CN115575558A - 香桃木果药材的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药技术领域，是一种香桃木果药材的检测方法，该香桃木果药材的检测方法，第一步，香桃木果中没食子酸、鞣花酸薄层色谱鉴别；第二步，香桃木果中槲皮苷、金丝桃苷薄层色谱鉴别；第三步，香桃木果中浸出物测定；第四步，香桃果木药材中槲皮苷含量的测定。本发明方法操作简便、快速、稳定可靠、准确、专属性强，有效用于香桃木果药材检测，为香桃木果药材鉴定和内在质量的控制进一步开发提供技术保障，为进一步深入研究香桃木果奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域，是一种香桃木果药材的检测方法。
背景技术
香桃木果，又名香桃木实，又名艾布里阿斯，为桃金娘科植物香桃木Myrtus communis L. 的近熟果实。我国部分地区有少量栽培，国外主产于印度、斯里兰卡及欧洲等国，具有凉血止血，燥湿止泻，收敛止汗，消炎止痛，滋补毛根等作用，主治湿热性或血液质性疾病，如热性出血、牙龈出血、尿血尿涩、月经过多，湿性腹泻、出汗不止，各种炎肿、脓疮，毛发脱落等。香桃木果的资料文献很少，仅能查阅到其含有挥发油、黄酮类、糖类及有机酸类等成分，无具体的指标性成分。香桃木果现行法定标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》，但标准中内容比较简单，仅有性状、显微鉴别项，无法很好的控制其质量。
发明内容
本发明提供了一种香桃木果药材的检测方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有技术中存在的香桃木果的化学成分不明确，及缺少有效可行的定性、定量方法的问题。
本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种香桃木果药材的检测方法，按下述步骤进行：第一步，香桃木果中没食子酸、鞣花酸薄层色谱鉴别；第二步，香桃木果中槲皮苷、金丝桃苷薄层色谱鉴别；第三步，香桃木果中浸出物测定；第四步，香桃果木药材中槲皮苷含量的测定。
下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：
上述第一步中，香桃木果中没食子酸、鞣花酸薄层色谱鉴别的步骤为：制备第一供试品溶液，配制鞣花酸对照品溶液和没食子酸对照品溶液，分别吸取鞣花酸对照品溶液、没食子酸对照品溶液，第一供试品溶液，点于同一硅胶薄层板上，以体积比为5:5:0.4的甲苯-甲酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，晾干，喷以2%三氯化铁溶液与2%铁氰化钾溶液等量混合溶液，日光下检视，供试品薄层色谱中，在与对照品薄层色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
上述第二步中，香桃木果中槲皮苷、金丝桃苷薄层色谱鉴别的步骤为：制备第二供试品溶液，配制槲皮苷对照品溶液和金丝桃苷对照品溶液，分别吸取槲皮苷对照品溶液、金丝桃苷对照品溶液、第二供试品溶液，点于同一硅胶薄层板上，以体积比为8:1:1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热2分钟，置于紫外光灯下检视，供试品薄层色谱中，在与对照品薄层色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
上述第三步中，香桃木果中浸出物测定采用水作为提取溶剂，热浸法作为香桃木果的浸出物测定方法。
上述第四步中，香桃果木药材中槲皮苷的含量采用液相色谱法测定。
上述第一步中，第一供试品溶液的制备方法为：取香桃木果粉末1g至5g，加40%乙醇20mL至30mL，加热回流30分钟，过滤，滤液蒸干，滤液蒸干后的残渣加水20mL溶解，残渣溶解后用15mL至30mL的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液得到乙酸乙酯溶液，蒸干，蒸干的乙酸乙酯溶液用1mL乙酸乙酯溶解，得到第一供试品溶液。
