CN115541728A - 一种红花药材及红花药物制剂的特征图谱构建方法及应用 - Google Patents
一种红花药材及红花药物制剂的特征图谱构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于中药制剂质量检测技术领域，具体涉及一种红花药材及红花药物制剂的特征图谱，并进一步公开所述特征图谱的构建方法，以及红花药材及红花药物制剂的质量检测方法。本发明所述红花药材及红花药物制剂特征图谱的构建方法，以红花药材及红花药物制剂为检测对象，基于高效液相色谱法建立了针对该药物制剂的特征图谱方法，采用中药色谱指纹图谱标定了12个共有特征峰，确定了红花药材及红花药物制剂的特征。本发明所述红花药材及红花药物制剂特征图谱的构建方法，能够全面反映红花药材及红花药物制剂内在质量和用药安全，有利于其全面质量检测和整体质量控制，具有稳定性高、精密度高及重复性好的优势。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂质量检测技术领域，具体涉及一种红花药材及红花药物制剂的特征图谱，并进一步公开所述特征图谱的构建方法，以及红花药材及红花药物制剂 的质量检测方法。
背景技术
中药成分复杂，药效部位常常不是单一成分，以某种单一成分作为质量控制指标已越来越不适应中药质量控制的要求。因此，中药指纹图谱技术应运而生。中药指纹图 谱技术源于指纹鉴定学，利用现代信息技术和质量分析手段较全面的反映了中药所含 化学成分的种类和数量，通过标识其中各种组分群体特征的共有峰得到中药特征图谱。 对于中药材，特征图谱可以用来鉴别真伪、评判优劣；对于中成药，特征图谱可以鉴别 产品真伪，评判制备工艺的合理性，有效地控制产品质量。现阶段中药的有效成分大多 数尚不明确，中药特征图谱的整体性和模糊性正好适应这一特点，较单一成分的质量 控制方法更具有科学性和全面性。目前，国际上已认可将中药特征图谱作为中药质量 的控制模式。高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快等优点，已成为当今特征图 谱的主要分析手段。
红花为菊科红花属植物红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花，又名红蓝花，别 名有草红花、刺红花、红花菜等。红花为我国传统常用中药材，有很好的药用价值。红 花味辛、性温，归心、肝经，具有活血化癖、散癖止痛、降血压和降血脂等功效，在治 疗冠心病、高血压、脑溢血疾病方面具有一定的疗效。红花被收载于2020年版《中国 药典》中。目前市场上红花种类繁多，且成分复杂，薄层色谱鉴别方法是目前国家中药 制剂中最常见的操作简便、快捷的鉴别方法，但是，却存在分离效果、清晰度和重现性 不理想的问题。
因此，建立一种能够全面地、系统的检测红花药材及红花药物制剂的方法，特别是建立红花药材及红花药物制剂的特征图谱的方法，对于其全面质量检测和整体质量 控制具有重要意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，以全面反映红花药材及红花药物制剂的内在质量和用药安全；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种红花药材及红花药物制剂的质量 检测方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，包括对红花药材和/或红花药物制剂的供试溶液进行高效液相色谱检测的步骤；
色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：
0-8min，A：B为10％：90％；
8-15min，A：B为10％：90％→15％：85％；
15-25min，A：B为15％：85％→17％：83％；
25-35min，A：B为17％：83％→28％：72％；
35-40min，A：B为28％：72％→42％：58％；
40-45min，A：B为42％：58％→50％：50％。
优选的，所述高效液相色谱检测步骤中，色谱条件还包括：柱温20-30℃，流速为0.5-1.0ml/min，检测波长为266nm。优选柱温为25℃，优选流速为0.7ml/min。
具体的，所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，所述供试品溶液的制备方法包括：取供试品精密加入有机溶剂，密塞经超声处理，滤过并收集续滤液， 即得。
具体的，所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，还包括制备对照药材参照物溶液的步骤，具体包括：取红花对照药材，加水进行加热回流提取，收集提 取液过滤并加入水饱合的正丁醇溶剂进行萃取，收集正丁醇相并进行蒸干，残渣加入 有机溶剂，密塞经超声处理，滤过并收集续滤液，即得所需对照药材参照物溶液。
具体的，所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，还包括制备对照品参照物溶液的步骤，以及，基于所述高效液相色谱法构建对照品特征图谱的步骤；
所述对照品包括羟基红花黄色素A和/或山柰酚-3-O-芸香糖苷；
优选的，所述对照品参照物溶液的制备步骤包括取选定对照品精密加入有机溶剂配制形成选定浓度的所述对照品参照物溶液的步骤；
优选的，所述对照品参照物溶液中各所述对照品的浓度包括：每1ml溶液含羟基红花黄色素A 20-30μg、山柰酚-3-O-芸香糖苷20-30μg。优选的，每1ml溶液含羟基红 花黄色素A 25μg、山柰酚-3-O-芸香糖苷25μg。
优选的，所述有机溶剂包括体积浓度5-15v/v％的甲醇；
所述超声步骤的功率为200-300W，频率30-50kHz。
具体的，所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，所述红花药物制剂包括红花配方颗粒、红花饮片或红花标准汤剂。
本发明还公开了一种红花药材及红花药物制剂的特征图谱和/或对照特征图谱，所 述红花药材及红花药物制剂的特征图谱或对照特征图谱由所述方法构建得到。
本发明还公开了所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱构建方法和/或所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱和/或对照特征图谱在红花药材及红花药物制剂质量检测领域的应用。
本发明还公开了一种红花药材及红花药物制剂的质量检测方法，包括按照所述方法构建所述特征图谱和对照特征图谱的步骤，以及，将所述特征图谱与对照特征图谱 进行比较的步骤。
本发明所述红花药材及红花药物制剂特征图谱的构建方法，以红花药材及红花药物制剂为检测对象，基于高效液相色谱法建立了针对该药物制剂的特征图谱方法，采 用中药色谱指纹图谱标定了12个共有特征峰，确认了峰1为紫丁香苷、峰3(S)为羟 基红花黄色素A、峰4为色氨酸、峰7为山奈酚-3-O-槐糖苷、峰8为芦丁、峰9为山 柰酚-3-O-芸香糖苷、峰12为红花炔苷，选择3号峰羟基红花黄色素A作为参照峰， 规定各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内， 规定值为：0.70(峰1)、0.94(峰2)、1.20(峰4)、1.91(峰5)、1.95(峰6)、2.43(峰 7)、2.65(峰8)、3.32(峰10)、3.39(峰11)、4.17(峰12)，确定了红花药材及红花 药物制剂的特征。本发明所述红花药材及红花药物制剂特征图谱的构建方法，能够全 面反映红花药材及红花药物制剂内在质量和用药安全，有利于其全面质量检测和整体 质量控制，具有稳定性高、精密度高及重复性好的优势。
本发明所述红花药材及红花药物制剂特征图谱的构建方法，可适用于红花饮片、红花标准汤剂冻干粉、红花配方颗粒的特征图谱的构建，可实现对上述制剂的质量检 测及质量控制。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为实施例1中不同色谱柱下的检测谱图；
图2为实施例1中不同检测波长下的检测谱图；
图3为实施例1中不同流动相梯度控制程序下的检测谱图；
图4为实施例1中不同流动相体系下的检测谱图；
图5为实施例1中不同流动相流速下的检测谱图；
图6为实施例1中不同柱温下的检测谱图；
图7为实施例1中不同仪器下的检测谱图；
图8为实施例2中供试样品的特征谱图；
图9为实施例2中供试样品离子模式下色谱图；
图10为实施例2中化合物的具体定位图谱；
图11为实施例2中红花与各对照品色谱图；
图12为实施例2中各化合物的紫外吸收光谱图；
图13为实施例3中红花药材对照特征图谱、红花药材供试品色谱图及羟基红花 黄色素A对照品色谱图；
图14为实施例3中仪器精密度共有模式图；
图15为实施例3中重复性共有模式图；
图16为实施例3中不同人员中间精密度共有模式色谱图；
图17为实施例3中不同批号色谱柱下共有模式色谱图；
图18为实施例3中阴性空白供试品特征图谱；
图19为实施例3中稳定性共有模式图色谱图；
图20为实施例3中不同流速下的色谱图；
图21为实施例3中不同柱温下的色谱图；
图22为实施例3中不同仪器下的色谱图；
图23为实施例3中多批次红花药材特征图谱；
图24为实施例4中红花饮片对照特征图谱、红花饮片供试品色谱图；
图25为实施例4中多批次红花饮片特征图谱；
图26为实施例5中红花标准汤剂对照特征图谱和红花冻干粉供试品色谱图；
图27为实施例5中仪器精密度共有模式图；
图28为实施例5中重复性共有模式图；
图29为实施例5中不同人员中间精密度共有模式色谱图；
图30为实施例5中不同批号色谱柱下共有模式色谱图；
图31为实施例5中阴性空白供试品特征图谱；
图32为实施例5中稳定性共有模式图色谱图；
图33为实施例5中不同流速下的色谱图；
图34为实施例5中不同柱温下的色谱图；
