CN114577974B - 一种刘寄奴标准汤剂质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种刘寄奴标准汤剂质量检测方法，包括通过对刘寄奴标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及槲皮素含量测定，将刘寄奴标准汤剂含量标准限定为每1g含槲皮素为1.3‑3.7mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及槲皮素含量测定均采用液相色谱法测定。本发明的刘寄奴标准汤剂质量检测方法，通过多方面测量，来评定刘寄奴标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立刘寄奴汤剂可行的质量标准，实现刘寄奴标准汤剂质量的有效控制。

Description

一种刘寄奴标准汤剂质量检测方法
技术领域
本发明涉及中药材质量控制技术领域，具体涉及一种刘寄奴标准汤剂质量检测方法。
背景技术
现代药物需要具有稳定均一、安全和有效的三大特性，中成药在这几个方面难以比拟西药，因此，更需要采用多种手段进行检测，保证检测结果的可靠性和稳定性。刘寄奴为藤黄科植物黄海棠(Hypericum ascyron Linnaeus)的干燥地上部分，目前，关于刘寄奴的标准汤剂还未形成一个系统的质量检测方法，仅采用现有的检测手段来检测重楼汤剂是不够全面的，无法达到中药配方颗粒质量控制要求。因此，建立一种用于药材质量控制的重楼标准汤剂质量检测方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的就是要解决现有技术的不足，提供一种刘寄奴标准汤剂质量检测方法，以更好的控制刘寄奴汤剂的质量，表征药物质量，提高药物稳定性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种刘寄奴标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，
通过对刘寄奴标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及槲皮素含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含槲皮素为1.3-3.7mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及槲皮素含量测定均采用液相色谱法测定；
采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以刘寄奴对照药材制成的溶液作为参照物溶液b，以槲皮素对照品制成的溶液作为对照品溶液b，以刘寄奴标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液b，分别精密吸取参照物溶液b、对照品溶液b和供试品溶液b，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；
表a梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 20 80
5～30 20→30 80→70
30～38 30→42 70→58
38～60 42→50 58→50
60～75 50→62 50→38
75～77 62→20 38→80
77～80 20 80
流速：0.8mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：254nm。
在其中一实施例中，所述煎煮法包括：取刘寄奴饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得刘寄奴标准汤剂干膏粉。
在其中一实施例中，所述照薄层色谱法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液a：取刘寄奴标准汤剂样品2g，加甲醇20mL，超声处理30min，滤过，滤液置水浴上浓缩至干，放冷，残渣加甲醇1ml使溶解，制得供试品溶液a；
(2)制备对照品溶液a：取木犀草素对照品，加甲醇溶解，制得浓度为1mg/mL的对照品溶液a；
(3)进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液a与对照品溶液a各3uL；展开剂：体积比为5：4：1的甲苯-甲酸乙酯-甲酸溶液；显色剂：1％三氯化铝溶液，在105℃加热，紫外光灯365nm下检视。
在其中一实施例中，所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：
(1)制备参照物溶液b：取刘寄奴对照药材1g，加入80％甲醇25mL，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为参照物溶液b；
(2)制备对照品溶液b：取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为20ug/mL的对照品溶液b；
(3)制备供试品溶液b：取刘寄奴标准汤剂样品0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液b。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定槲皮素含量包括：进行液相色谱仪分析，以槲皮素对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以刘寄奴标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按规定进行梯度洗脱；流速：0.8mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：374nm。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定槲皮素含量还包括如下步骤：
(1)制备对照品溶液：取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成含槲皮素的浓度为20ug/ml的溶液，作为对照品溶液c；
(2)制备供试品溶液：取刘寄奴标准汤剂样品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液c。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)通过对刘寄奴标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及槲皮素含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定刘寄奴标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立刘寄奴汤剂可行的质量标准，实现刘寄奴标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。