上述第二供试品溶液的制备方法为：取香桃木果粉末1g至5g，加水15mL至30mL，超声提取30分钟，过滤，弃去滤液，滤渣加入甲醇40mL至70mL超声提取40分钟，过滤得到甲醇提取液，甲醇提取液蒸干后再加入甲醇2mL溶解，得到第二供试品溶液。
上述第四步中，液相色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，色谱柱填料粒径5μm，流动相为体积比为20:80乙腈-0.1％甲酸混合液，检测波长 256nm，柱温 30℃，进样量10μL。
本发明方法操作简便、快速、稳定可靠、准确、专属性强，有效用于香桃木果药材检测，为香桃木果药材鉴定和内在质量的控制进一步开发提供技术保障，为进一步深入研究香桃木果奠定了基础。
附图说明
附图1为本发明实施例9的没食子酸、鞣花酸薄层鉴别图，其中序号8为没食子酸对照品溶液，序号9为鞣花酸对照品溶液，序号1至7依次对应1至7号香桃木果样品，序号10至17依次对应8至15号的香桃木果样品。
附图2为本发明实施例9的槲皮苷、金丝桃苷薄层鉴别图，其中序号8为槲皮苷对照品溶液，序号9为金丝桃苷对照品溶液，序号1至7依次对应1至7号香桃木果样品，序号10至17依次对应8至15号的香桃木果样品。
附图3为本发明实施例9中槲皮苷对照品溶液的色谱图。
附图4为本发明实施例9中香桃木果供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。
本发明实施例中使用的香桃木果样品共15批(序号1至15的样品对应批号分别为20160531、20160605、20160621、20170506、20160305、20160815、Z30019901、Z30019932、Z30019809、Z30101501、Z30101523、Z30101615、Z30019903、Z30020007、Z30020018)，均来源于巴基斯坦进口，经鉴定为本发明研究的香桃木果。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：该香桃木果药材的检测方法，按下述步骤进行：第一步，香桃木果中没食子酸、鞣花酸薄层色谱鉴别；第二步，香桃木果中槲皮苷、金丝桃苷薄层色谱鉴别；第三步，香桃木果中浸出物测定；第四步，香桃果木药材中槲皮苷含量的测定。
实施例2：作为上述实施例的优化，第一步中，香桃木果中没食子酸、鞣花酸薄层色谱鉴别的步骤为：制备第一供试品溶液，配制鞣花酸对照品溶液和没食子酸对照品溶液，分别吸取鞣花酸对照品溶液、没食子酸对照品溶液，第一供试品溶液，点于同一硅胶薄层板上，以体积比为5:5:0.4的甲苯-甲酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，晾干，喷以2%三氯化铁溶液与2%铁氰化钾溶液等量混合溶液，日光下检视，供试品薄层色谱中，在与对照品薄层色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例3：作为上述实施例的优化，第二步中，香桃木果中槲皮苷、金丝桃苷薄层色谱鉴别的步骤为：制备第二供试品溶液，配制槲皮苷对照品溶液和金丝桃苷对照品溶液，分别吸取槲皮苷对照品溶液、金丝桃苷对照品溶液、第二供试品溶液，点于同一硅胶薄层板上，以体积比为8:1:1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热2分钟，置于紫外光灯下检视，供试品薄层色谱中，在与对照品薄层色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例4：作为上述实施例的优化，第三步中，香桃木果中浸出物测定采用水作为提取溶剂，热浸法作为香桃木果的浸出物测定方法。
实施例5：作为上述实施例的优化，第四步中，香桃果木药材中槲皮苷的含量采用液相色谱法测定。
实施例6：作为上述实施例的优化，第一步中，第一供试品溶液的制备方法为：取香桃木果粉末1g至5g，加40%乙醇20mL至30mL，加热回流30分钟，过滤，滤液蒸干，滤液蒸干后的残渣加水20mL溶解，残渣溶解后用15mL至30mL的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液得到乙酸乙酯溶液，蒸干，蒸干的乙酸乙酯溶液用1mL乙酸乙酯溶解，得到第一供试品溶液。