图35为实施例5中多批次红花标准汤剂冻干粉特征图谱；
图36为实施例6中红花配方颗粒对照特征图谱和红花配方颗粒供试品色谱图；
图37为实施例6中仪器精密度共有模式图；
图38为实施例6中重复性共有模式图；
图39为实施例6中不同人员中间精密度共有模式色谱图；
图40为实施例6中不同批号色谱柱下共有模式色谱图；
图41为实施例6中阴性空白供试品特征图谱；
图42为实施例6中稳定性共有模式图色谱图；
图43为实施例6中不同流速下的色谱图；
图44为实施例6中不同柱温下的色谱图。
具体实施方式
本发明如下实施例中，涉及的仪器和试剂包括：
高效液相色谱仪1：Thermo U3000色谱系统，包括四元溶剂管理器(Pμmp)、自 动进样器(Autosampler)、原装进口色谱柱温箱(Colμmn Compartment)、二极管阵列 紫外检测器(Detector)、Chromeleon色谱管理系统；
高效液相色谱仪2：waters e2695色谱系统，包括四元梯度输液泵(Alliance2695型)、120位高性能自动进样器、原装进口色谱柱温箱、Waters 2998二极管阵列紫外检 测器、Empower色谱管理系统；
高效液相色谱仪3：Agilent1260色谱系统，包括G1311B型四元泵、G1367E型自 动进样器、G1316A型PDA二极管阵列检测器、G1330B型柱温箱；
METTLER TOLEDO(瑞士梅特勒)ME36S、XS204、XS205、XSE205(十万分之 一)；SK5200H上海科导超声仪器有限公司；
色谱柱：Waters CORTECS HPLC T3 4.6×150nm 2.7μm；CAPCELL CORE C18 4.6×150nm 2.7μm；Waters CORTECS HPLC T3 2.1×150nm 1.6μm；
乙腈为色谱纯，水为超纯水；磷酸、甲酸、三氟乙酸、正丁醇、甲醇等其他试剂 均为分析纯；
羟基红花黄色素A；对照品(批号：111637-202111，购于中国食品药品检定研究院)
山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品(批号：112007-202103，购于中国食品药品检定研究院)；
红花对照药材(批号：120907-201713，购于中国食品药品检定研究院)；
红花配方颗粒(批号：1903001Y、1903002Y、1903003Y)。
实施例1特征图谱构建方法开发
1、色谱柱筛选
经前期研究证实，红花饮片经水煎煮制备为标准汤剂后，主要成分为黄酮及黄酮苷 类成分，红花冻干粉中的这类成分多而杂，水溶性好，极性强。因此，首先考虑保留能 力强的T3色谱柱，并同时尝试在HPLC和UPLC进行比较，具体选用的色谱柱如下：
Waters CORTECS T3 4.6×150nm 2.7μm；
CAPCELL CORE C18 4.6×150nm 2.7μm；
Waters CORTECS C18 4.6×150nm 2.7μm；
Waters CORTECS T3 2.1x150mm 1.6um；
Waters HSS T3 2.1x150mm 1.8um。
各色谱柱形成的图谱如附图1所示，其中，(a)-(e)分别表示Waters CORTECS T3、CAPCELL CORE C18、Waters CORTECS C18、Waters CORTECS T3、Waters HSS T3 下的谱图。
结果显示，使用UPLC时，整体出峰时间也较长，色谱峰峰型、分离度相较HPLC 并没有太大优势，因此暂定HPLC进行方法开发，经色谱柱比较，采用CAPCELL CORE C18色谱柱下色谱峰分布更均匀，故本发明方法选择CAPCELL CORE C18(4.6×150nm 2.7μm)色谱柱继续进行下一步优化。
2、检测波长选择
首先对红花标准汤剂冻干粉中主要的色谱峰在190-400nm下的吸收图谱进行提取， 结果如附图2所示，其中，(a)-(d)分别表示220nm、266nm、280nm、403nm波长下 的检测谱图。发现色谱峰最大吸收主要集中在4个波段(220nm、266nm、280nm、403nm) 附近，如下所示，在266nm下各特征峰响应比较平均，基线相对平稳，故选择检测波长 为266nm。
3、梯度程序优化
在上述检测条件下以色谱峰的信息量、色谱峰的分离度、分析时间等为指标，对流动相梯度程序进行优化，具体优化梯度如下表1。
表1梯度程序控制
上述梯度程序下的检测谱图见附图3所示，其中，(a)-(c)分别表示梯度程序1- 3的检测谱图。通过上述考察后，梯度2分离效果最好，因此，本方法选择特征图谱方 法为梯度2。
4、流动相系统选择
本实施例对比不同的流动相组分对色谱峰的分离效果，比较乙腈-0.05％磷酸、乙腈 -0.05％甲酸、乙腈-0.05％三氟乙酸等不同流动相系统的色谱图，以检测色谱峰的信息量 以及系统适应性参数作为评选指标。不同流动相下的检测结果分别见表2-4所示，检测谱图见附图4所示，其中，(a)-(c)分别表示乙腈-0.05％磷酸、乙腈-0.05％甲酸、乙 腈-0.05％三氟乙酸流动相体系下的检测谱图。
表2乙腈-0.05％磷酸流动相体系检测结果
| 名称 | 保留时间 | 面积 | 高度 | 宽度 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 1 | 5.908 | 27481 | 4070 | 31.198 | - | 1.75 | 19947 |
| 2 | 6.553 | 70063 | 10356 | 48.496 | 3.98 | 1.56 | 25061 |
| 3 | 8.414 | 34867 | 3345 | 55.209 | 9.57 | 0.98 | 22638 |
| 4 | 11.226 | 54166 | 4107 | 48.51 | 9.9 | 1.1 | 16311 |
| 5 | 12.985 | 42913 | 3986 | 38.208 | 5.58 | 1.06 | 31932 |
| 6 | 17.824 | 22646 | 4284 | 14.903 | 22.61 | 1.2 | 254064 |
| 7 | 18.116 | 61734 | 9757 | 28.806 | 2.03 | 1.65 | 229080 |
| 8 | 22.81 | 23639 | 2473 | 30.406 | 23.8 | 1.8 | 137836 |
| 9 | 25.168 | 41753 | 2577 | 72.515 | 8.35 | 1.08 | 91633 |
| 10 | 31.668 | 140219 | 17917 | 32.707 | 25.04 | 1.22 | 385169 |
| 11 | 32.281 | 41560 | 6244 | 24.805 | 3.28 | 1.13 | 527585 |
| 12 | 33.357 | 38092 | 4610 | 25.005 | 5.52 | 0.97 | 392579 |
| 13 | 40.38 | 63958 | 13275 | 24.005 | 42.77 | 1.55 | 1992191 |
| 14 | 41.316 | 49873 | 9423 | 18.904 | 7.62 | 1.23 | 1556843 |
| 15 | 42.294 | 53824 | 11572 | 24.005 | 8.32 | 0.89 | 2795914 |
表3乙腈-0.05％甲酸流动相体系检测结果
表4乙腈-0.05％三氟乙酸流动相体系检测结果
| 名称 | 保留时间 | 面积 | 高度 | 宽度 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 1 | 6.654 | 66068 | 10262 | 20.898 | - | 1.25 | 26032.11 |
| 2 | 8.79 | 28874 | 3385 | 29.206 | 11.04 | 1.19 | 24245.01 |
| 3 | 9.543 | 52225 | 4021 | 37.508 | 2.7 | 1.24 | 12811.8 |
| 4 | 11.314 | 25290 | 2218 | 35.007 | 5.63 | 1.37 | 21431.67 |
| 5 | 13.655 | 48265 | 4411 | 33.407 | 8.07 | 1.09 | 36634.94 |
| 6 | 17.889 | 30695 | 5576 | 15.603 | 19.89 | 1.29 | 254643.8 |
| 7 | 18.196 | 59546 | 10623 | 22.205 | 2.23 | 1.83 | 282782.8 |
| 8 | 22.991 | 26231 | 2705 | 23.905 | 24.9 | 1.31 | 129331.5 |
| 9 | 25.379 | 33063 | 2717 | 42.309 | 8.94 | 1.05 | 121619.1 |
| 10 | 31.736 | 143690 | 19797 | 27.806 | 27.09 | 1.22 | 460676.3 |
| 11 | 32.322 | 43247 | 6832 | 25.305 | 3.36 | 1.15 | 614102.7 |
| 12 | 33.101 | 60505 | 7138 | 26.606 | 4.06 | 0.93 | 350433.8 |
| 13 | 40.384 | 56315 | 13237 | 14.503 | 44 | 1.12 | 2070108 |
| 14 | 41.325 | 62637 | 10974 | 22.805 | 7.5 | 1.44 | 1386263 |