(2)刘寄奴饮片煎煮制得刘寄奴饮片标准汤剂，槲皮素平均含量为2.50mg/g，测得含量范围为1.73～3.11mg/g，SD(标准差)为0.41，按均值±3SD来算，槲皮素含量允许范围为1.27～3.73mg/g，故拟定本标准汤剂的槲皮素含量范围为：1.3mg/g～3.7mg/g；槲皮素平均转移率为29.21％，转移率范围为17.42％～38.00％，SD为6.41，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，槲皮素含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为20.45～37.97％，按照±3SD来算，为9.97～48.45％，故拟定本标准汤剂的槲皮素含量转移率范围为：9.97～48.45％，结果表明，本发明多个批次标准汤剂中槲皮素含量及其转移率均在允许范围之内，因此本发明可为刘寄奴配方颗粒质量标准研究提供参考依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一实施例中刘寄奴饮片标准汤剂照薄层色谱法的点样量考察和检视方法考察TLC图谱；其中，1组的木犀草素对照品溶液进样量为3μL，2组的木犀草素对照品溶液进样量为5μL，3组的木犀草素对照品溶液进样量为10μL，4组的刘寄奴供试品溶液进样量为3μL，5组的刘寄奴供试品溶液进样量为5μL，6组的刘寄奴供试品溶液进样量为10μL，图(A)表示未喷显色剂于紫外光灯365nm下检视的图谱；图(B)表示喷显色剂并加热后日光检视的图谱；图(C)表示喷显色剂并加热后于紫外光灯365nm下检视的图谱。
图2为本发明一实施例中刘寄奴饮片15批次标准汤剂薄层图谱；其中，A组图谱为阴性对照样品薄层图谱，S组为木犀草素对照品溶液薄层图谱，1～15组为刘寄奴饮片15批次标准汤剂薄层图谱。
图3为刘寄奴饮片标准汤剂照薄层色谱法的检测波长考察中不同检测波长对比图；其中，S1的检测波长为220nm，S2的检测波长为254nm，S3的检测波长为280nm。
图4为刘寄奴饮片标准汤剂照薄层色谱法的流动相考察中不同流动相对比图；其中，S1的流动相为0.5％甲酸，S2的流动相为0.4％乙酸，S3的流动相为0.2％磷酸。
图5为刘寄奴饮片标准汤剂照薄层色谱法的柱温考察中不同柱温对比图；其中，S1的柱温为28℃，S2的柱温为30℃，S3的柱温为32℃。
图6为刘寄奴饮片标准汤剂照薄层色谱法的流速考察中不同流速对比图；其中，S1的流速为0.6mL/min，S2的流速为0.8mL/min，S3的流速为1.0mL/min。
图7为刘寄奴饮片标准汤剂照薄层色谱法的洗脱梯度考察中梯度1的特征图。
图8为刘寄奴饮片标准汤剂照薄层色谱法的洗脱梯度考察中梯度2的特征图。
图9为刘寄奴饮片标准汤剂照薄层色谱法的洗脱梯度考察中梯度3的特征图。
图10为本发明提取方法考察中不同提取方法对比图；其中，S1为超声提取供试品溶液特征图谱；S2为回流提取供试品溶液特征图谱。
图11为本发明提取时间考察中不同提取时间对比图；其中，S1为超声提取20min供试品溶液特征图谱；S2为超声提取30min供试品溶液特征图谱；S3为超声提取40min供试品溶液特征图谱。
图12为本发明提取溶剂考察中不同提取溶剂对比图；其中，S1为80％乙醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S2为10％甲醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S3为80％甲醇提取制备的供试品溶液特征图谱。
图13为本发明样品取用量考察中不同样品量对比图；其中，S1为样品取用量0.3g的供试品溶液特征图谱；S2为样品取用量0.5g的供试品溶液特征图谱；S3为样品取用量0.7g的供试品溶液特征图谱。
图14为本发明专属性考察中空白溶剂对比图；其中，S1为对照品溶液特征图谱；S2为供试品溶液特征图谱，S3为空白溶剂(80％甲醇)特征图谱。
图15为本发明重复性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为重复性1下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为重复性2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为重复性3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为重复性4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为重复性5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为重复性6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图16为本发明精密度试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为精密度1下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为精密度2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为精密度3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为精密度4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为精密度5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为精密度6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图17为本发明稳定性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为于0h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为于2h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为于4h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为于8h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为于12h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为于24h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图18为本发明不同色谱柱考察的特征图谱；其中，S1为批号PF-80的色谱柱，S2为批号PF-63的色谱柱。
图19为本发明不同柱温考察的特征图谱；其中，S1为柱温28℃的色谱柱，S2为柱温30℃的色谱柱，S3为柱温32℃的色谱柱。
图20为本发明不同流速考察的特征图谱；其中，S1流速为0.78min/mL，S2流速为0.80min/mL，S3流速为0.82min/mL。
图21为本发明标准汤剂特征图谱测定中槲皮素对照品图谱。
图22为本发明标准汤剂特征图谱测定中刘寄奴对照药材图谱。
图23为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批刘寄奴中药饮片叠加图谱；其中，S1(4)-S15(4)分别表示1-15批刘寄奴中药饮片叠加图谱。
