CN114323137B

CN114323137B - 一种蒸黄精标准汤剂质量检测方法

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Publication number: CN114323137B
Application number: CN202111631827.9A
Authority: CN
Inventors: 何述金; 周代俊; 黄黎明; 朱美成; 周乐学; 喻艳
Original assignee: Changsha Xinlin Pharmaceutical Co ltd; HUNAN XINHUI PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Changsha Xinlin Pharmaceutical Co ltd; HUNAN XINHUI PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114323137A

Abstract

本发明提供一种蒸黄精标准汤剂质量检测方法，包括通过对蒸黄精标准汤剂的干浸膏出膏率、性状、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及尿苷含量测定，将蒸黄精标准汤剂含量标准限定为每1g含尿苷为0.10‑0.50mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及尿苷含量测定均采用液相色谱法测定。本发明的蒸黄精标准汤剂质量检测方法，通过多方面测量，来评定蒸黄精标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立蒸黄精汤剂可行的质量标准，实现蒸黄精标准汤剂质量的有效控制。

Description

一种蒸黄精标准汤剂质量检测方法

技术领域

本发明涉及中药材质量控制技术领域，具体涉及一种蒸黄精标准汤剂质量检测方法。

背景技术

现代药物需要具有稳定均一、安全和有效的三大特性，中成药在这几个方面难以比拟西药，因此，更需要采用多种手段进行检测，保证检测结果的可靠性和稳定性。中药材中的黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua的燥根茎，按形状不同，习称“大黄精”、“鸡头黄精”、“姜形黄精”，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾之功效。目前，关于单味饮片蒸黄精的标准汤剂还未形成一个系统的质量检测方法，仅采用现有的检测方法来检测蒸黄精汤剂是不够全面的，无法达到中药配方颗粒质量控制要求。因此，建立一种用于药材质量控制的蒸黄精标准汤剂质量检测方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的就是要解决现有技术的不足，提供一种蒸黄精标准汤剂质量检测方法，以更好的控制蒸黄精汤剂的质量，表征药物质量，提高药物稳定性。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种蒸黄精标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，

通过对蒸黄精标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及尿苷含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含尿苷为0.10-0.50mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及尿苷含量测定均采用液相色谱法测定；

采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以黄精对照药材制成的溶液作为参照物溶液b，以尿苷对照品制成的溶液作为对照品溶液b，以蒸黄精标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液b，分别精密吸取参照物溶液b、对照品溶液b和供试品溶液b，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSelect HSS T3，250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；

表a梯度洗脱程序

流速：0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：261nm。

在其中一实施例中，所述煎煮法包括：取蒸黄精饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得蒸黄精标准汤剂干膏粉。

在其中一实施例中，所述照薄层色谱法包括如下步骤：

(1)制备供试品溶液a：取蒸黄精标准汤剂样品1g，加70％乙醇20mL，加热回流1小时，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10mL溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，制得供试品溶液a；

(2)制备对照药材溶液a：取黄精对照药材1g，加70％乙醇20mL，加热回流1小时，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10mL溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，制得对照药材溶液a；

(3)进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液a与对照药材溶液a各10uL；展开剂：体积比为5：2：0.1的石油醚-乙酸乙酯-甲酸溶液，所述石油醚沸程规格为60～90℃；显色剂：5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

在其中一实施例中，所述热浸法以无水乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。

在其中一实施例中，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：

(1)制备参照物溶液b：取黄精对照药材1g，精密加水10mL，超声处理1小时，过滤，取续滤液，作为参照物溶液b；

(2)制备对照品溶液b：取尿苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为10ug/mL的对照品溶液b；

(3)制备供试品溶液b：取蒸黄精标准汤剂样品1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密称定加入水25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液b。

在其中一实施例中，采用液相色谱法测定尿苷含量包括：进行液相色谱仪分析，以尿苷对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以蒸黄精标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSelect HSS T3，250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按规定进行梯度洗脱；流速：0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：261nm。

在其中一实施例中，采用液相色谱法测定尿苷含量还包括如下步骤：

(1)制备对照品溶液：取尿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成含尿苷的浓度为10ug/ml的溶液，作为对照品溶液c；

