸溶液、0.1％磷酸溶液三种流动相以及不同流动相浓度进行比较，确定合适的流动相。
取醋没药标准汤剂适量，约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：乙腈：0.1％磷酸溶液(53:47)；流速：每分钟1.0ml；柱温：30℃；检测波长：210nm。
通过对比3种不同流动相的色谱图，如图5所示，选取0.1％甲酸溶液和0.1％醋酸溶液作为流动相时，峰的信息较完整但峰分离度较差，选取0.1％磷酸溶液为流动相时，峰的信息完整，分离效果优于0.1％甲酸溶液和0.1％醋酸溶液，故选取0.1％磷酸。
(3)柱温的考察
本次实验选取28℃、30℃、32℃柱温进行比较，选择合适柱温。
取醋没药标准汤剂适量，约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：乙腈：0.1％磷酸溶液(53:47)；流速：每分钟1.0ml；柱温：30℃；检测波长：210nm。流速：
结果显示，通过对比3种不同柱温的色谱图，如图6所示，3种流动相的色谱峰信息及峰形差异不大，选取30℃作为柱温时，峰分离度较好，故选取30℃作为柱温。
(4)流速的考察
本次实验选取1.0ml/min、1.2ml/min、0.8ml/min的3种流速进行比较，选择合适流速。
取醋没药标准汤剂适量，约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：乙腈：0.1％磷酸溶液(53:47)；流速：每分钟1.0ml；柱温：30℃；检测波长：210nm。
结果显示，通过对比3种不同流速的色谱图，如图7所示，3种流动相的色谱峰信息及峰形差异不大，选取1.0ml/min作为流速时，峰分离度较好，故选取1.0ml/min作为流速。
(5)梯度优化
对醋没药标准汤剂特征图谱的洗脱梯度进行优化，确定最优梯度。
取醋没药标准汤剂适量，约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：乙腈：0.1％磷酸溶液按梯度1(53:47)、梯度2(52:48)、梯度3(54:46)；流速：每分钟1.0ml；柱温：30℃；检测波长：210nm。
参阅图8，结果显示，通过对醋没药标准汤剂特征图谱的洗脱梯度进行优化，最终确定分离度较好的梯度1作为醋没药标准汤剂特征图谱的洗脱梯度。
5.2.2色谱条件
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：乙腈：0.1％磷酸溶液(53:47)；流速：每分钟1.0ml；柱温：30℃；检测波长：210nm。
5.2.3制备参照物溶液：取天然没药对照药材0.1g，精密加入70％甲醇50mL，称定重量，超声处理30min，滤过，取续滤液，作为参照物溶液；
制备对照品溶液：取莪术酮对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为20ug/mL的对照品溶液；
5.2.4制备供试品溶液：取醋没药标准汤剂样品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
5.2.5测定法：分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.3方法学考察
5.3.1提取方法的考察：分别以不同的提取方法制备供试品溶液，按上述5.2试验方法进行测定。结果表明，样品超声与回流，主峰个数一致，各峰分离较好(见图9)，为方便操作，故选择样品提取方式为超声。
5.3.2提取时间的考察：分别以不同时间制备供试品溶液，按上述5.2试验方法进行测定。结果表明，主峰个数一致，不同提取时间差别不大(见图10)，为节省时间，故确定以30min为提取时间。
5.3.3提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按上述5.2试验方法进行测定。结果表明，不同溶剂，主峰个数一致，各峰分离较好(见图11)，故确定以70％甲醇为提取溶剂。
5.3.4样品取用量考察：分别以不同取样量制备供试品溶液，按5.2试验方法进行测定。结果表明，主峰个数一致，不同取样量差别不大(见图12)，故确定取样量为0.2g。
综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取本品醋没药细粉0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.4特征图谱分析方法验证
5.4.1专属性考察：取供试品用溶剂70％甲醇10ul，按以上5.2项下色谱条件进行测定。试验表明，如图13所示，空白溶剂无干扰。
5.4.2重复性试验：取同批样品约0.2g，共6份，按5.2色谱条件进行测定，结果显示，6份供试品特征图谱中有7个共有峰，以莪术酮为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，详见表3、4及图14，结果显示相对峰面积、相对保留时间RSD值均在合格范围内，表明该方法重现性良好。
表3：重复性试验特征图谱相对保留时间
表4：重复性试验特征图谱相对峰面积
5.4.3精密度试验：取同批样品约0.2g，按5.2色谱条件进行测定，连续进样6针测定，峰形、峰数基本一致，以莪术酮为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，详见表5、6以及图15，结果显示相对峰面积、相对保留时间RSD值均在合格范围内，表明该方法精密度良好。