| 15 | 42.303 | 53272 | 11624 | 24.105 | 8.08 | 0.81 | 2665514 |
基于上述结果，本方法确定以乙腈-0.05％三氟乙酸作为特征图谱检测方法的流动 相系统。
5、不同流速考察
因红花药物制剂的成分较多，色谱峰较繁杂，考虑到流速可能会对其分离效果有一 定影响，故取同一份标准汤剂冻干粉样品的供试品溶液，按照上述选定的的流动相及梯度程序，分别以0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min流速进行考察，结果见下表5-7， 检测谱图结果见附图5，其中，(a)-(c)分别表示0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min 流速下的检测谱图。
表5流速0.6ml/min下的检测结果
表6流速0.7ml/min下的检测结果
| 峰号 | 保留时间 | 峰面积 | 峰高 | 峰宽(50％) | 不对称度 | 分离度 | 塔板数 |
| 1 | 5.88 | 0.9721 | 11.16 | 0.078 | 1.26 | 8.22 | 31257 |
| 2 | 7.38 | 0.4596 | 2.72 | 0.137 | 2.25 | 2.88 | 16085 |
| 3 | 8.117 | 2.024 | 11.03 | 0.165 | 1.23 | 6.64 | 13395 |
| 4 | 10.173 | 0.3938 | 1.86 | 0.2 | 1.75 | 26.29 | 14275 |
| 5 | 16.603 | 0.4684 | 4.12 | 0.088 | n.a. | 2.22 | 196549 |
| 6 | 16.92 | 1.1184 | 11.16 | 0.08 | 1.52 | 22.53 | 245941 |
| 7 | 21.037 | 0.5576 | 3.91 | 0.135 | 1.25 | 8.19 | 133953 |
| 8 | 22.857 | 0.4722 | 3.13 | 0.127 | 1.56 | 24.44 | 179197 |
| 9 | 28.473 | 1.6007 | 10 | 0.144 | 1.21 | 3.48 | 216348 |
| 10 | 29.26 | 1.0199 | 7.44 | 0.123 | 1.19 | 4.16 | 315615 |
| 11 | 30.237 | 1.7916 | 10.22 | 0.155 | 1.18 | 36.87 | 211556 |
| 12 | 37.97 | 0.9381 | 8.98 | 0.093 | 1.4 | 17.27 | 927837 |
表7流速0.8ml/min下的检测结果
上述结果表明，当流速为0.7ml/min时，各拟定特征峰分离效果最好，本方法选择流速为0.7ml/min进行后续的研究。
6、不同柱温考察
取标准汤剂冻干粉供试品溶液，注入液相色谱仪中，份考察20℃、25℃、30℃柱 温下对标准汤剂冻干粉的分离效果，结果见下表8-10所示，检测谱图结果见附图6， 其中，(a)-(c)分别表示20℃、25℃、30℃柱温下的检测谱图。
表8柱温20℃下的检测结果
| 峰号 | 保留时间 | 峰面积 | 峰高 | 峰宽(50％) | 不对称度 | 分离度 | 塔板数 |
| 1 | 6.083 | 0.989 | 10.62 | 0.083 | 1.22 | 11.9 | 29706 |
| 2 | 8.103 | 0.4245 | 3.22 | 0.117 | 1.3 | 3.31 | 26466 |
| 3 | 8.89 | 1.9243 | 10.72 | 0.163 | 1.31 | 7.69 | 16477 |
| 4 | 11.283 | 0.5592 | 2.21 | 0.204 | 1.32 | 24.71 | 16945 |
| 5 | 17.227 | 0.3585 | 4.01 | 0.08 | 1.39 | 2.61 | 258213 |
| 6 | 17.577 | 0.9697 | 10.97 | 0.079 | 1.22 | 27.82 | 277104 |
| 7 | 22.18 | 0.3784 | 3 | 0.117 | 1.11 | 9.09 | 200281 |
| 8 | 24.073 | 0.3539 | 2.54 | 0.129 | 1.19 | 27.26 | 192173 |
| 9 | 29.7 | 1.6514 | 12.7 | 0.114 | 1.35 | 1.99 | 373802 |
| 10 | 30.063 | 0.9881 | 8.59 | 0.101 | 1.13 | 3.93 | 488953 |
| 11 | 30.933 | 1.5227 | 8.61 | 0.16 | 0.84 | 34.52 | 206832 |
| 12 | 38.13 | 0.9583 | 9.28 | 0.086 | 1.58 | n.a. | 1091746 |
表9柱温25℃下的检测结果
| 峰号 | 保留时间 | 峰面积 | 峰高 | 峰宽(50％) | 不对称度 | 分离度 | 塔板数 |
| 1 | 5.88 | 0.9721 | 11.16 | 0.078 | 1.26 | 8.22 | 31257 |
| 2 | 7.38 | 0.4596 | 2.72 | 0.137 | 2.25 | 2.88 | 16085 |
| 3 | 8.117 | 2.024 | 11.03 | 0.165 | 1.23 | 6.64 | 13395 |
| 4 | 10.173 | 0.3938 | 1.86 | 0.2 | 1.75 | 26.29 | 14275 |
| 5 | 16.603 | 0.4684 | 4.12 | 0.088 | n.a. | 2.22 | 196549 |
| 6 | 16.92 | 1.1184 | 11.16 | 0.08 | 1.52 | 22.53 | 245941 |
| 7 | 21.037 | 0.5576 | 3.91 | 0.135 | 1.25 | 8.19 | 133953 |
| 8 | 22.857 | 0.4722 | 3.13 | 0.127 | 1.56 | 24.44 | 179197 |
| 9 | 28.473 | 1.6007 | 10 | 0.144 | 1.21 | 3.48 | 216348 |
| 10 | 29.26 | 1.0199 | 7.44 | 0.123 | 1.19 | 4.16 | 315615 |
| 11 | 30.237 | 1.7916 | 10.22 | 0.155 | 1.18 | 36.87 | 211556 |
| 12 | 37.97 | 0.9381 | 8.98 | 0.093 | 1.4 | 17.27 | 927837 |
表10柱温30℃下的检测结果
上述试验结果表明，柱温为25℃时，各特征峰分离效果更好，因此，本方法选择 柱温为25℃进行检测。
7、不同仪器耐用性考察
按照上述确定的方法及参数条件，分别在不同品牌的色谱仪下(Agilent 1260、waters e2695和赛默飞U3000)上进样，考察不同仪器耐用性，检测谱图结果见附图7，其中，(a)-(c)分别表示Agilent 1260、waters e2695和Thermo U3000仪器下的检测谱图。 结果表明不同仪器耐用性均较好。
综上，本实施例方案基于上述考察，选择的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，按下表11中的规 定进行梯度洗脱；检测波长为266nm；流速0.7ml/min，理论板数按羟基红花黄色素A 峰计算应不低于5000。
表11流动相梯度程序
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0-8 | 10 | 90 |
| 8-15 | 10→15 | 90→85 |
| 15-25 | 15→17 | 85→83 |
| 25-35 | 17→28 | 83→72 |
| 35-40 | 28→42 | 72→58 |
| 40-45 | 42→50 | 58→50 |
实施例2【特征图谱】中特征峰的指认
通过上述实施例1方案确定的特征图谱方法，取待测红花配方颗粒样品进行检测，检测谱图见附图8所示，离子模式下色谱图见附图9所示。
结合多批次测定结果，对特征峰重新进行选定，对特征峰指认进行了深入研究，采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用方法(UPLC-Q-TOF/MS)对红花样品进行分析，根 据样品多级质谱信息，结合天然产物高分辨质谱数据库及相关文献，对目标峰进行鉴定， 其并采用对照品定位和光谱研究，目标成分鉴定结果见下表12，确认峰1为紫丁香苷， 峰3为羟基红花黄色素A，峰4为色氨酸，峰7为山奈酚-3-O-槐糖苷，峰8为芦丁，峰 9为山柰酚-3-O-芸香糖苷，峰12为红花炔苷。
经LC/MS/MS分析结构，具体定位图谱见附图10所示，其中，(a)-(h)分别表示 化合物1(RT＝6.70min)、化合物5(RT＝17.00min)、化合物6(RT＝17.28min)、化合 物7(RT＝21.42min)、化合物8(RT＝23.37min)、化合物9(RT＝29.06min)、化合物10 (RT＝29.76min)、化合物12(RT＝37.79min)对应的MS1和MS2。
表12红花目标成分鉴定结果
基于上述确定的特征峰，红花与各对照品色谱图见附图11所示，其中，图(b) 中由上到下分别为色氨酸对照品、红花配方颗粒样品、羟基红花黄色素A对照品，图 (c)中由上到下分别为红花炔苷对照品和红花配方颗粒样品，图(d)为羟基红花黄 色素A对照品色谱图，图(e)为色氨酸对照品色谱图。