(2)制备供试品溶液：取蒸黄精标准汤剂样品约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液c。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)通过对蒸黄精标准汤剂的干浸膏出膏率、性状、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及尿苷含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定蒸黄精标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立蒸黄精汤剂可行的质量标准，实现蒸黄精标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。

(2)蒸黄精饮片煎煮制得蒸黄精饮片标准汤剂，尿苷平均含量为0.27mg/g，测得含量范围为0.18～0.33mg/g，SD(标准差)为0.05，按均值±3SD计算，尿苷含量允许范围为0.12～0.42mg/g，故拟定本标准汤剂的尿苷含量范围为：0.10mg/g～0.50mg/g；尿苷平均转移率为66.26％，转移率范围为42.59％～87.53％，SD为12.0，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，尿苷含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为46.38～86.14％，按照-3SD，+2SD来算，为30.26～90.26％，故拟定本标准汤剂的尿苷含量转移率范围为：30.26～90.26％，结果表明，本发明多个批次标准汤剂中尿苷含量及其转移率均在允许范围之内，因此本发明可为蒸黄精配方颗粒质量标准研究提供参考依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一实施例中蒸黄精(多花黄精)饮片15批次标准汤剂薄层图谱；其中，A组图谱为阴性对照样品薄层图谱，S组为黄精对照药材溶液薄层图谱，1～15组为蒸黄精(多花黄精)饮片15批次标准汤剂薄层图谱。

图2为本发明提取方法考察中不同提取方法对比图；其中，S1为超声提取供试品溶液特征图谱；S2为回流提取供试品溶液特征图谱。

图3为本发明提取时间考察中不同提取时间对比图；其中，S1为超声提取20min供试品溶液特征图谱；S2为超声提取30min供试品溶液特征图谱；S3为超声提取40min供试品溶液特征图谱。

图4为本发明提取溶剂考察中不同提取溶剂对比图；其中，S1为甲醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S2为50％甲醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S3为水提取制备的供试品溶液特征图谱。

图5为本发明样品取用量考察中不同样品量对比图；其中，S1为样品取用量0.5g的供试品溶液特征图谱；S2为样品取用量1.0g的供试品溶液特征图谱；S3为样品取用量1.5g的供试品溶液特征图谱。

图6为本发明专属性考察中空白溶剂对比图；其中，S1为空白溶剂(水)特征图谱；S2为对照品溶液特征图谱；S3为供试品溶液特征图谱。

图7为本发明重复性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为重复性1下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为重复性2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为重复性3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为重复性4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为重复性5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为重复性6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。

图8为本发明精密度试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为精密度1下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为精密度2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为精密度3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为精密度4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为精密度5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为精密度6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。

图9为本发明稳定性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为于0h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为于2h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为于4h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为于8h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为于12h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为于24h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。

图10为本发明标准汤剂特征图谱测定中尿苷对照品图谱。

图11为本发明标准汤剂特征图谱测定中黄精(多花黄精)对照药材图谱。

图12为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批蒸黄精中药饮片叠加图谱；其中，S1-S15分别表示1-15批蒸黄精中药材叠加图谱(批号依次为210601、210602、210901、Y210901、Y210902、Y210903、Y210904、Y210905、Y210906、Y210907、Y210908、Y210909、Y210910、Y210911、Y210912)。

图13为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批黄精中药材共有峰图谱。

图14为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批蒸黄精标准汤剂叠加图谱；其中，S1-S15分别表示1-15批蒸黄精标准汤剂叠加图谱(批号依次为210601T、210602T、210901T、Y210901T、Y210902T、Y210903T、Y210904T、Y210905T、Y210906T、Y210907T、Y210908T、Y210909T、Y210910T、Y210911T、Y210912T)。

图15为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批蒸黄精标准汤剂拟合图。

图16为本发明线性范围试验中尿苷对照品溶液不同浓度线性曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

本发明提供一种蒸黄精(多花黄精)标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，通过对蒸黄精(多花黄精)标准汤剂的干浸膏出膏率、性状、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及尿苷含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含尿苷为0.10-0.50mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及尿苷含量测定均采用液相色谱法测定。