图24为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批刘寄奴中药材共有峰图谱。
图25为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批刘寄奴标准汤剂叠加图谱；其中，S1(4)-S15(4)表示从1-15批刘寄奴标准汤剂叠加图谱。
图26为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批刘寄奴标准汤剂拟合图。
图27为本发明线性范围试验中槲皮素对照品不同浓度线性曲线图。
图28为本发明标准汤剂槲皮素含量特征图谱测定中专属性考察对比图；其中，S1为对照品溶液特征图谱；S2为供试品溶液特征图谱，S3为空白溶剂(80％甲醇)特征图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
本发明提供一种刘寄奴标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，通过对刘寄奴标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及槲皮素含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含槲皮素为1.3-3.7mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及槲皮素含量测定均采用液相色谱法测定。
本实施例中：
制备刘寄奴标准汤剂：参照《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药管理局[2009]3号)中的煎煮法，取15批次刘寄奴饮片加水至没过药材约4-5cm，浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得15批次刘寄奴标准汤剂干膏粉。
1.干浸膏出膏率测试
取15批次刘寄奴饮片，按以上制法制得15批次标准汤剂干膏粉，以干膏粉计算干浸膏得率(见表1)，并计算平均得率为6.993％，按照标准限度允许范围(均值70％～130％)计算，出膏率允许范围为4.90％-9.09％，拟定刘寄奴饮片标准汤剂出膏率允许范围为5％～9％
表1：出膏率
上述结果表明，15批次标准汤剂出膏率为5.8％～8.6％，均符合拟定限度范围5％～9％。
2.性状考察
根据15批次刘寄奴标准汤剂的实物性状特征，描述为棕黄色至棕褐色的粉末；气微，味苦。
3.薄层鉴别
本产品为单味饮片刘寄奴的干燥提取物，参考《湖南省中药材标准》2009年版刘寄奴“薄层鉴别”项下的方法，用木犀草素对照品作对照，建立了本品薄层鉴别方法，经15批次样品试验，供试品斑点清晰，阴性对照样品无干扰，故拟定为本品[鉴别]项。实验情况和结果如下：
3.1方法摸索、点样量考察、检视方法考察
试验方法照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验
对照品(对照药材)信息：刘寄奴对照药材(批号：DSTYL001601，乐美天医药)；木犀草素对照品(批号：111520-202006，中国食品药品检定研究院)
供试品溶液制备：取本品粉末2g，加甲醇20ml，超声处理30min，滤过，滤液置水浴上浓缩至干，放冷，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液：取木犀草素对照品，加甲醇制成每1ml含木犀草素1mg的溶液，即得。
薄层色谱条件：薄层板：硅胶G薄层板；点样量：吸取供试品溶液、对照品溶液各3μL、5μL、10μL；展开剂：甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5:4:1)；显色：喷以1％三氯化铝试液；检视：在105℃加热，分别在日光下、紫外光灯365nm下检视。
实验情况：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；检视方法的验证中，喷以1％三氯化铝试液，在105℃加热，于紫外光灯(365nm)下检视的效果最好；点样量考察中，供试品溶液、对照品溶液各3μL的出点效果最好，图2为刘寄奴配方颗粒方法摸索、点样量考察、检视方法考察TLC图谱。
3.2标准汤剂薄层鉴别
试验方法：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验
供试品溶液制备：取本品粉末2g，加甲醇20ml，超声处理30min，滤过，滤液置水浴上浓缩至干，放冷，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液：取木犀草素对照品，加甲醇制成每1ml含木犀草素1mg的溶液，即得。
薄层色谱条件：薄层板：硅胶G薄层板；点样量：吸取供试品溶液、对照品溶液各3μl；展开剂：甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5:4:1)；显色：喷以1％三氯化铝试液，在105℃加热，紫外光灯365nm下检视。
结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，15批次标准汤剂TLC图谱详见图2。
3.3薄层鉴别方法
拟定薄层鉴别标准：取本品粉末2g，加甲醇20ml，超声处理30min，滤过，滤液置水浴上浓缩至干，放冷，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取木犀草素对照品，加甲醇1ml，制成每1ml含1mg的对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》附录ⅥB)试验，分别吸取上述对照品溶液、供试品溶液各3uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5:4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝试液，在105℃加热，紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
4.浸出物测定
取15批次标准汤剂，以乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定，结果详见表2。
表2：浸出物测定结果
上述结果表明，15批次标准汤剂浸出物均值为40.64％，参考标准限度允许范围(均值70％～130％)的下限，拟定本品醇溶性浸出物不得少于28.5％，15批次标准汤剂测定结果均符合拟定限度要求。
5.特征图谱测试
5.1仪器、试剂与试药
(1)仪器：Thermo超高效液相色谱仪(U3000，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；色谱柱岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)，编号为PF-63、PF-80、PF-131；恒温水浴锅(HMTD-7000，北京市永光明医疗仪器有限公司)；超声波清洗器(KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司)；万分之一天平(PX224ZH，奥豪斯仪器有限公司)；百万分之一天平(AWU220D，日本岛津有限公司)。