实施例7：作为上述实施例的优化，第二供试品溶液的制备方法为：取香桃木果粉末1g至5g，加水15mL至30mL，超声提取30分钟，过滤，弃去滤液，滤渣加入甲醇40mL至70mL超声提取40分钟，过滤得到甲醇提取液，甲醇提取液蒸干后再加入甲醇2mL溶解，得到第二供试品溶液。
实施例8：作为上述实施例的优化，第四步中，液相色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，色谱柱填料粒径5μm，流动相为体积比为20:80乙腈-0.1％甲酸混合液，检测波长256nm，柱温 30℃，进样量10μL。
实施例9：第一步，香桃木果中没食子酸、鞣花酸薄层色谱鉴别。
取香桃木果粉末2g，加40%乙醇20mL，加热回流30分钟，过滤，滤液蒸干，滤液蒸干后的残渣加水20mL溶解，残渣溶解后用20mL乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液得到乙酸乙酯溶液，蒸干，蒸干的乙酸乙酯溶液用1mL乙酸乙酯溶解，得到第一供试品溶液。
以甲醇为溶剂配制浓度为1mg/mL鞣花酸对照品溶液和没食子酸对照品溶液，分别吸取鞣花酸对照品溶液20μL、没食子酸对照品溶液5μL，第一供试品溶液10μL，点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5:5:0.4的甲苯-甲酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，晾干，喷以2%三氯化铁溶液与2%铁氰化钾溶液等量混合溶液，日光下检视，供试品薄层色谱中，在与对照品薄层色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。香桃木果样品中没食子酸、鞣花酸薄层鉴别图见图1。
第二步，香桃木果中槲皮苷、金丝桃苷薄层色谱鉴别。
取香桃木果粉末2g，加水20mL，超声提取30分钟，过滤，弃去滤液，滤渣加入甲醇50mL超声提取40分钟，过滤得到甲醇提取液，甲醇提取液蒸干后再加入甲醇2mL溶解，得到第二供试品溶液。
以甲醇为溶剂配制浓度为0.5mg/mL槲皮苷对照品溶液和金丝桃苷对照品溶液，分别吸取槲皮苷对照品溶液和金丝桃苷对照品溶液各5μL，第二供试品溶液10μL，点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8:1:1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热2分钟，置紫外光灯365nm下检视。供试品薄层色谱中，在与对照品薄层色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。香桃木果样品中槲皮苷、金丝桃苷薄层鉴别图见图2。
第三步，香桃木果药材的浸出物测定。
取15批香桃木果样品粉末（过二号筛），以水作为提取溶剂，热浸法作为香桃木果的浸出物测定方法，具体数据见表3，测定结果在43.8%至57.2%范围内，根据样品数据拟定出浸出物的限度为40%。
第四步，香桃果木药材中槲皮苷含量的液相色谱测定。
取槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含槲皮苷50μg的槲皮苷对照品溶液。
取香桃果木粉末（过三号筛）约4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇20mL，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得香桃木果供试品溶液。
按照以下色谱条件对槲皮苷对照品溶液和香桃木果供试品溶液进行测试，制作标准曲线，并验证方法的准确性重现性。
色谱柱：Agilent 5 TC-C18(2) 4.6×250mm 5μm；流动相：乙腈-0.1％甲酸（20：80）；检测波长：256nm；柱温：30℃。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。
图3、图4分别为槲皮苷对照品溶液和香桃木果供试品溶液的色谱图。由图3、图4可以看出，槲皮苷对照品及香桃木果供试品在17.3分钟左右均出现槲皮苷的特征吸收峰，证明本法具有良好的专属性。