表5：精密度试验特征图谱相对保留时间
/>
表6：精密度试验特征图谱相对峰面积
5.4.4稳定性试验：取一批样品0.2g，按5.2色谱条件进行测定，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定，峰形、峰数基本稳定，以莪术酮为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，详见表7、8及图16，结果显示相对峰面积、相对保留时间RSD值均在合格范围内，表明供试品溶液在24小时内较稳定。
表7：稳定性试验特征图谱相对保留时间
表8：稳定性试验特征图谱相对峰面积
5.4.5耐用性考察
(1)不同色谱柱的考察
在方法优化的过程中发现，不同型号的色谱柱对醋没药标准汤剂特征图谱的分离度影响较大，因此选择了岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)色谱柱。为保证该方法使用同一型号色谱柱的重现性，比较了同一型号不同批号的3根色谱柱(分别是PF-130、PF-125)对耐用性的影响。如图17，结果显示相对峰面积、相对保留时间RSD值均在合格范围内。不同批次的色谱柱影响较小(详见表9、10)，同一型号不同批次的色谱柱耐用性良好。
表9：不同色谱柱考察特征图谱相对保留时间
峰号 PF-125 PF-130 RSD(％)
1 0.65 0.645 0.55
2 0.769 0.764 0.46
3 0.806 0.803 0.26
4(S) 1 1 0.00
5 1.098 1.098 0.00
6 1.206 1.209 0.18
7 1.409 1.414 0.25
表10：不同柱温考察特征图谱相对峰面积
峰号 PF-127 PF-130 RSD(％)
1 0.172 0.180 3.26
2 0.523 0.552 3.91
3 0.736 0.789 4.83
4(S) 1.000 1.000 0.00
5 0.246 0.241 1.45
6 0.336 0.346 2.09
7 0.192 0.197 1.90
(2)不同柱温的考察
取“色谱柱耐用性考察”项下的供试品溶液，除了柱温分别改为28℃、30℃、32℃外，其余色谱条件不变，进样分析。以莪术酮为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，见表11、12和图18，结果显示相对峰面积、相对保留时间RSD值均在合格范围内。说明柱温的影响较小，不同柱温耐用性较好。
表11：不同柱温考察特征图谱相对保留时间
峰号 28℃ 30℃ 32℃ RSD(％)
1 0.652 0.652 0.651 0.09
2 0.766 0.769 0.772 0.39
3 0.806 0.807 0.808 0.12
4(S) 1 1 1 0.00
5 1.101 1.099 1.099 0.11
6 1.21 1.205 1.202 0.34
7 1.409 1.411 1.414 0.18
表12：不同柱温考察特征图谱相对峰面积
峰号 28℃ 30℃ 32℃ RSD(％)
1 0.177 0.177 0.177 0.15
2 0.541 0.542 0.536 0.61
3 0.768 0.769 0.765 0.31
4(S) 1.000 1.000 1.000 0.00
5 0.237 0.238 0.237 0.06
6 0.345 0.350 0.362 2.46
7 0.205 0.198 0.203 1.90
(3)不同流速的考察
取“色谱柱耐用性考察”项下的供试品溶液，除了流速分别改为0.8ml/min、1.0ml/min、1.20ml/min外，其余色谱条件不变，进样分析。以莪术酮为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，见表13、14和图19，结果显示相对峰面积、相对保留时间RSD值均在合格范围内，结果表明该分析方法不同流速耐用性较好。
表13：不同流速考察特征图谱相对保留时间
峰号 0.8ml/min 1.0ml/min 1.2ml/min RSD(％)
1 0.645 0.652 0.651 0.58
2 0.763 0.769 0.768 0.42
3 0.801 0.807 0.806 0.40
4(S) 1 1 1 0.00
5 1.099 1.099 1.100 0.05
6 1.211 1.205 1.207 0.25
7 1.421 1.411 1.413 0.37
表14：不同流速考察特征图谱相对峰面积
峰号 0.8ml/min 1.0ml/min 1.2ml/min RSD(％)
1 0.190 0.177 0.174 4.60
2 0.558 0.542 0.533 2.34
3 0.793 0.769 0.755 2.52
4(S) 1.000 1.000 1.000 0.00
5 0.247 0.238 0.235 2.47
6 0.379 0.350 0.347 4.95
7 0.189 0.198 0.198 2.73
该特征图谱方法经专属性，精密度，重复性和稳定性验证，均符合规定，经中间精密度和耐用性考察，相对保留时间较稳定。
5.5标准汤剂特征图谱表征分析
5.5.1标准汤剂特征图谱测定
照上述拟定的特征图谱分析方法，测定15批醋没药标准汤剂及其制备使用的15批次中药饮片特征图谱，结果显示，标准汤剂及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有7个共有峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中与莪术酮对照品参照物相对应的峰为峰4，共有峰特征图谱详见图20至25。