(2)试剂：乙醇(天津市致远化学试剂有限公司)、甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)色谱纯；、乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司)为色谱纯，水为超纯水(实验室自制)。
(3)对照品(对照药材)：槲皮素(批号：100081-200406，含量：97.3％，中国药品生物制品检定所)、刘寄奴对照药材(批号：DSTYL001601，乐美天医药)。
5.2试验方法
5.2.1色谱条件的确定
(1)最佳吸收波长的确定
对检测波长220nm、254nm、280nm进行研究，确定最佳吸收波长。
取刘寄奴标准汤剂(T220101)适量，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟0.8ml；柱温：30℃；检测波长：254nm。
表3：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 20 80
5～30 20→30 80→70
30～38 30→42 70→58
38～60 42→50 58→50
60～75 50→62 50→38
75～77 62→20 38→80
77～80 20 80
结果显示，通过对比3种检测波长色谱图，如图3所示，选取254nm作为检测波长时，各特征峰响应值较大，基线平稳，干扰较小，故选取254nm作为检测波长。
(2)流动相的考察
本次实验选取0.4％乙酸溶液、0.5％甲酸溶液、0.2％磷酸溶液三种流动相以及不同流动相浓度进行比较，确定合适的流动相。
取刘寄奴标准汤剂(T220101)适量，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表4的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟0.8ml；柱温：30℃；检测波长：254nm。
表4：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 20 80
5～30 20→30 80→70
30～38 30→42 70→58
38～60 42→50 58→50
60～75 50→62 50→38
75～77 62→20 38→80
77～80 20 80
结果显示，通过对比3种不同流动相的色谱图，如图4所示，选取0.5％甲酸溶液和0.4％乙酸溶液作为流动相时，峰的信息较完整但峰分离度较差，选取0.2％磷酸溶液为流动相时，峰的信息完整，分离效果优于0.5％甲酸溶液和0.4％乙酸溶液，故选取0.2％磷酸溶液作为水相。
(3)柱温的考察
本次实验选取28℃、30℃、32℃3种柱温进行比较，选择合适柱温。
取刘寄奴标准汤剂(T220101)适量，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表5中的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟0.8ml；柱温：30℃；检测波长：254nm。
表5：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 20 80
5～30 20→30 80→70
30～38 30→42 70→58
38～60 42→50 58→50
60～75 50→62 50→38
75～77 62→20 38→80
77～80 20 80
结果显示，通过对比3种不同柱温的色谱图，如图5所示，3种流动相的色谱峰信息及峰形差异不大，选取30℃作为柱温时，峰分离度较好，故选取30℃作为柱温。
(4)流速的考察
本次实验选取0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min3种流速进行比较，选择合适流速。
取刘寄奴标准汤剂(T220101)适量，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表6的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟0.8ml；柱温：30℃；检测波长：254nm。
表6：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 20 80
5～30 20→30 80→70
30～38 30→42 70→58
38～60 42→50 58→50
60～75 50→62 50→38
75～77 62→20 38→80
77～80 20 80
结果显示，通过对比3种不同流速的色谱图，如图6所示，3种流动相的色谱峰信息及峰形差异不大，选取0.8ml/min作为流速时，峰分离度较好，故选取0.8ml/min作为流速。
(5)梯度优化
对刘寄奴标准汤剂特征图谱的洗脱梯度进行优化，确定最优梯度。
取刘寄奴标准汤剂(T211201)适量，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2磷酸溶液为流动相B，按表7的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟0.8ml；柱温：30℃；检测波长：254nm。
表7：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 20 80
5～30 20→30 80→70
30～38 30→42 70→58
38～60 42→50 58→50
60～75 50→62 50→38
75～77 62→20 38→80
77～80 20 80
表8：梯度1
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 20 80
5～60 20→60 80→40
60～65 60→20 40→80
表9：梯度2
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 20 80
5～20 20→30 80→70
20～28 30→42 70
28～53 42→50 70→55
53～63 50→62 55
63～78 62→20 55→40
78～80 20 40→80
表10：梯度3
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 20 80
5～30 20→30 80→70
30～38 30→42 70→58
38～60 42→50 58→50
60～75 50→62 50→38
75～77 62→20 38→80
77～80 20 80
结合参阅图7-图9，结果显示，通过对刘寄奴标准汤剂特征图谱的洗脱梯度进行优化，最终确定分离度较好的梯度3作为刘寄奴标准汤剂特征图谱的洗脱梯度。
5.2.2色谱条件
色谱条件：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表11的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟0.8ml；柱温：30℃；检测波长：254nm。
表11：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 20 80