实施例10：香桃木果药材的浸出物测定方法的选择：
按《中国药典》2020年版四部中的“药材和饮片检定通则0212”项下“浸出物测定”规定。本实施例中选取水和不同浓度的乙醇溶液，分别采用冷浸法和热浸法，对香桃木果的水溶性和醇溶性浸出物进行考察，选定溶剂，并对香桃木果供试品进行测定。
表1为香桃木果样品的热浸法和冷浸法测定结果比较，由表1可以看出，用水和乙醇两种溶剂按热浸法和冷浸法测定，结果显示热浸法所测浸出物含量明显高于冷浸法。
表2为香桃木果不同溶剂热浸法测定结果比较，分别使用乙醇、50%乙醇、75%乙醇、水、无水乙醇对样品进行测定，具体数据见表2。
根据测定结果本发明中选择水作为提取溶剂，热浸法作为香桃木果的浸出物测定方法。
实施例11：液相色谱测定香桃果木药材中槲皮苷含量的标准曲线及方法验证：
（1）标准曲线
精密称取槲皮苷对照品（批号111538-201105，以92.7%计）11.79mg，置50mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含218.5866μg的溶液，作为对照品贮备液。精密吸取上述对照品贮备液适量,分别制成含槲皮苷浓度为1.0929，10.9293，27.3233，54.6467，78.3414，97.9268，122.4085，153.0106μg·mL-1的对照品溶液。分别精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以浓度（μg·mL-1）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标进行回归，得标准曲线方程为：Y=3.12×104 X-3.84×104，R=0.9998，在1.0929μg·mL-1至153.0106μg·mL-1范围内，槲皮苷峰面积与浓度具有良好的线性关系；
（2）精密度实验
取槲皮苷对照品溶液，在实施例9的色谱条件下重复进样6次，记录峰面积。结果显示，槲皮苷峰面积积分值的RSD=0.06%（n=6），表明仪器的精密度良好；
（3）稳定性实验
取香桃木果样品（来源：巴基斯坦，批号Z30020018），制成供试品溶液，分别于室温下放置0，2，4，6，8，10，12，24，30，36，48小时，在实施例9的色谱条件下测定，记录峰面积。结果显示，槲皮苷的RSD为1.12%（n=11），说明本法测定槲皮苷峰面积积分值稳定性良好，48小时内测定结果可靠；
（4）重复性实验
取香桃木果样品（来源：巴基斯坦，批号Z30020018）6份平行样，分别制成供试品溶液，在实施例9的色谱条件下测定，重复进样2次，对照品平均峰面积为1626103，样品含量的RSD%为0.46%。结果见表4，结果表明，本发明的方法对测定香桃木果样品中槲皮苷的重复性良好，可以作为香桃木果药材的指控指标；
（5）回收率测定
精密称取同法测定已知含量的香桃木果供试品（来源：巴基斯坦，批号Z30020018，已知含量为358.67μg·g-1）2g，共9份，加入浓度为218.5866μg·mL-1槲皮苷对照品溶液2ml、3ml、4ml，分别制成供试品溶液，取浓度为54.64665μg·mL-1的槲皮苷对照品溶液，各进样10μL，用外标法计算回收率。槲皮苷对照品平均峰面积为1626103，平均回收率为99.86%，RSD（%）为1.48%（n=9）；
（6）检测限及定量限测定
配制含有浓度适当的槲皮苷对照品的溶液，进样10μL，当信噪比S/N为3时，其最小检测限为0.3279μg·mL-1；当信噪比S/N为10时，其定量限为1.0929μg·mL-1；
（7）耐用性实验
取香桃木果样品（来源：巴基斯坦，批号Z30020018）平行两份，分别制成供试品溶液，分别采用3台不同厂家高效液相色谱仪，3根不同色谱柱测定含量，结果见表5。结果含量RSD%为1.27%，表明本发明的香桃木果中槲皮苷（C21H20O11）含量测定方法的耐用性较好；
（8）样品测定
取香桃木果样品15批，粉碎，取粉末（过三号筛）分别制成供试品溶液，在实施例9的色谱条件下测定，含量结果见表6。以上十五批香桃木果含量测定结果,范围在0.024%至0.036%，平均含量为0.032%，可根据样品数据拟定出含量测定的限度；批次之间的含量测定结果差异不大，方法稳定性好，本发明的香桃木果中槲皮苷（C21H20O11）含量测定方法能有效控制香桃木果药材的内在质量。