5.5.2特征色谱图相对保留时间评价
采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对选定的7个共有特征峰进行相似度的评价，结果显示，15批醋没药饮片标准汤剂特征色谱图相似度均在0.9以上，表明本标准汤剂质量相对稳定。以莪术酮参照物峰相对应的峰(4)为S峰，计算共有峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间及范围详见表15。
表15：15批标准汤剂共有峰相对保留时间
综上所述，采用高效液相色谱法建立的标准汤剂特征图谱测定方法，按照《中国药典》2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了精密度、重复性、稳定性验证，且符合要求。采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”对15批标准汤剂样品的特征图谱进行相似度评价，标定了7个共有特征峰，其中峰4为莪术酮。以莪术酮参照物相对应的峰为S峰，计算另6个特征峰相对保留时间，以15批次样品峰相对保留时间均值拟定为规定值分别为：0.65(峰1)、0.77(峰2)、0.81(峰3)、1.10(峰5)、1.21(峰6)、1.41(峰7)，考虑试验操作、仪器、试剂等多因素误差，其相对保留时间允许范围拟定为±10％。
6.含量测定
6.1试验方法
2020版《中国药典》中醋没药含量测定项下含量测定成分为莪术酮。故醋没药配方颗粒选择莪术酮作为含测成分。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈：0.1％磷酸溶液(53:47)为流动相；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为210nm。
制备对照品溶液：取莪术酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含莪术酮20ug的溶液，摇匀，即得。
制备供试品溶液：取本品细粉0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
6.2方法学考察
6.2.1提取方法的考察：分别以不同的提取方式制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，样品超声与回流提取的，含量结果没有显著性差异(见表16)，故选择样品提取方式为更为简洁的超声处理。
表16：不同提取方法对比
6.2.2提取时间的考察：分别以不同的提取时间制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，样品超声处理30分钟，含量最高(详见表17)，故选择样品超声时间为30分钟。
表17：不同提取时间对比
6.2.3提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，溶剂为70％甲醇，含量最高(详见表18)，故选择样品溶剂为70％甲醇。
表18：不同提取溶剂对比
6.2.4样品量考察：分别以不同样品量(0.5g、0.2g、0.8g)制备供试品溶液，按上述9.1试验方法进行测定。结果表明，取样量0.2g，含量最高(详见表19)，故确定样品取样量0.2g。
表19：不同取样量对比
6.2.5供试品溶液制备方法的确定
综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取本品细粉，0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.3含量测定方法学验证
6.3.1专属性考察：按上述6.1试验方法进行测定，试验表明：空白溶剂无干扰(见图26)，表明该方法专属性良好。
6.3.2重复性试验：取同批次标准汤剂样品约0.2g，共6份，按上述6.1试验方法进行测定，测得样品中莪术酮含量平均值分别为4.6350mg/g，RSD值为1.97％，试验表明该方法重现性良好(详见表20)。
表20：重复性试验
6.3.3精密度试验：取6.1所示的供试品溶液，连续进样6针，照上述6.1试验方法测定其峰面积，计算样品中莪术酮峰面积的RSD值为0.36％，表明仪器精密度良好(详见表21)。
表21：
6.3.4稳定性试验：取6.3.2项下供试品溶液，按上述6.1试验方法，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，测定其峰面积，计算其峰面积的RSD值为0.38％，试验表明供试品溶液在24小时内较稳定(详见表22)。
表22：
6.3.5线性范围试验：取莪术酮对照品溶液239.5120ug/ml、119.7560ug/ml、59.8780ug/ml、29.9390ug/ml、14.9695ug/ml、1.4970ug/ml。按6.1项下色谱条件进行测定。
以莪术酮进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，回归方程方程为：y＝35324x-70483，R2＝0.9992，可见莪术酮在0.23ug/ml～184.06ug/ml范围内与其峰面积具有良好的线性关系(详见表23和图27)。
表23：莪术酮线性关系考察结果