5～30 20→30 80→70
30～38 30→42 70→58
38～60 42→50 58→50
60～75 50→62 50→38
75～77 62→20 38→80
77～80 20 80
5.2.3制备对照品溶液：取1g对照药材，加入80％甲醇25mL，超声30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。另取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含槲皮素20ug的溶液，摇匀，即得。
5.2.4制备供试品溶液：取本品刘寄奴标准汤剂样品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.2.5测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.3供试品溶液前处理方法考察
5.3.1提取方法的考察：分别以不同的提取方法制备供试品溶液，包括超声提取、回流提取，按上述5.2试验方法进行测定。结果表明，如图10所示，两种提取方式样品提取完全，分离度都较高，但超声处理“总峰面积/取样量”高于加热回流(详见表12)，故选择样品提取方式为超声处理。
表12：
提取方法 取样量 总峰面积 总峰面积/取样量
超声 0.5010 82.359 164.3892
回流 0.5013 80.492 160.5665
5.3.2提取时间的考察：分别以不同的超声提取时间制备供试品溶液，按上述5.2试验方法进行测定。结果表明，主峰个数一致，样品提取完全，提取时间为30min时“总峰面积/取样量”最大，如图11和表13所示，故确定供试品提取时间为30min。
表13：
提取时间 取样量 总峰面积 总峰面积/取样量
20min 0.5023 79.314 157.9017
30min 0.5015 84.386 168.2672
40min 0.5026 79.935 159.0430
5.3.3提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按5.2试验方法进行测定。结果表明，如图12和表14所示，提取溶剂为10％甲醇时，提取不完全，故排除。提取溶剂为80％甲醇时“总峰面积/取样量”最大，分离度较高，故确定以80％甲醇为提取溶剂。
表14：不同提取溶剂考察结果
提取溶剂 取样量 总峰面积 总峰面积/取样量
80％乙醇 0.5021 54.853 109.2472
10％甲醇 0.5014 52.866 105.4368
80％甲醇 0.5027 83.472 166.0473
5.3.4样品取用量考察：分别取不同样品称样量(0.3g、0.5g、0.7g)制备供试品溶液，按5.2试验方法进行测定。结果表明，不同取样量，如图13所示，主峰个数一致，提取样品称样量为0.5g时，“总峰面积/取样量”最大(详见表15)，故确定提取样品称样量为0.5g。
表15：不同样品取用量考察结果
取样量 取样量 总峰面积 总峰面积/取样量
0.3 0.3022 47.552 157.3527
0.5 0.5016 81.837 163.1519
0.7 0.7018 112.784 160.7068
综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取本品粉末刘寄奴标准汤剂样品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.4特征图谱分析方法验证
5.4.1专属性考察：取供试品用溶剂80％甲醇10ul，按以上5.2项下色谱条件进行测定。试验表明，如图14所示，空白溶剂无干扰。
5.4.2重复性试验：取同批样品约0.5g，共6份，按5.2色谱条件进行测定，结果显示，6份供试品特征图谱中有4个共有峰，采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度评价，相对保留时间及保留时间的RSD均在合格范围内(详见表16、17及图15)，表明该方法重现性良好。
表16：重复性试验特征图谱相对保留时间
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 0.2030 0.2029 0.2028 0.2030 0.2030 0.2028 0.05
2 0.3680 0.3677 0.3678 0.3682 0.3684 0.3682 0.07
3 0.5284 0.5282 0.5279 0.5283 0.5284 0.5284 0.04
4(S) 1 1 1 1 1 1 0.00
表17：重复性试验特征图谱相对峰面积
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 93.19 93.9 92.44 99.69 102.98 92.48 4.66
2 21.23 21.3 21.51 23.1 22.8 21.4 3.80
3 3.37 3.80 3.52 3.79 3.60 3.60 4.54
4(S) 100 100 100 100 100 100 0.00
5.4.3精密度试验：取同批样品约0.5g，按5.2色谱条件进行测定，连续进样6针测定，峰形、峰数基本一致，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度的评价，相对保留时间及保留时间的RSD均在合格范围内(详见表18、19以及图16)，表明该方法精密度良好。
表18：精密度试验特征图谱相对保留时间
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 0.2029 0.2030 0.2030 0.2030 0.2030 0.2030 0.02
2 0.3681 0.3682 0.3682 0.3682 0.3681 0.3681 0.01
3 0.5286 0.5287 0.5286 0.5285 0.5286 0.5285 0.01
4(S) 1 1 1 1 1 1 0.00
表19：精密度试验特征图谱相对峰面积
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 92.25 92.82 92.83 92.86 93.03 93.51 0.44
2 21.15 21.21 21.22 21.14 21.29 21.38 0.43
3 3.61 3.7 3.44 3.56 3.39 3.42 3.49
4(S) 100 100 100 100 100 100 0.00
5.4.4稳定性试验：取同批样品约0.5g，按5.2色谱条件进行测定，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定，特征图谱的峰形、峰数基本稳定，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度评价，相对保留时间及保留时间的RSD均在合格范围内(详见表20、21及图17)，表明供试品溶液在24小时内较稳定。
表20：稳定性试验特征图谱相对保留时间
峰号 0 2h 4h 8h 12h 24h RSD(％)
1 0.2029 0.2030 0.2030 0.2030 0.2030 0.2031 0.03