羟基红花黄色素A、色氨酸、紫丁香苷、山奈酚-3-O槐糖苷、芦丁、山柰酚3-O- 芸香糖苷、红花炔苷的紫外吸收光谱图如附图12中(a)-(g)所示，其中，1表示对 照品光谱，2表示样品中所含化合物的光谱。
本发明如下实施例中，为明确整个研究过程中量值传递情况，参照优化后的 HPLC特征图谱测定方法，需要对红花药材及不同剂型的红花药物制剂进行分析方法 验证及多批次检验，验证结果表明该方法操作简便、结果准确，方法重现性较好。
实施例3红花药材的特征图谱
1、特征图谱建立
【特征图谱】照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱CAPCELL CORE C18(4.6×150nm， 2.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，按照前述表11中的规 定进行梯度洗脱；检测波长为266nm；流速0.7ml/min。理论板数按羟基红花黄色素A 峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备
取红花对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流30分钟，取出，滤 过，滤液用水饱合的正丁醇萃取两次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，放冷，残渣加 10％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液，即得 对照药材参照物溶液。
另取羟基红花黄色素A、山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml分别含羟基红花黄色素A、山柰酚-3-O-芸香糖苷25μg的溶液，作为对照品 参照物溶液。
供试品溶液的制备
取红花药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流30分钟，取出，滤过， 滤液用水饱合的正丁醇萃取两次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，放冷，残渣加10％ 甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液，即得。
测定法
精密吸取参照物溶液、对照药材溶液、供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定。
所得红花药材对照特征图谱、红花药材供试品色谱图及羟基红花黄色素A对照品色谱图分别见附图13中(a)-(c)所示，其中，峰1：紫丁香苷；峰3(S)：羟基红 花黄色素A；峰4：色氨酸；峰7：山奈酚-3-O-槐糖苷；峰8：芦丁；峰9：山柰酚-3-O- 芸香糖苷；峰12：红花炔苷。
由附图结果可见，供试品色谱中应呈现12个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的12个特征峰相对应，其中峰3、峰9的保留时间应与相应的对照品参照峰的保留 时间相对应；以羟基红花黄色素A参照物的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保 留时间，应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.70(峰1)、0.94(峰2)、1.20 (峰4)、1.91(峰5)、1.95(峰6)、2.43(峰7)、2.65(峰8)、3.32(峰10)、3.39 (峰11)、4.17(峰12)。计算峰9、峰12与S峰的相对峰面积，应不低于1.0(峰 9)、0.40(峰12)。
2、系统适应性
基于上述检测方法，本实施例所述方法的系统适应性参数结果见下表13所示。
表13系统适应性参数
3、精密度验证
取红花药材0.5g，精密称定，按前述“供式品溶液的制备”的方法制备供试品， 连续进样6次，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％， 结果见下表14-15所示，仪器精密度共有模式图如附图14所示，由下到上分别对应精 密度1、2、3、4、5、6的谱图。
表14仪器精密度相对保留时间试验结果
表15仪器精密度相对峰面积试验结果
上述结果表明：12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％、相对峰面积RSD％ 小于5％。综合判断，方法的精密度良好，符合特征图谱的要求。
4、方法重复性试验
取同一批红花药材0.5g，平行称取6份，精密称定，按前述“供试品溶液制备”的 方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积 的RSD％，结果见下表16-17所述，重复性共有模式图见附图15所示，由下到上分别 对应重复性1、2、3、4、5、6的谱图。
表16方法重复性相对保留时间试验结果(n＝6)
表17方法重复性相对峰面积试验结果(n＝6)
上述结果表明：12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％ 均小于3％，综合判断，该方法的重复性较好，符合要求。
5、中间精密度(不同操作人员)
取同一批红花药材，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按供试品制备方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％， 结果如下表18-19所示，不同人员中间精密度共有模式色谱图见附图16所示，由下到 上分别对应人员甲、乙、丙。
表18中间精密度相对保留时间试验结果(不同操作人员)
表19中间精密度相对峰面积试验结果(不同操作人员)
上述结果表明：12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％小于5％。综合判断，方法的中间精密度(不同人员)良好，符合特征图谱的要求。
6、中间精密度(不同色谱柱批号)
通过前述色谱条件优化及色谱柱选择结果可知，该色谱条件重现需固定CAPCELLCORE C18；4.6mm×150mm，2.7um色谱柱，因此，取同一供试品溶液，分别用不同生 产批次(批号A34AB10165；批号A34AB10192)色谱柱进行试验，记录色谱图，计算 各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如下表20-21所示，不同色谱柱 条件下色谱图见图17所示，其中(a)和和(b)分别表示批号A34AB10165和批号 A34AB10192的检测结果。
表20不同色谱柱批号测定相对保留时间结果
表21不同色谱柱批号测定相对峰面积结果
结果表明，12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，12个特征峰的相对峰面 积RSD％小于4％，由图可知，不同色谱柱批号对峰分离度影响不大。
7、专属性
按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并考察红花药材阴性样品是否会造成干 扰。按【特征图谱】项下所述的色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图如附图18所示， 结果表明，阴性无干扰，方法专属性好。
8、稳定性考察
取同一份供试品溶液，配制后在第0、4、8、12、16、24小时进样。记录色谱图， 计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，以考察供试品溶液的稳定性。结 果如下表22-23所示，稳定性共有模式图色谱图见附图19所示，由下到上分别对应稳 定性0h、4h、8h、12h、16h、24h。
表22稳定性相对保留时间试验结果
表23稳定性相对峰面积试验结果
结果表明：12个特征峰的相对保留时间小于2％，相对峰面积RSD％小于6％。说 明供试品溶液在24小时内稳定。
9、不同流速的考察
取同一供试品溶液，分别在不同流速0.68ml/min、0.70ml/min和0.72ml/min下进行 试验，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如下表24-25，记录 色谱图如附图20所示，其中，(a)-(c)分别表示流速0.68ml/min、0.70ml/min、0.72ml/min 下的谱图。
表24不同流速相对保留时间结果
表25不同流速相对峰面积结果
结果表明，12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，12个特征峰的相对峰面积RSD％在0％-5％之间，由图可知，流速微小变化对特征峰的分离度影响不大，为保证特 征图谱的分离重现，说明本发明选择0.70ml/min作为红花药材特征图谱测定方法的流速 效果最佳。
10、不同柱温的考察
取同一供试品溶液分别在23℃、25℃和27℃下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如下表26-27所示，不同柱温下的色 谱图如图21所示，其中，(a)-(c)分别表示柱温23℃、25℃和27℃下的色谱图。
表26不同柱温测定相对保留时间结果
表27不同柱温相对峰面积结果
结果表明，12个特征峰的相对保留时间受流速有一定影响，12个特征峰的相对峰面积RSD％在0％-5％之间，由图可知，不同柱温条件下对特征峰的分离度稍有影响， 为保证特征图谱的分离重现，证明本发明选择柱温为25℃的效果最优。
11、不同仪器的考察