6.3.6加样回收率试验：精密称取样品(莪术酮含量为4.6350mg/g)约0.25g共6份，各加入已知浓度的莪术酮对照品溶液(239.5120ug/ml)0.8ml，按“9.1.3”项下方法制备供试品溶液，并按6.1项下色谱条件进行测定，计算莪术酮平均加样回收率为94.77％，RSD为1.67％。(详见表24)。
表24：莪术酮加样回收率试验结果
6.3.7耐用性考察
(1)不同色谱柱的考察
比较了不同批次的岛津Shim-pack GIST C18(250mmx4.6mm，5um)的2根色谱柱(分别是PF-125、PF-130)对含量测定的影响，见表25，测定的含量RSD值为1.82％，小于3.0％，表明该分析方法在同一型号不同批次的色谱柱耐用性良好。
表25：
(2)不同柱温的考察
比较不同柱温28℃、30℃、32℃对含量测定的影响，见表26，测定含量RSD值为1.76％，小于3.0％，表明该方法对柱温的较小变动耐用性良好。
表26：
(3)不同流速的考察
比较不同流速，分别为1.0ml/min、0.8ml/min、1.2ml/min对含量测定的影响，其余色谱条件不变，进样分析，见表27，测定的含量RSD值为0.81％，小于3.0％，表明该方法对流速的较小变动耐用性良好。
表27：
(4)不同流动相比例考察
取“不同色谱柱考察”项下供试品溶液，除流动性比例调整外，其他色谱条件不变，计算含量及RSD值，见表28，测定的含量RSD值为0.42％，小于3.0％，表明该方法对流动相比例的较小变动耐用性良好。
表28：
综上，综上，整个分析方法经专属性、精密度、重复性、稳定性、线性考察、加样回收及耐用性考察，结果均符合要求，说明建立的方法能很好的用于莪术酮的含量测定。
6.4标准汤剂及中药材含量测定
醋没药药材经产地初加工成片，经炮制后加工成醋没药饮片，其莪术酮含量不会发生变化，因此醋没药饮片特征色谱图及莪术酮含量参考其药材数据。
6.4.1按照上述拟定的含量分析方法，测定15批醋没药标准汤剂及其制备使用的15批次醋没药饮片及药材的莪术酮含量，结果详见表29、30、31。
表29：15批没药药材中莪术酮测定结果
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表30：15批醋没药饮片中莪术酮测定结果
表31：15批醋没药标准汤剂中莪术酮含量测定结果
6.4.1莪术酮含量转移率：依据标准汤剂方法学研究确定的检测方法，对15批标准汤剂及其制备用中药饮片测定结果，计算莪术酮含量转移率，掌握其量质传递情况，为制定物料内控标准及其表征参数允许范围提供依据。醋没药饮片标准汤剂由醋没药饮片加水煎煮2次，滤液浓缩、冷冻干燥制得。其莪术酮含量转移率详见表32。
表32：15批醋没药标准汤剂莪术酮含量转移率
由以上数据可知，醋没药饮片依方案煎煮制得醋没药饮片标准汤剂，本品莪术酮平均转移率为4.972％，测得转移率范围为2.51％-7.71％，SD为1.598。依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，莪术酮含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为3.48-6.46％；按照-2SD～+3SD来算，为1.78％～9.76％。故拟定本标准汤剂的莪术酮含量转移率范围为：1.78％～9.76％。结果表明，15批次标准汤剂中莪术酮转移率均在-2SD～+3SD允许范围之内。
本品标准汤剂中莪术酮平均含量为2.573mg/g，测得含量范围为1.223～3.590mg/g，SD为0.519；按均值±3SD计算，莪术酮含量允许范围为1.02～4.13mg/g。故拟定本标准汤剂的莪术酮含量范围为：1.0mg/g～4.1mg/g。结果表明，15批次标准汤剂中莪术酮及其转移率均在允许范围之内，可为醋没药配方颗粒质量研究提供参考依据。
本发明提供的醋没药标准汤剂质量检测方法，通过对醋没药标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及莪术酮含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定醋没药标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立醋没药汤剂可行的质量标准，实现醋没药标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。醋没药饮片煎煮制得醋没药饮片标准汤剂，莪术酮平均含量为2.573mg/g，测得含量范围为1.223～3.590mg/g，SD(标准差)为0.519，按均值±3SD来算，莪术酮含量允许范围为1.02～4.13mg/g，故拟定本标准汤剂的莪术酮含量范围为：1.0mg/g～4.1mg/g；莪术酮平均转移率为4.972％，转移率范围为2.51％～7.71％，SD为1.598，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，莪术酮含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为3.48～6.46％，按照-2SD～+3SD来算，为1.78％～9.76％，故拟定本标准汤剂的莪术酮含量转移率范围为：1.78～9.76％，结果表明，本发明多个批次标准汤剂中莪术酮含量及其转移率均在允许范围之内，因此本发明可为醋没药配方颗粒质量标准研究提供参考依据。