2 0.3681 0.3682 0.3682 0.3681 0.3680 0.3688 0.08
3 0.5286 0.5286 0.5286 0.5286 0.5286 0.5286 0.03
4(S) 1 1 1 1 1 1 0.00
表21：稳定性试验特征图谱相对峰面积
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 92.25 92.82 92.83 93.03 93.19 92.52 0.37
2 21.15 21.21 21.22 21.29 21.23 20.85 0.74
3 3.61 3.7 3.44 3.39 3.25 3.48 4.60
4(S) 100 100 100 100 100 100 0.00
5.4.5耐用性考察
(1)不同色谱柱的考察
在方法优化的过程中发现，不同型号的色谱柱对刘寄奴标准汤剂特征图谱的分离度影响较大，因此选择了岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)色谱柱。为保证该方法使用同一型号色谱柱的重现性，比较了同一型号不同批号的3根色谱柱(分别是PF-63、PF-80)对耐用性的影响。如图18，不同批次的色谱柱影响较小(详见表22、23)，同一型号不同批次的色谱柱耐用性良好。
表22：不同色谱柱考察特征图谱相对保留时间
峰号 PF-63 PF-80 RSD(％)
1 0.2080 0.2033 0.31
2 0.3785 0.3695 1.03
3 0.5362 0.5298 0.13
4(S) 1 1 0.00
表23：不同柱温考察特征图谱相对峰面积
峰号 28℃ 30℃ RSD(％)
1 92.52 95.17
2 20.1 20.96 2.96
3 3.18 3.17 0.22
4(S) 100 100 0.00
(2)不同柱温的考察
取“色谱柱耐用性考察”项下的供试品溶液，除了柱温分别改为28℃、30℃、32℃外，其余色谱条件不变，进样分析。以槲皮素为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，见表24、25和图19，结果显示相对保留时间均小于3％，相对峰面积均小于5％，说明柱温的影响较小，不同柱温耐用性较好。
表24：不同柱温考察特征图谱相对保留时间
峰号 28℃ 30℃ 32℃ RSD(％)
1 0.2080 0.2033 0.1988 2.26
2 0.3785 0.3695 0.3606 2.42
3 0.5362 0.5298 0.5208 1.46
4(S) 1 1 1 0.00
表25：不同柱温考察特征图谱相对峰面积
峰号 28℃ 30℃ 32℃ RSD(％)
1 92.79 92.07 90.37 1.35
2 21.69 20.35 22.41 4.87
3 3.03 3.11 3.15 1.97
4(S) 100 100 100 0.00
(3)不同流速的考察
取“色谱柱耐用性考察”项下的供试品溶液，除了流速分别改为0.78ml/min、0.80ml/min、0.82ml/min外，其余色谱条件不变，进样分析。以槲皮素为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，见表26、27和图20，结果显示相对峰面积RSD值均小于5.0％，相对保留时间RSD值均小于3.0％，结果表明该分析方法不同流速耐用性较好。
表26：不同流速考察特征图谱相对保留时间
峰号 0.78ml/min 0.80ml/min 0.82ml/min RSD(％)
1 0.2067 0.2032 0.1988 1.70
2 0.3736 0.3694 0.3649 1.18
3 0.5329 0.5294 0.5258 0.67
4(S) 1 1 1 0.00
表27：不同流速考察特征图谱相对峰面积
该特征图谱方法经专属性，精密度，重复性和稳定性验证，均符合规定，经耐用性考察，相对保留时间较稳定。
5.5标准汤剂特征图谱表征分析
5.5.1标准汤剂特征图谱测定
照上述拟定的特征图谱分析方法，测定15批刘寄奴标准汤剂及其制备使用的15批次中药饮片特征图谱，结果显示，标准汤剂及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有4个共有峰，并应与对照药材参照物色谱中的4个特征峰保留时间相对应，其中与槲皮素对照品参照物相对应的峰为峰4，共有峰特征图谱详见图21至26。
5.5.2特征色谱图相对保留时间评价
采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对选定的4个共有特征峰进行相似度的评价，结果显示，15批刘寄奴饮片标准汤剂特征色谱图相似度均在0.9以上，表明本标准汤剂质量相对稳定。以槲皮素参照物峰相对应的峰(4)为S峰，计算共有峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间及范围详见表28。
表28：15批标准汤剂共有峰相对保留时间
综上所述，采用高效液相色谱法建立的标准汤剂特征图谱测定方法，按照《中国药典》2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了精密度、重复性、稳定性验证，且符合要求。采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”对15批标准汤剂样品的特征图谱进行相似度评价，标定了4个共有特征峰，其中峰4为槲皮素。以槲皮素参照物相对应的峰为S峰，计算另3个特征峰相对保留时间，以15批次样品峰相对保留时间均值拟定为规定值分别为：0.20(峰1)、0.37(峰2)、0.54(峰3)，考虑试验操作、仪器、试剂等多因素误差，其相对保留时间允许范围拟定为±10％。
6.含量测定
6.1试验方法
2020版《中国药典》中刘寄奴含量测定项下含量测定成分为槲皮素。故刘寄奴配方颗粒选择槲皮素作为含测成分。
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表29中的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟0.8ml；柱温：30℃；检测波长：374nm。
表29：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 50 50
5～20 50→62 50→38
20～22 62→50 38→50
22～35 50 50
制备对照品溶液：取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含槲皮素20ug的溶液，摇匀，即得。
制备供试品溶液：取本品粉末，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％乙醇25mL，密塞，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用80％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
6.2供试品溶液前处理方法考察
6.2.1提取方法的考察：分别以不同的提取方法制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，回流的样品含量明显高于超声的样品，RSD为0.69％(详见表30)，故选择样品提取方式为回流处理。