取同一供试品溶液分别在Thermo U3000、waters e2695、Agilent 1260下进行试验， 记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如下表28-29所示，不同仪器下的检测谱图见附图22所示，其中，(a)-(c)分别表示waters e2695、ThermoU3000或Agilent1260仪器条件下的色谱图。
表28不同仪器测定相对保留时间结果
表29不同仪器测定相对峰面积结果
上述结果表明，12个特征峰的相对保留时间均在规定值的±10％范围之内，12个特 征峰的相对峰面积RSD％在0％-8.39％之间，可能是因为特征峰在不同仪器上的响应值稍有不同，由图可知，不同仪器条件下对特征峰的分离度影响不大。
综上，由上述方法学考察结果可知，建立的红花药材【特征图谱】的12个共有峰中，各色谱峰不同柱温和不同流速均有一定程度上的影响，其余色谱条件影响变化不大。相对保留时间值处在±10％范围内，为适应其耐用性，将规定值范围控制在±10％以内。12、多批次红花药材【特征图谱】的测定
取红花药材(批号:K17030801、K17030802、K17030803、G1611197、G1611198、G1611199、Q2017-01、Q2017-02、Q2017-03、T2017-01、T2017-02、T2017-03、J2017- 01、J2017-02、J2017-03)按拟定红花药材【特征图谱】测定方法操作，测试结果见下表 30-31所示，多批次红花药材特征图谱见附图23所示，下到上对应药材批号为K17030801、K17030802、K17030803、G1611197、G1611198、G1611199、Q2017-01、Q2017-02、Q2017- 03、T2017-01、T2017-02、T2017-03、J2017-01、J2017-02、J2017-03。
测定结果表明多批次红花药材特征图谱各个特征峰规定的相对保留时间均在对照 图谱规定值的±10％范围之内。
表30多批次红花药材相对保留时间
表31多批次红花药材相对峰面积
相对保留时间规定值：根据多批次红花药材特征图谱测定结果确定：供试品色谱中 应呈现12个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的12个特征峰相对应，其中峰3、 峰9的保留时间应与相应的对照品参照峰的保留时间相对应；以羟基红花黄色素A参 照物的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的±10％范围之内。 规定值为：0.70(峰1)、0.94(峰2)、1.20(峰4)、1.91(峰5)、1.95(峰6)、2.43(峰 7)、2.65(峰8)、3.32(峰10)、3.39(峰11)、4.17(峰12)。
相对峰面积比规定值：红花主要化学成分含有黄酮类、生物碱、氨基酸类、脂肪酸类、和多糖等，红花的黄酮类成分为目前较公认的主要有效成分，主要包括主要有红花 醌苷、红花黄色素A、羟基红花黄色素A、羟基红花黄色素B、新山柰素、山柰酚、山 柰酚-3-O-芸香糖苷、6-羟基山柰酚、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、槲 皮素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷等。其中红花黄色素为红花目前最主要的有效成分。通过对 多批次红花特征图谱检测结合特征图谱峰指认信息，峰1为紫丁香苷，峰3为羟基红花 黄色素A，峰7为山奈酚-3-O-槐糖苷；峰8为芦丁；峰9为山柰酚-3-O-芸香糖苷，峰 12为红花炔苷均属于黄酮类成分，峰4为色氨酸，属于氨基酸类成分，羟基红花黄色素 A在整个研究过程中稳定性好，同时作为主要药效指标，较为适合作为S峰计算其余各 特征峰的相对峰面积，进行控制。紫丁香苷和色氨酸作为指认成分，在红花中专属性不 强，山奈酚-3-O-槐糖苷和芦丁与S峰的相对峰面积又相对过小，故规定其相对峰面积 值，会使得体现在最终成品标准中的意义不大；峰9的相对峰面积范围1.32-1.63，峰12 的相对峰面积范围0.54-0.68，从结果来看，从药材制备为饮片再制备为红花标准汤剂冻 干粉过程中，峰9、峰12传递性良好，因此，结合多批次数据，规定峰9的相对峰面积 以多批下限的80％制定为1.049，取整为1.0，规定峰12的相对峰面积以多批下限的80％ 制定为0.432，取整为0.40。
实施例4红花饮片
1、特征图谱建立
【特征图谱】照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适应性
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱CAPCELL CORE C18(4.6×150nm， 2.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，按前述表11中的规定 进行梯度洗脱；检测波长为266nm；流速0.7mL/min。理论板数按羟基红花黄色素A峰 计算应不低于5000。
参照物溶液的制备
取红花对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流30分钟，取出，滤 过，滤液用水饱合的正丁醇萃取两次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，放冷，残渣加 10％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液，即得 对照药材参照物溶液。
另取羟基红花黄色素A、山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1mL分别含羟基红花黄色素A、山柰酚-3-O-芸香糖苷25μg的溶液，作为对照 品参照物溶液。
供试品溶液的制备
取红花饮片0.5g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流30分钟，取出，滤过， 滤液用水饱合的正丁醇萃取两次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，放冷，残渣加10％ 甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取参照物溶液、对照药材溶液、供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
所得红花饮片对照特征图谱、红花饮片供试品色谱图分别见附图24中(a)-(b) 所示，其中，峰1：紫丁香苷；峰3(S)：羟基红花黄色素A；峰4：色氨酸；峰7：山 奈酚-3-O-槐糖苷；峰8：芦丁；峰9：山柰酚-3-O-芸香糖苷；峰12：红花炔苷。
可见，供试品色谱中应呈现12个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的12个 特征峰相对应，其中峰3、峰9的保留时间应与相应的对照品参照峰的保留时间相对 应；以羟基红花黄色素A参照物的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间， 应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.70(峰1)、0.94(峰2)、1.20(峰4)、 1.91(峰5)、1.95(峰6)、2.43(峰7)、2.65(峰8)、3.32(峰10)、3.39(峰11)、 4.17(峰12)。计算峰9、峰12与S峰的相对峰面积，应不低于1.0(峰9)、0.40(峰 12)。
2、系统适应性
参照红花药材【特征图谱】的方法，对色谱条件进行验证，具体结果如下表32， 结果表明该方法可适用于红花饮片。
表32系统适应性参数
3、多批次红花饮片【特征图谱】的测定
取多批次红花饮片(批号:批号:K17030801、K17030802、K17030803、 G1611197、G1611198、G1611199、Q2017-01、Q2017-02、Q2017-03、T2017-01、 T2017-02、T2017-03、J2017-01、J2017-02、J2017-03)按拟定红花饮片【特征图谱】 测定方法操作，测定结果分别见表33-34所示，多批次红花饮片特征图谱见附图25所 示，由下至上分别对应样品K17030801、K17030802、K17030803、G1611197、 G1611198、G1611199、Q2017-01、Q2017-02、Q2017-03、T2017-01、T2017-02、 T2017-03、J2017-01、J2017-02、J2017-03。
表33多批次红花饮片特征图谱测定相对保留时间结果
表34多批次红花饮片特征图谱测定相对峰面积结果
测定结果表明，红花饮片特征图谱各个特征峰规定的相对保留时间均在红花饮片对 照图谱规定值的±10％范围之内。
相对保留时间规定值：根据多批次红花饮片特征图谱测定结果确定：供试品色谱中 应呈现12个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的12个特征峰相对应，其中峰3、 峰9的保留时间应与相应的对照品参照峰的保留时间相对应；以羟基红花黄色素A参 照物的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的±10％范围之内。 规定值为：0.70(峰1)、0.94(峰2)、1.20(峰4)、1.91(峰5)、1.95(峰6)、2.43(峰 7)、2.65(峰8)、3.32(峰10)、3.39(峰11)、4.17(峰12)。
相对峰面积规定值：红花药材经简单净制后制备为红花饮片，炮制过程对特征峰数量及峰面积基本无影响，故红花饮片相对峰面积值参照药材执行。即规定特征峰9、 峰12与S峰的相对峰面积，应不低于1.0(峰9)、0.40(峰12)。
实施例5红花标准汤剂冻干粉