本实施例中：

制备蒸黄精(多花黄精)标准汤剂：参照《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药管理局[2009]3号)中的煎煮法，取15批次蒸黄精(多花黄精)饮片加水至没过药材约4-5cm，浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得15批次蒸黄精(多花黄精)标准汤剂干膏粉。

1.干浸膏出膏率测试

取15批次蒸黄精饮片，按以上制法制得15批次蒸黄精(多花黄精)标准汤剂干膏粉，以干膏粉计算干浸膏得率(见表1)，并计算平均得率为45.37％，按照标准汤剂出膏率允许范围(均值70％～130％)计算，出膏率允许范围为31.76％～61.69％，故拟定本品出膏率为34％～62％。

表1：蒸黄精(多花黄精)饮片标准汤剂出膏率

上述结果表明，15批次标准汤剂干浸膏出膏率为41.2％～59.0％，均符合拟定限度范围34％～62％。

2.性状考察

根据15批次蒸黄精(多花黄精)标准汤剂的实物性状特征，描述为棕色至棕褐色的粉末，气微，味甜。

3.薄层鉴别

本发明的产品为单味饮片蒸黄精(多花黄精)的干燥提取物，参考《中国药典》2020年版一部黄精“薄层鉴别”项下的方法，用黄精(多花黄精)对照药材作对照，建立了本品薄层鉴别方法，经15批次样品试验，供试品斑点清晰，阴性对照样品无干扰，故拟定为本品鉴别项。试验方法和结果如下：

试验方法：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验

供试品溶液制备：取本品粉末1g，加70％乙醇20mL，加热回流1小时，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10mL溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，即得。

对照药材溶液制备：取黄精对照药材1g，加70％乙醇20mL，加热回流1小时，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10mL溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，即得。

薄层色谱条件：薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液与对照药材溶液均为10uL；展开剂：体积比为5：2：0.1的石油醚-乙酸乙酯-甲酸溶液，所述石油醚沸程规格为60～90℃；显色剂：5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，检视。

结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，15批次标准汤剂TLC图谱详见图1。

4.浸出物测定

取15批次标准汤剂，以无水乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定，结果详见表2。

表2：蒸黄精(多花黄精)饮片标准汤剂浸出物测定结果

上述结果表明，15批次标准汤剂浸出物均值为50.69％，参考标准汤剂出膏率允许范围(均值70％～130％)的下限，拟定本品醇溶性浸出物不得少于36.0％，15批次标准汤剂测定结果均符合拟定限度要求。

5.特征图谱测试

5.1液相色谱法

色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSelect HSS T3，250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按表3的规定进行梯度洗脱；流速：0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：261nm。

表3：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～16	0→2	100→98
16～30	2→3	98→97
			30～45	3→5	97→95
45～65	5→10	95→90
			65～70	10→25	90→75
70～75	25→50	75→50
			75～80	50→100	50→0

(1)制备参照物溶液：取黄精对照药材1g，精密加水10mL，超声处理1小时，过滤，取续滤液，即得；

(2)制备对照品溶液：取尿苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为10ug/mL的对照品溶液；

(3)制备供试品溶液：取蒸黄精标准汤剂样品1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密称定加入水25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

测定法：分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

5.2方法学考察

提取方法的考察：分别以不同的提取方法制备供试品溶液，包括超声提取、回流提取，按上述5.1试验方法进行测定。结果表明，如图2所示，超声提取与回流提取的主峰个数一致，超声主峰总峰面积更大，故选择样品提取方式为更为便捷的超声处理。

提取时间的考察：分别以不同的超声提取时间制备供试品溶液，按上述5.1试验方法进行测定。结果表明，主峰个数一致，不同提取时间的差别不大，如图3所示，为简化操作，确定以30min为供试品提取时间。

提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按5.1试验方法进行测定。结果表明，如图4所示，主峰个数一致，提取溶剂为水时，特征峰峰型最好，故确定以水为提取溶剂。

样品取用量考察：分别取不同样品量(0.5g、1.0g、1.5g)制备供试品溶液，按5.1试验方法进行测定。结果表明，不同取样量，如图5所示，主峰个数一致，供试品取样量为1.0g时，峰型最更好，故确定供试品取样量为1.0g。

综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取蒸黄精标准汤剂样品约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