表30：不同提取方法对比
6.2.2提取时间的考察：分别以不同的提取时间制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。提取时间为30分钟时，样品含量相对较高(详见表31)，RSD为4.59％，故选择样品时间为30分钟。
表31：不同提取时间对比
6.2.3提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，提取溶剂为80％乙醇时，槲皮素含量最高(详见表32)，RSD为38.68％，故确定以80％乙醇为提取溶剂。
表32：不同提取溶剂对比
6.2.4样品量考察：分别以不同取样量(0.3g、0.5g、0.7g)制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，取样量为0.5g的样品含量相对较高(详见表33)，故确定取样量为0.5g。
表32：不同取样量对比
6.2.5供试品溶液制备方法的确定
综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取本品粉末，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％乙醇25mL，密塞，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用80％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.3含量测定方法学验证
6.3.1重复性试验：取同批次标准汤剂样品约0.5g，共6份，按上述6.1试验方法进行测定，测得样品中槲皮素含量平均值分别为2.9207mg/g，RSD值为1.94％，试验表明该方法重现性良好(详见表33)。
表33：
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6.3.2精密度试验：取6.1所示的供试品溶液，连续进样6针，照上述6.1试验方法测定其峰面积，计算样品中槲皮素峰面积的RSD值为1.24％，表明仪器精密度良好(详见表34)。
表34：
6.3.3稳定性试验：取一批标准汤剂样品约0.5g，按上述6.1试验方法，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，测定其峰面积，计算其峰面积的RSD值为1.81％，试验表明供试品溶液在24小时内较稳定(详见表35)。
表35：
6.3.4线性范围试验：取槲皮素对照品溶液；1.1034ug/ml；11.0336ug/ml；22.0673ug/ml；55.1682ug/ml；110.3364ug/ml；220.6728ug/ml。按6.1项下色谱条件进行测定。
以槲皮素峰面积为纵坐标，进样质量为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，其回归方程为：y＝1.2875x+1.6234，R2＝0.9981，可知槲皮素在1.1034ug/ml～220.6728ug/ml范围内与其峰面积具有良好的线性关系(详见表36和图27)。
表36：槲皮素线性关系考察结果
供试液 浓度 峰面积
线性1 1.1034 1.9329
线性2 11.0336 6.0733
线性3 22.0673 16.2901
线性4 55.1682 43.3401
线性5 110.3364 79.2421
线性6 220.6728 172.0628
6.3.5加样回收率试验：精密称取样品(槲皮素含量为2.8300mg/g)约0.5g共6份，各加入已知浓度的槲皮素对照品溶液(220.6728ug/ml)2.3ml，按6.1项下方法制备供试品溶液，并按6.1项下色谱条件进行测定，计算槲皮素平均加样回收率为94.8557％，RSD为1.93％(详见表37)。
表37：槲皮素加样回收率试验结果
6.3.6专属性考察：按以上“6.1”项下色谱条件进行测定。试验表明：空白溶剂无干扰，详见图28，该方法专属性良好。
6.3.7耐用性考察
(1)不同色谱柱的考察
比较了不同批次的岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)的3根色谱柱(分别是PF-88、PF-89、PF-90)对含量测定的影响。如表38，结果显示3根色谱柱测定的含量RSD值为1.96％，小于3.0％。表明该分析方法在同一型号不同批次的色谱柱耐用性良好。
表38：
(2)不同柱温的考察
比较不同柱温28℃、30℃、32℃对含量测定的影响。见表39，测得含量RSD值为1.07％，小于3.0％，说明该方法对柱温的较小变动耐用性良好。
表39：
(3)不同流速的考察
比较不同流速，分别为0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min对含量测定的影响，其余色谱条件不变，进样分析。结果见表40，显示相对峰面积RSD值在1.44％，小于3.0％，结果表明该分析方法在不同流速耐用性较好。
表40：
(4)不同流动相比例考察
取“不同色谱柱考察”项下供试品溶液，除流动性比例调整外，其他色谱条件不变，计算含量及RSD值。结果如表41，3种不同流动性比例测得含量RSD值为0.58％，小于3.0％，说明流动性比例变动较小，耐用性良好。
表41：
综上，槲皮素分离度和色谱峰纯度均符合定量要求，整个分析方法经专属性、精密度、重复性、稳定性、加样回收及耐药性考察，结果均符合要求，说明建立的方法能很好的用于槲皮素的含量测定。
6.4标准汤剂及中药材含量测定
刘寄奴药材经产地初加工成片，经炮制后加工成刘寄奴饮片，其槲皮素含量不会发生变化，因此刘寄奴饮片特征色谱图及槲皮素含量参考其药材数据。
6.4.1按照上述拟定的含量分析方法，测定15批刘寄奴标准汤剂及其制备使用的15批次刘寄奴饮片及药材的槲皮素含量，结果详见表42、43、44。
表42：15批刘寄奴药材槲皮素测定结果
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表43：15批刘寄奴饮片槲皮素测定结果
表44：15批刘寄奴标准汤剂槲皮素测定结果
6.4.1槲皮素含量转移率：依据标准汤剂方法学研究确定的检测方法，对15批标准汤剂及其制备使用的中药饮片测定结果，计算槲皮素含量转移率，掌握其量质传递情况，为制定物料内控标准及其表征参数允许范围提供依据。刘寄奴饮片标准汤剂由刘寄奴饮片加水煎煮2次，滤液浓缩、冷冻干燥制得。其槲皮素含量转移率详见表45。
表45：15批刘寄奴饮片标准汤剂槲皮素含量转移率
由以上数据可知，刘寄奴饮片依方案煎煮制得刘寄奴饮片标准汤剂，本品槲皮素平均转移率为29.21％，测得转移率范围为17.42％-38.00％，SD为6.41。依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，槲皮素含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为20.45-37.97％；按照±3SD来算，为9.97～48.45％。故拟定本标准汤剂的槲皮素含量转移率范围为：9.97～48.45％。结果表明，15批次标准汤剂中槲皮素转移率均在±3SD允许范围之内。