所述领域技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种醋没药标准汤剂质量检测方法，其特征在于，包括如下检测方法，
通过对醋没药标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及莪术酮含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含莪术酮为1.0～4.1mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及莪术酮含量测定均采用液相色谱法测定；
采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以天然没药对照药材制成的溶液作为参照物溶液b，以莪术酮对照品制成的溶液作为对照品溶液b，以醋没药标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液b，分别精密吸取参照物溶液b、对照品溶液b和供试品溶液b，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述色谱柱规格为：250mm×4.6mm，5μm ；流动相：以体积比为53:47的乙腈:0.1%磷酸溶液作为流动相；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：210nm。
2.如权利要求1所述的醋没药标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述煎煮法包括：取醋没药饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，进行固液分离，浓缩干燥，制得醋没药标准汤剂干膏粉。
3.如权利要求1所述的醋没药标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述照薄层色谱法包括如下步骤：
（1）制备供试品溶液a：取醋没药标准汤剂样品2g，加乙醇20mL，超声处理1小时，滤过，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，制得供试品溶液a；
（2）制备天然没药对照药材溶液a1：取天然没药对照药材1g，加乙醇20mL，超声处理1小时，滤过，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，制得对照药材溶液a1；
（3）制备胶质没药对照药材溶液a2：取胶质没药对照药材1g，加乙醇20mL，超声处理1小时，滤过，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，制得对照药材溶液a2；
（4）进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：吸取5μL供试品溶液a，吸取对照药材溶液a1与对照药材溶液a2各3μL；展开剂：体积比为19：1的苯-乙酸乙酯溶液；展开，取出，晾干，于紫外光灯365nm下检视。
4.如权利要求1所述的醋没药标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。
5.如权利要求1所述的醋没药标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：
（1）制备参照物溶液b：取天然没药对照药材0.1g，精密加入70%甲醇50mL，称定重量，超声处理30min，滤过，取续滤液，作为参照物溶液b；
（2）制备对照品溶液b：取莪术酮对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为20μg/mL的对照品溶液b；
（3）制备供试品溶液b：取醋没药标准汤剂样品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的70%甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液b。
6.如权利要求1所述的醋没药标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定莪术酮含量包括：进行液相色谱仪分析，以莪术酮对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以醋没药标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述色谱柱规格为：250mm×4.6mm，5μm ；流动相：以体积比为53:47的乙腈:0.1%磷酸溶液作为流动相；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：210nm。
7.如权利要求6所述的醋没药标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定莪术酮含量还包括如下步骤：
（1）制备对照品溶液：取莪术酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成含莪术酮的浓度为20μg/ml的溶液，作为对照品溶液c；
（2）制备供试品溶液：取醋没药标准汤剂样品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液c。
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