5.3特征图谱分析方法验证

专属性考察：取供试品用溶剂水10μL，按5.1色谱条件进行测定，试验表明，如图6所示，空白溶剂无干扰。

重复性试验：取同批样品约1.0g，共6份，按5.1色谱条件进行测定，结果显示，6份供试品特征图谱中有4个共有峰，采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度的评价，相对保留时间及保留时间的RSD均在合格范围内(详见表4、表5及图7)，表明该方法重现性良好。

表4：重复性试验特征图谱相对保留时间

峰号	S1	S2	S3	S4	S5	S6	RSD(％)
								1(S)	1	1	1	1	1	1	0.000
2	1.446	1.446	1.446	1.444	1.447	1.448	0.092
								3	1.954	1.956	1.953	1.952	1.956	1.956	0.090
4	3.881	3.883	3.886	3.879	3.893	3.888	0.131

表5：重复性试验特征图谱相对峰面积

峰号	S1	S2	S3	S4	S5	S6	RSD(％)
								1(S)	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	0.000
2	1.598	1.601	1.576	1.634	1.612	1.627	1.301
								3	0.519	0.542	0.521	0.551	0.506	0.533	3.161
4	0.272	0.273	0.266	0.272	0.271	0.276	1.234

精密度试验：取同批样品约1.0g，按5.1色谱条件进行测定，连续进样6针测定，峰形、峰数基本一致，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度的评价，相对保留时间及保留时间的RSD均在合格范围内(详见表6、表7以及图8)，表明该方法精密度良好。

表6：精密度试验特征图谱相对保留时间

峰号	S1	S2	S3	S4	S5	S6	RSD(％)
								1(S)	1	1	1	1	1	1	0.000
2	1.446	1.445	1.447	1.444	1.446	1.448	0.098
								3	1.954	1.953	1.957	1.951	1.954	1.956	0.109
4	3.881	3.876	3.882	3.885	3.884	3.891	0.128

表7：精密度试验特征图谱相对峰面积

峰号	S1	S2	S3	S4	S5	S6	RSD(％)
								1(S)	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	0.000
2	1.598	1.733	1.730	1.696	1.756	1.832	4.454
								3	0.519	0.540	0.516	0.546	0.526	0.544	2.466
4	0.272	0.288	0.283	0.268	0.281	0.280	2.655

稳定性试验：取同批样品约1.0g，按5.1色谱条件进行测定，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定，特征图谱的峰形、峰数基本稳定，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度评价,相对保留时间及保留时间的RSD均在合格范围内(详见表8、表9及图9)，表明供试品溶液在24小时内较稳定。

表8：稳定性试验特征图谱相对保留时间

峰号	0	2h	4h	8h	12h	24h	RSD(％)
								1(S)	1	1	1	1	1	1	0.000
2	1.446	1.445	1.447	1.444	1.446	1.445	0.073
								3	1.954	1.953	1.957	1.951	1.954	1.953	0.101
4	3.881	3.876	3.882	3.885	3.884	3.882	0.081

表9：稳定性试验特征图谱相对峰面积

峰号	S1	S2	S3	S4	S5	S6	RSD(％)
								1(S)	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	0.000
2	1.598	1.733	1.730	1.696	1.756	1.732	3.335
								3	0.519	0.540	0.516	0.546	0.526	0.529	2.202
4	0.272	0.288	0.283	0.268	0.281	0.281	2.670

5.4标准汤剂特征图谱表征分析

标准汤剂特征图谱测定

按照5.3拟定的特征图谱分析方法，测定15批蒸黄精标准汤剂及其制备使用的15批次中药饮片特征图谱，结果显示，标准汤剂及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有4个共有峰，并应与对照药材参照物溶液色谱中的4个特征峰保留时间相对应，其中与尿苷对照品参照物相对应的峰为峰1，共有峰特征图谱详见图10至图15。

特征色谱图相对保留时间评价

采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对选定的4个共有特征峰进行相似度的评价，结果显示，15批蒸黄精饮片标准汤剂特征色谱图相似度均在0.9以上，表明本标准汤剂质量相对稳定。以尿苷参照物峰相对应的峰(1)为S峰，计算共有峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间及范围详见表10。