本品标汤槲皮素平均含量为2.50mg/g，测得含量范围为1.73～3.11mg/g，SD为0.41；按均值±3SD计算，槲皮素含量允许范围为1.27～3.73mg/g。故拟定本标准汤剂的槲皮素含量范围为：1.3mg/g～3.7mg/g。结果表明，15批次标准汤剂中槲皮素及其转移率均在允许范围之内，可为刘寄奴配方颗粒质量研究提供参考依据。
本发明提供的刘寄奴标准汤剂质量检测方法，通过对刘寄奴标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及槲皮素含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定刘寄奴标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立刘寄奴汤剂可行的质量标准，实现刘寄奴标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。刘寄奴饮片煎煮制得刘寄奴饮片标准汤剂，槲皮素平均含量为2.50mg/g，测得含量范围为1.73～3.11mg/g，SD(标准差)为0.41，按均值±3SD来算，槲皮素含量允许范围为1.27～3.73mg/g，故拟定本标准汤剂的槲皮素含量范围为：1.3mg/g～3.7mg/g；槲皮素平均转移率为29.21％，转移率范围为17.42％～38.00％，SD为6.41，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，槲皮素含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为20.45～37.97％，按照±3SD来算，为9.97～48.45％，故拟定本标准汤剂的槲皮素含量转移率范围为：9.97～48.45％，结果表明，本发明多个批次标准汤剂中槲皮素含量及其转移率均在允许范围之内，因此本发明可为刘寄奴配方颗粒质量标准研究提供参考依据。
所述领域技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种刘寄奴标准汤剂质量检测方法，其特征在于，包括如下检测方法，
通过对刘寄奴标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及槲皮素含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含槲皮素为1.3-3.7mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及槲皮素含量测定均采用液相色谱法测定；
采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以刘寄奴对照药材制成的溶液作为参照物溶液b，以槲皮素对照品制成的溶液作为对照品溶液b，以刘寄奴标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液b，分别精密吸取参照物溶液b、对照品溶液b和供试品溶液b，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：C18-AQ，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5um；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2%磷酸溶液为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；
表a梯度洗脱程序
流速：0.8mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：254nm；
采用液相色谱法测定槲皮素含量包括：进行液相色谱仪分析，以槲皮素对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以刘寄奴标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：C18-AQ，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5um；流动相：以甲醇为流动相A，以0.2%磷酸溶液为流动相B，按表b规定进行梯度洗脱；流速：0.8mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：374nm；
表b：
采用液相色谱法测定槲皮素含量还包括：
S11:制备对照品溶液：取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成含槲皮素的浓度为20ug/ml的溶液，作为对照品溶液c；
S12:制备供试品溶液：取刘寄奴标准汤剂样品0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25mL，密塞，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液c。
2.如权利要求1所述的刘寄奴标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述煎煮法包括：取刘寄奴饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，进行固液分离，浓缩干燥，制得刘寄奴标准汤剂干膏粉。
3.如权利要求1所述的刘寄奴标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述照薄层色谱法包括如下步骤：
S21:制备供试品溶液a：取刘寄奴标准汤剂样品2g，加甲醇20mL，超声处理30min，滤过，滤液置水浴上浓缩至干，放冷，残渣加甲醇1ml使溶解，制得供试品溶液a；
S22:制备对照品溶液a：取木犀草素对照品，加甲醇溶解，制得浓度为1mg/mL的对照品溶液a；
S23:进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液a与对照品溶液a各3uL；展开剂：体积比为5：4：1的甲苯-甲酸乙酯-甲酸溶液；显色剂：1%三氯化铝溶液，在105℃加热，紫外光灯365nm下检视。
4.如权利要求1所述的刘寄奴标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。
5.如权利要求1所述的刘寄奴标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：
S31:制备参照物溶液b：取刘寄奴对照药材1g，加入80%甲醇25mL，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为参照物溶液b；
S32:制备对照品溶液b：取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为20ug/mL的对照品溶液b；
S33:制备供试品溶液b：取刘寄奴标准汤剂样品0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的80%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液b。
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