1、特征图谱方法
【特征图谱】照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适应性
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：CAPCELL CORE C18；4.6mm×150mm，2.7um；以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，按前述表11中的规定 进行梯度洗脱；检测波长为266nm；流速0.7ml/min。理论板数按羟基红花黄色素A峰 计算应不低于5000。
参照物溶液的制备
取红花对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流30分钟，取出，滤 过，滤液用水饱合的正丁醇萃取两次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，放冷，残渣加 10％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液，即得 对照药材参照物溶液。
另取羟基红花黄色素A、山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml含羟基红花黄色素A、山柰酚-3-O-芸香糖苷25ug的溶液，作为对照品参照 物溶液。
供试品溶液的制备
取红花标准汤剂冻干粉适量，研细，取约0.2g，加水10ml使溶解，用水饱合的正 丁醇萃取两次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，放冷，残渣加10％甲醇20ml，超声 处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取参照物溶液、对照药材溶液、供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述红花标准汤剂冻干粉对照特征图谱和红花标准汤剂冻干粉供试品色谱图分别 见附图26中(a)和(b)所示，其中，峰1：紫丁香苷；峰3(S)：羟基红花黄色素A； 峰4：色氨酸；峰7：山奈酚-3-O-槐糖苷；峰8：芦丁；峰9：山柰酚-3-O-芸香糖苷；峰 12：红花炔苷。
可见，供试品色谱中应呈现12个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的12个 特征峰相对应，其中峰3、峰9的保留时间应与相应的对照品参照峰的保留时间相对 应；以羟基红花黄色素A参照物的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间， 应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.70(峰1)、0.94(峰2)、1.20(峰4)、 1.91(峰5)、1.95(峰6)、2.43(峰7)、2.65(峰8)、3.32(峰10)、3.39(峰11)、 4.17(峰12)。计算峰9、峰12与S峰的相对峰面积，应不低于0.60(峰9)、0.35 (峰12)。
2、系统适应性
参照上述确定的【特征图谱】的方法，对色谱条件进行验证，具体结果如下表 35，结果表明该方法可适用于红花标准汤剂冻干粉。
表35系统适应性参数
| 名称 | 保留时间 | 面积 | 高度 | 宽度 | 分离度 | 对称因子 | 理论板数 |
| 1 | 6.498 | 52431 | 7658 | 31.3 | - | 1.25 | 21505 |
| 2 | 8.711 | 26823 | 3198 | 24.6 | 11.31 | 1.22 | 26194 |
| 3 | 9.313 | 65375 | 5105 | 46.6 | 2.22 | 1.29 | 13178 |
| 4 | 11.177 | 20547 | 1906 | 27.8 | 6.16 | 1.15 | 25351 |
| 5 | 17.813 | 15807 | 2733 | 18.6 | 32.09 | 1.69 | 284224 |
| 6 | 18.121 | 37631 | 6165 | 24.9 | 2.26 | 1.95 | 263338 |
| 7 | 22.617 | 23226 | 2713 | 20.9 | 24.36 | 1.09 | 158101 |
| 8 | 24.636 | 21703 | 2003 | 33.5 | 8.53 | 0.84 | 149611 |
| 9 | 30.27 | 91472 | 12797 | 24 | 26.29 | 1.18 | 427188 |
| 10 | 30.807 | 21629 | 3419 | 19.7 | 3.09 | 1.28 | 556557 |
| 11 | 31.514 | 79437 | 7975 | 28.6 | 3.37 | 1.24 | 226271 |
| 12 | 38.723 | 59501 | 10597 | 26.9 | 36.01 | 1.14 | 1096221 |
3、精密度
取红花冻干粉0.2g，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，连续进样6次，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果见下表 36-37，仪器精密度共有模式图见附图27，由下到上分别对应精密度1、2、3、4、5、6。
表36仪器精密度相对保留时间试验结果
表37仪器精密度相对峰面积试验结果
结果表明：12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％、相对峰面积RSD％小于3.5％。综合判断，方法的精密度良好，符合特征图谱的要求。
4、方法重复性试验
取同一批红花冻干粉0.2g，平行称取6份，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果见下表38-39，重复性共有模式图见附图28，由下到上分别对应重复性1、 2、3、4、5、6。
表38方法重复性相对保留时间试验结果(n＝6)
表39方法重复性相对峰面积试验结果(n＝6)
结果表明：12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％均小 于4％，综合判断，该方法的重复性较好，符合要求。
5、中间精密度(不同操作人员)
取同一批红花冻干粉，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按供试品制备方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如下表40-41所示，不同人员中间精密度共有模式色谱图见附图29，由下到上分别 对应人员甲、乙、丙。
表40中间精密度相对保留时间试验结果(不同操作人员)
表41中间精密度相对峰面积试验结果(不同操作人员)
结果表明：12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％小于4％。综合判断，方法的中间精密度(不同人员)好，符合特征图谱的要求。
6、中间精密度(不同色谱柱批号)
通过色谱条件优化及色谱柱选择结果可知，该色谱条件重现需固定CAPCELL COREC18；4.6mm×150mm，2.7um色谱柱，因此，取同一供试品溶液，分别用不同生 产批次(批号A34AB10165批号A34AB10192)色谱柱进行试验，记录色谱图，计算各 特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如下表42-43，不同色谱柱批号 A34AB10165和A34AB10192下色谱图分别见附图30中(a)和和(b)所示。
表42不同色谱柱批号测定相对保留时间结果
表43不同色谱柱批号测定相对峰面积结果
结果表明，12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，12个特征峰的相对峰面 积RSD％小于2％，由图可知，不同色谱柱批号对峰分离度影响不大。
7、专属性
按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并考察红花冻干粉阴性样品是否会造成干扰。按【特征图谱】项下所述的色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图，阴性空白 供试品特征图谱如附图31所示。结果表明，阴性无干扰，方法专属性好。
8、稳定性考察
取同一份供试品溶液，配制后在第0、4、8、12、16、24小时进样。记录色谱图， 计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，以考察供试品溶液的稳定性，结 果如下表44-45所示，稳定性共有模式图色谱图如图32所示，由下到上分别对应稳定 性0h、4h、8h、12h、16h、24h。
表44稳定性相对保留时间试验结果
表45稳定性相对峰面积试验结果
结果表明：12个特征峰的相对保留时间小于2％，相对峰面积RSD％小于4％。说 明供试品溶液在24小时内稳定。
9、不同流速的考察
取同一供试品溶液，分别在不同流速0.68ml/min、0.70ml/min和0.72ml/min下进行 试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如下表46-47所示，流速0.68ml/min、0.70ml/min和0.72ml/min下的色谱图分别见附图33中所 示，由下到上分别对流速0.70ml/min、0.68ml/min、0.72ml/min。
表46不同流速相对保留时间结果
表47不同流速相对峰面积结果