表10：15批标准汤剂共有峰相对保留时间

综上所述，采用高效液相色谱法建立的标准汤剂特征图谱测定方法，按照《中国药典》2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了精密度、重复性、稳定性验证，均符合要求。采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”对15批标准汤剂样品的特征图谱进行相似度评价，标定了4个共有特征峰，其中峰1为尿苷。以尿苷参照物相对应的峰为S峰，计算另3个特征峰相对保留时间，以15批次样品峰相对保留时间均值拟定为规定值分别为：1.47(峰2)、1.91(峰3)、3.84(峰4)，考虑试验操作、仪器、试剂等多因素误差，其相对保留时间允许范围拟定为±10％。

6.含量测定

6.1试验方法

尿苷是蒸黄精中重要成分之一，通过多次试验摸索及查找文献，选择尿苷作为含量指标成分。

试验方法如上述特征图谱测试中的液相色谱法。

色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSelect HSS T3，250mmx4.6mm，5um)；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按表11规定进行梯度洗脱；流速：0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：261nm。

表11：

制备对照品溶液：取尿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成含尿苷的浓度为10ug/ml的溶液，作为对照品溶液。

制备供试品溶液：取蒸黄精标准汤剂样品约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

6.2方法学考察

提取方法的考察：分别以样品回流、超声的提取方法制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，样品超声(功率250W,频率25KHZ)处理含量更高，RSD为23.73％(详见表12)，故选择样品提取方式为超声处理。

表12：不同提取方法对比

提取时间的考察：分别以不同的提取时间制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，样品以不同时间超声处理的差别微小(详见表13)，故选择样品超声处理时间为30分钟。

表13：不同提取时间尿苷含量对比

提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，提取溶剂为水时，尿苷含量最高，RSD为42.08％(详见表14)，故确定以水为提取溶剂。

表14：不同提取溶剂尿苷含量对比

样品量考察：分别取不同样品量制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，不同取样量差别不大，样品量为1.0g的峰型更好(详见表15)，故确定供试品样品量为1.0g。

表15：不同取样量尿苷含量对比

6.2含量测定方法学验证

重复性试验：取同批次标准汤剂样品约1.0g，共6份，按上述6.1试验方法进行测定，测得样品中尿苷含量平均值为0.288mg/g，RSD值为1.53％，试验表明该方法重现性良好(详见表16)。

表16：

精密度试验：取6.1所示供试品溶液，连续进样6针，照上述6.1试验方法测定其峰面积，计算样品中尿苷峰面积的RSD值为1.45％，表明仪器精密度良好(详见表17)。

表17：

稳定性试验：取一批标准汤剂样品约1.0g，按上述9.1试验方法，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，测定其峰面积，计算其峰面积的RSD值为1.27％，试验表明供试品溶液在24小时内较稳定(详见表18)。

表18：

线性范围试验：取尿苷对照品溶液，浓度为10.6ug/ml，分别以1ul、5ul、10ul、15ul、20ul、25ul进样量，按6.1项下色谱条件进行测定。

以尿苷峰面积为纵坐标，以尿苷进样质量为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，其回归方程为：Y＝3364.2415x-948.4720，R²＝1.0000，可知尿苷在1.06ug/ml～21.2ug/ml范围内与其峰面积具有良好的线性关系(详见表19和图16)。

表19：尿苷线性关系考察结果

供试液	进样质量	峰面积
			线性1	10.6	35327
线性2	31.8	105340
			线性3	53	177745
线性4	106	355185
			线性5	159	533778
线性6	212	712626

加样回收率试验：精密称取样品(尿苷含量为0.288mg/g)0.5g，共6份，在6份样品中各加入已知浓度的尿苷对照品溶液(0.106mg/ml)1ml，按6.1项下方法制备供试品溶液，并按6.1项下色谱条件进行测定，计算尿苷平均加样回收率为100.96％，RSD为0.30％(详见表20)。