本发明采用两种薄层色谱对香桃木果药材中的有效成分进行定性鉴别；采用水溶性热浸法作为药材浸出物的测定方法；采用高效液相色谱法对药材的有效成分进行含量测定。其中，香桃木果药材的薄层鉴别方法，斑点清晰，分离效果好；浸出物方法平均浸出率为48.3%；液相色谱法测定药材中槲皮苷的含量，具有准确性好，样品处理简单，稳定性好、专属性强的特点，可作为香桃木果质量标准的检测方法，能有效的控制药材的内在质量。本发明为中药研究人员提供了参考依据，为进一步深入研究香桃木果奠定了基础。
综上所述，本发明方法操作简便、快速、稳定可靠、准确、专属性强，有效用于香桃木果药材检测，为香桃木果药材鉴定和内在质量的控制进一步开发提供技术保障，为进一步深入研究香桃木果奠定了基础。
Claims (8)
1.一种香桃木果药材的检测方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，香桃木果中没食子酸、鞣花酸薄层色谱鉴别；第二步，香桃木果中槲皮苷、金丝桃苷薄层色谱鉴别；第三步，香桃木果中浸出物测定；第四步，香桃果木药材中槲皮苷含量的测定。
2.根据权利要求1所述的香桃木果药材的检测方法，其特征在于第一步中，香桃木果中没食子酸、鞣花酸薄层色谱鉴别的步骤为：制备第一供试品溶液，配制鞣花酸对照品溶液和没食子酸对照品溶液，分别吸取鞣花酸对照品溶液、没食子酸对照品溶液，第一供试品溶液，点于同一硅胶薄层板上，以体积比为5:5:0.4的甲苯-甲酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，晾干，喷以2%三氯化铁溶液与2%铁氰化钾溶液等量混合溶液，日光下检视，供试品薄层色谱中，在与对照品薄层色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3.根据权利要求1或2所述的香桃木果药材的检测方法，其特征在于第二步中，香桃木果中槲皮苷、金丝桃苷薄层色谱鉴别的步骤为：制备第二供试品溶液，配制槲皮苷对照品溶液和金丝桃苷对照品溶液，分别吸取槲皮苷对照品溶液、金丝桃苷对照品溶液、第二供试品溶液，点于同一硅胶薄层板上，以体积比为8:1:1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热2分钟，置于紫外光灯下检视，供试品薄层色谱中，在与对照品薄层色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
4.根据权利要求1至3任一项所述的香桃木果药材的检测方法，其特征在于第三步中，香桃木果中浸出物测定采用水作为提取溶剂，热浸法作为香桃木果的浸出物测定方法。
5.根据权利要求1至4任一项所述的香桃木果药材的检测方法，其特征在于第四步中，香桃果木药材中槲皮苷的含量采用液相色谱法测定。
6.根据权利要求2所述的香桃木果药材的检测方法，其特征在于第一步中，第一供试品溶液的制备方法为：取香桃木果粉末1g至5g，加40%乙醇20mL至30mL，加热回流30分钟，过滤，滤液蒸干，滤液蒸干后的残渣加水20mL溶解，残渣溶解后用15mL至30mL的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液得到乙酸乙酯溶液，蒸干，蒸干的乙酸乙酯溶液用1mL乙酸乙酯溶解，得到第一供试品溶液。
7.根据权利要求3所述的香桃木果药材的检测方法，其特征在于第二供试品溶液的制备方法为：取香桃木果粉末1g至5g，加水15mL至30mL，超声提取30分钟，过滤，弃去滤液，滤渣加入甲醇40mL至70mL超声提取40分钟，过滤得到甲醇提取液，甲醇提取液蒸干后再加入甲醇2mL溶解，得到第二供试品溶液。
8.根据权利要求5所述的香桃木果药材的检测方法，其特征在于第四步中，液相色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，色谱柱填料粒径5μm，流动相为体积比为20:80乙腈-0.1％甲酸混合液，检测波长 256nm，柱温 30℃，进样量10μL。
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