结果表明，12个特征峰的相对保留时间RSD％为0％～2％，12个特征峰的相对峰面积RSD％在0％-3.4％之间，由图可知，不同流速对特征峰的分离度影响不大，为保证 特征图谱的分离重现，流速0.70ml/min作为红花冻干粉特征图谱测定方法的效果最优。
10、不同柱温的考察
取同一供试品溶液分别在20℃、25℃和30℃下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如下表48-49，20℃、25℃和30℃柱 温下的色谱图见附图34中(a)-(c)所示。
表48不同柱温测定相对保留时间结果
表49不同柱温相对峰面积结果
结果表明，12个特征峰的相对保留时间RSD％小于8％，12个特征峰的相对峰面积RSD％在0％～4.7％之间，由图可知，不同柱温条件下对特征峰的分离度有一定影响，为 保证特征图谱的分离重现，故建议固定柱温为25℃。
由上述方法学考察结果可知，建立的红花冻干粉【特征图谱】的12个共有峰中， 各色谱峰受不同柱温和不同流速均有一定程度上的影响，其余色谱条件影响变化不大。 为适应其耐用性，建议将规定值范围控制在±10％以内。
11、多批次红花冻干粉【特征图谱】的测定
取多批次红花冻干粉(批号:K17030801、K17030802、K17030803、G1611197、G1611198、G1611199、Q2017-01、Q2017-02、Q2017-03、T2017-01、T2017-02、T2017- 03、J2017-01、J2017-02、J2017-03)按拟定红花冻干粉【特征图谱】测定方法操作，测 定结果分别见表50-51所示，多批次红花冻干粉特征图谱见附图35，由下至上分别对应 样品K17030801、K17030802、K17030803、G1611197、G1611198、G1611199、Q2017- 01、Q2017-02、Q2017-03、T2017-01、T2017-02、T2017-03、J2017-01、J2017-02、J2017- 03。
表50红花冻干粉相对保留时间
表51红花标准汤剂冻干粉相对峰面积
测定结果表明，红花冻干粉特征图谱各个特征峰的相对保留时间均在红花冻干粉对 照图谱规定值的±10％范围之内。
相对保留时间规定值：根据多批次红花标药材特征图谱测定结果确定：供试品色谱 中应呈现12个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的12个特征峰相对应，其中峰3、峰9的保留时间应与相应的对照品参照峰的保留时间相对应；以羟基红花黄色素A参 照物的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的±10％范围之内。 规定值为：0.70(峰1)、0.94(峰2)、1.20(峰4)、1.91(峰5)、1.95(峰6)、2.43(峰 7)、2.65(峰8)、3.32(峰10)、3.39(峰11)、4.17(峰12)。
相对峰面积比规定值：红花主要化学成分含有黄酮类、生物碱、氨基酸类、脂肪酸类、和多糖等，红花的黄酮类成分为目前较公认的主要有效成分，已报道成分主要包括 有红花醌苷、红花黄色素A、羟基红花黄色素A、羟基红花黄色素B、新山柰素、山柰 酚、山柰酚-3-O-芸香糖苷、6-羟基山柰酚、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖 苷、槲皮素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷等。其中红花黄色素为红花目前最主要的有效成分。 通过对多批次红花特征图谱检测，结合特征图谱峰指认信息，峰1为紫丁香苷，峰3为 羟基红花黄色素A，峰7为山奈酚-3-O-槐糖苷；峰8为芦丁；峰9为山柰酚-3-O-芸香 糖苷，均属于黄酮类成分，峰4为色氨酸，属于氨基酸类成分，羟基红花黄色素A在整 个研究过程中稳定性好，同时作为主要药效指标，较为适合作为S峰计算其余各特征峰 的相对峰面积，进行控制。紫丁香苷和色氨酸作为指认成分，在红花中专属性不强，山 奈酚-3-O-槐糖苷和芦丁与S峰的相对峰面积又相对过小，因此结合3批红花配方颗粒， 从红花药材制备为饮片、中间体再到配方颗粒峰9、峰12传递性良好，因此，规定峰9、 峰12的相对峰面积，即峰9的相对峰面积不低于0.60，峰12的相对峰面积值不低于 0.35。
实施例6红花配方颗粒
1、特征图谱
【特征图谱】照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适应性
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：CAPCELL CORE C18；4.6mm×150mm，2.7um；以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，按前述表11中的规定 进行梯度洗脱；检测波长为266nm；流速0.7ml/min。理论板数按羟基红花黄色素A峰 计算应不低于5000。
参照物溶液的制备
取红花对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流30分钟，取出，滤 过，滤液用水饱合的正丁醇萃取两次，每次25ml，合并正丁醇液，蒸干，放冷，残渣加 10％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液，即得 对照药材参照物溶液。
另取羟基红花黄色素A、山柰酚-3-O-芸香糖苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml含羟基红花黄色素A、山柰酚-3-O-芸香糖苷25ug的溶液，作为对照品参照 物溶液。
供试品溶液的制备
取本品适量，研细，取约0.2g，加水10ml使溶解，用水饱合的正丁醇萃取两次， 每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，放冷，残渣加10％甲醇20ml，超声处理(功率250W， 频率40kHz)30分钟，滤过，取续滤液，即得。
测定法
精密吸取参照物溶液、对照药材溶液、供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
所述红花配方颗粒的对照特征图谱及红花颗粒供试品色谱图见附图36中(a)和(b) 所示。其中，峰1：紫丁香苷；峰3(S)：羟基红花黄色素A；峰4：色氨酸；峰7：山 奈酚-3-O-槐糖苷；峰8：芦丁；峰9：山柰酚-3-O-芸香糖苷；峰12：红花炔苷。
可见，供试品色谱中应呈现12个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的12个 特征峰相对应，其中峰3、峰9的保留时间应与相应的对照品参照峰的保留时间相对 应；以羟基红花黄色素A参照物的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间， 应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.70(峰1)、0.94(峰2)、1.20(峰4)、 1.91(峰5)、1.95(峰6)、2.43(峰7)、2.65(峰8)、3.32(峰10)、3.39(峰11)、 4.17(峰12)。计算峰9、峰12与S峰的相对峰面积，应不低于0.60(峰9)、0.35 (峰12)。
2、系统适应性
参照上述确定的【特征图谱】的方法，对色谱条件进行验证，具体结果如下表 52，结果表明该方法可适用于红花配方颗粒。
表52系统适应性参数
3、精密度
取红花颗粒0.2g，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，连续进样6次，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果见下表53- 54所示，仪器精密度共有模式图见附图37，由下到上分别对应精密度1、2、3、4、5、 6。
表53仪器精密度相对保留时间试验结果
表54仪器精密度相对峰面积试验结果
结果表明：12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％、相对峰面积RSD％小于4％。综合判断，方法的精密度良好，符合特征图谱的要求。
4、方法重复性试验
取同一批红花颗粒0.2g，平行称取6份，精密称定，按“供试品溶液制备”的方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果见下表55-56所示，重复性共有模式图如图38所示，由下到上分别对应重复性1、 2、3、4、5、6。
表55方法重复性相对保留时间试验结果(n＝6)
表56方法重复性相对峰面积试验结果(n＝6)
结果表明：12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％均小 于4％，综合判断，该方法的重复性较好，符合要求。
5、中间精密度(不同操作人员)
取同一批红花颗粒，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按供试品制备方法制备供试品，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％， 结果如下表57-58所示，不同人员中间精密度共有模式色谱图如附图39所示，由下到 上分别对应人员甲、乙、丙。
表57中间精密度相对保留时间试验结果(不同操作人员)
表58中间精密度相对峰面积试验结果(不同操作人员)
结果表明：12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，相对峰面积RSD％小于4％。综合判断，方法的中间精密度(不同人员)好，符合特征图谱的要求。
6、中间精密度(不同色谱柱批号)