表20：尿苷加样回收率试验结果

6.3标准汤剂及中药材含量测定

黄精药材经产地初加工成段片，经炮制后加工成蒸黄精饮片，其尿苷含量会发生变化。

按照上述拟定的含量分析方法，测定15批蒸黄精标准汤剂及其制备使用的15批次蒸黄精饮片及药材的尿苷含量，结果详见表21～23。

表21：15批黄精药材尿苷测定结果

表22：15批蒸黄精饮片尿苷测定结果

表23：15批蒸黄精标准汤剂尿苷测定结果

尿苷含量转移率：依据标准汤剂方法学研究确定的检测方法，对15批标准汤剂及其制备使用的中药饮片测定结果，计算尿苷含量转移率，掌握其量质传递情况，为制定物料内控标准及其表征参数允许范围提供依据。蒸黄精饮片标准汤剂由蒸黄精饮片加水煎煮2次，滤液浓缩、冷冻干燥制得。其尿苷含量转移率详见表24。

表24：15批蒸黄精饮片标准汤剂尿苷含量转移率

由以上数据可知，蒸黄精(多花黄精)饮片依方案煎煮制得蒸黄精(多花黄精)饮片标准汤剂，本品尿苷平均转移率为66.26％，测得转移率范围为42.59％-87.53％，SD为12.0。依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，尿苷含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为46.38-86.14％；按照﹣3SD，﹢2SD来算，为30.26～90.26％。故拟定本标准汤剂的尿苷含量转移率范围为：30.26～90.26％。结果表明，15批次标准汤剂中尿苷转移率均在﹣3SD,﹢2SD允许范围之内。

本品尿苷平均含量为0.27mg/g，测得含量范围为0.18～0.33mg/g，SD为0.05；按均值±3SD计算，尿苷含量允许范围为0.12～0.42mg/g。故拟定本标准汤剂的尿苷含量范围为：0.10mg/g～0.50mg/g。结果表明，15批次标准汤剂中尿苷及其转移率均在允许范围之内，可为蒸黄精(多花黄精)配方颗粒质量研究提供参考依据。

本发明提供的蒸黄精标准汤剂质量检测方法，通过对蒸黄精(多花黄精)标准汤剂的干浸膏出膏率、性状、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及尿苷含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定蒸黄精标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立蒸黄精汤剂可行的质量标准，实现蒸黄精标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。

所述领域技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种蒸黄精标准汤剂质量检测方法，其特征在于，包括如下检测方法，

采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以黄精对照药材制成的溶液作为参照物溶液b，以尿苷对照品制成的溶液作为对照品溶液b，以蒸黄精标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液b，分别精密吸取参照物溶液b、对照品溶液b和供试品溶液b，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述色谱柱规格为：Waters XSelect HSS T3，250mm*4.6mm，5um；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；

表a梯度洗脱程序

流速：0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：261nm；

所述煎煮法包括：取蒸黄精饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得蒸黄精标准汤剂干膏粉；

所述照薄层色谱法包括如下步骤：

（1）制备供试品溶液a：取蒸黄精标准汤剂样品1g，加70%乙醇20mL，加热回流1小时，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10mL溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，制得供试品溶液a；

（2）制备对照药材溶液a：取黄精对照药材1g，加70%乙醇20mL，加热回流1小时，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10mL溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，制得对照药材溶液a；

（3）进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液a与对照药材溶液a各10uL；展开剂：体积比为5：2：0.1的石油醚-乙酸乙酯-甲酸溶液，所述石油醚沸程规格为60~90℃；显色剂：5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

2.如权利要求1所述的蒸黄精标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述热浸法以无水乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。

3.如权利要求1所述的蒸黄精标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：

（1）制备参照物溶液b：取黄精对照药材1g，精密加水10mL，超声处理1小时，过滤，取续滤液，作为参照物溶液b；

（2）制备对照品溶液b：取尿苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为10ug/mL的对照品溶液b；

（3）制备供试品溶液b：取蒸黄精标准汤剂样品1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密称定加入水25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液b。

4. 如权利要求1所述的蒸黄精标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定尿苷含量包括：进行液相色谱仪分析，以尿苷对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以蒸黄精标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述色谱柱规格为：Waters XSelect HSS T3，250mm*4.6mm，5um；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按规定进行梯度洗脱；流速：0.8mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：261nm。

5.如权利要求4所述的蒸黄精标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定尿苷含量还包括如下步骤：

（1）制备对照品溶液：取尿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成含尿苷的浓度为10ug/ml的溶液，作为对照品溶液c；

（2）制备供试品溶液：取蒸黄精标准汤剂样品约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液c。