通过色谱条件优化及色谱柱选择结果可知，该色谱条件重现需固定CAPCELL COREC18；4.6mm×150mm，2.7um色谱柱，因此，取同一供试品溶液，分别用不同生 产批次(批号A34AB10165；批号A34AB10192)色谱柱进行试验，记录色谱图，计算 各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如下表59-60，色谱柱 A34AB10165和A34AB10192条件下色谱图分别见附图40中(a)-(b)所示。
表59不同色谱柱批号测定相对保留时间结果
表60不同色谱柱批号测定相对峰面积结果
结果表明，12个特征峰的相对保留时间RSD％小于2％，12个特征峰的相对峰面 积RSD％小于4％，由图可知，不同色谱柱批号对峰分离度影响不大。
7、专属性
按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并考察红花阴性颗粒样品是否会造成干扰。按【特征图谱】项下所述的色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图，阴性空白供 试品特征图谱件附图41所示，结果表明，阴性无干扰，方法专属性好。
8、稳定性考察
取同一份供试品溶液，配制后在第0、4、8、12、16、24小时进样。记录色谱图， 计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，以考察供试品溶液的稳定性。结 果如下表61-62所示，稳定性共有模式图色谱图如附图42所示，由下到上分别对应稳 定性0h、4h、8h、12h、16h、24h。
表61稳定性相对保留时间试验结果
表62稳定性相对峰面积试验结果
结果表明，12个特征峰的相对保留时间小于2％，相对峰面积RSD％小于4％，说 明供试品溶液在24小时内稳定。
9、不同流速的考察
取同一供试品溶液，分别在不同流速0.68ml/min、0.70ml/min和0.72ml/min下进行 试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如下表63-64所示，流速0.68ml/min、0.70ml/min和0.72ml/min下色谱图分别见附图43中(a) -(c)所示。
表63不同流速相对保留时间结果
表64不同流速相对峰面积结果
结果表明，12个特征峰的相对保留时间RSD％为0％～3％，12个特征峰的相对峰面积RSD％在5％之间，由图可知，不同流速对特征峰的分离度有一定影响，为保证特 征图谱的分离重现，本发明选定0.70ml/min作为红花颗粒特征图谱测定方法的效果最 优。
10、不同柱温的考察
取同一供试品溶液分别在23℃、25℃、27℃下进行试验，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD％，结果如下表65-66所示，23℃、25℃、27℃ 柱温下的色谱图如图44中(a)-(c)所示。
表65不同柱温测定相对保留时间结果
表66不同柱温相对峰面积结果
结果表明，12个特征峰的相对保留时间RSD％小于8％，12个特征峰的相对峰面积RSD％在0％～4.5％之间，由图可知，不同柱温条件下对特征峰的分离度有一定影响，为 保证特征图谱的分离重现，本方法固定柱温为25℃效果最优。
综上，由上述方法学考察结果可知，建立的红花颗粒【特征图谱】的12个共有峰中，各色谱峰受不同柱温和不同流速均有一定程度上的影响，其余色谱条件影响变化不大。相对保留时间值处在±10％范围内，为适应其耐用性，建议将规定值范围控制在±10％以内。
11、3批红花颗粒【特征图谱】的测定
取3批红花冻干粉(批号:1903001Y、1903002Y、1903003Y)按拟定红花颗粒【特 征图谱】测定方法操作，测定结果分别见下表67-68所示。
测定结果表明，3批红花颗粒特征图谱各个特征峰规定的相对保留时间均在规定值 的±10％范围之内，相对峰面积符合要求。
表67 3批红花颗粒相对保留时间
表68 3批红花颗粒相对峰面积
相对保留时间规定值：根据3批红花配方颗粒特征图谱测定结果确定：供试品色谱中应呈现12个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的12个特征峰相对应，其中峰3、 峰9的保留时间应与相应的对照品参照峰的保留时间相对应；以羟基红花黄色素A参 照物的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的±10％范围之内。 规定值为：0.70(峰1)、0.94(峰2)、1.20(峰4)、1.91(峰5)、1.95(峰6)、2.43(峰 7)、2.65(峰8)、3.32(峰10)、3.39(峰11)、4.17(峰12)。
相对峰面积比规定值：红花主要化学成分含有黄酮类、生物碱、氨基酸类、脂肪酸类、和多糖等，红花的黄酮类成分为目前较公认的主要有效成分，已报道成分主要包括 有红花醌苷、红花黄色素A、羟基红花黄色素A、羟基红花黄色素B、新山柰素、山柰 酚、山柰酚-3-O-芸香糖苷、6-羟基山柰酚、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖 苷、槲皮素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷等。其中红花黄色素为红花目前最主要的有效成分。 通过对多批次红花特征图谱检测，结合特征图谱峰指认信息，峰1为紫丁香苷，峰3为 羟基红花黄色素A，峰7为山奈酚-3-O-槐糖苷；峰8为芦丁；峰9为山柰酚-3-O-芸香 糖苷，均属于黄酮类成分，峰4为色氨酸，属于氨基酸类成分，羟基红花黄色素A在整 个研究过程中稳定性好，同时作为主要药效指标，较为适合作为S峰计算其余各特征峰 的相对峰面积，进行控制。紫丁香苷和色氨酸作为指认成分，在红花中专属性不强，山 奈酚-3-O-槐糖苷和芦丁与S峰的相对峰面积又相对过小，因此结合3批红花配方颗粒， 峰9的相对峰面积范围0.77-1.95，峰12的相对峰面积范围0.46-1.57，从结果来看，从 药材制备为饮片再制备为红花标准汤剂冻干粉过程中，峰9、峰12传递性良好，因此， 规定峰9的相对峰面积以多批下限的80％制定为0.616，取整为0.60，规定峰12的相 对峰面积以多批下限的80％制定为0.368，取整为0.35。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变 化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，包括对红花药材和/或红花药物制剂的供试溶液进行高效液相色谱检测的步骤；
色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：
0-8min，A：B为10％：90％；
8-15min，A：B为10％：90％→15％：85％；
15-25min，A：B为15％：85％→17％：83％；
25-35min，A：B为17％：83％→28％：72％；
35-40min，A：B为28％：72％→42％：58％；
40-45min，A：B为42％：58％→50％：50％。
2.根据权利要求1所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测步骤中，色谱条件还包括：柱温20-30℃，流速为0.5-1.0ml/min，检测波长为266nm。
3.根据权利要求1或2所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括：取供试品精密加入有机溶剂，密塞经超声处理，滤过并收集续滤液，即得。
4.根据权利要求1或2所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述方法还包括制备对照药材参照物溶液的步骤，具体包括：取红花对照药材，加水进行加热回流提取，收集提取液过滤并加入水饱合的正丁醇溶剂进行萃取，收集正丁醇相并进行蒸干，残渣加入有机溶剂，密塞经超声处理，滤过并收集续滤液，即得所需对照药材参照物溶液。
5.根据权利要求1-4任一项所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述方法还包括制备对照品参照物溶液的步骤，以及，基于所述高效液相色谱法构建对照品特征图谱的步骤；
所述对照品包括羟基红花黄色素A和/或山柰酚-3-O-芸香糖苷。
6.根据权利要求3-5任一项所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述有机溶剂包括体积浓度5-15v/v％的甲醇；
所述超声步骤的功率为200-300W，频率30-50kHz。
7.根据权利要求1-6任一项所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述红花药物制剂包括红花配方颗粒、红花饮片或红花标准汤剂。
8.一种红花药材及红花药物制剂的特征图谱和/或对照特征图谱，其特征在于，所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱或对照特征图谱由权利要求1-7任一项所述方法构建得到。
9.权利要求1-7任一项所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱构建方法和/或权利要求8所述红花药材及红花药物制剂的特征图谱和/或对照特征图谱在红花药材及红花药物制剂质量检测领域的应用。
10.一种红花药材及红花药物制剂的质量检测方法，其特征在于，包括按照权利要求1-7任一项所述方法构建所述特征图谱和对照特征图谱的步骤，以及，将所述特征图谱与对照特征图谱进行比较的步骤。
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