CN113791163B - 一种郁李仁标准汤剂质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种郁李仁标准汤剂质量检测方法，包括通过对郁李仁标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及苦杏仁苷含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含苦杏仁苷为31.5‑90.5mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及苦杏仁苷含量测定均采用液相色谱法测定。本发明的郁李仁标准汤剂质量检测方法，通过多方面测量，来评定郁李仁标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立郁李仁汤剂可行的质量标准，实现郁李仁标准汤剂质量的有效控制。

Description

一种郁李仁标准汤剂质量检测方法

技术领域

本发明涉及中药材质量控制技术领域，具体涉及一种郁李仁标准汤剂质量检测方法。

背景技术

郁李仁为蔷薇科植物欧李(酸丁、小李红)、郁李(赤李子)或长柄扁桃的干燥成熟种子，主产于东三省、内蒙古、河北、山东等地，别名小李仁、大李仁，小李仁呈卵形，表面黄白色或浅棕色，一端尖，另端钝圆，大李仁表面黄棕色。郁李仁性平，味辛、苦、甘，用于津枯肠燥、食积气滞、腹胀便秘、水肿、脚气、小便不利，具有润燥滑肠，下气行滞，利水消肿的功效。郁李仁中的主要活性成分包括黄酮类、脂肪酸类、氨基酸类、氰类及矿物元素。

现代药物需要具有稳定均一、安全和有效的三大特性，中成药在这几个方面难以比拟西药，因此，更需要采用多种手段进行检测，保证检测结果的可靠性和稳定性。目前，郁李仁的检测方法主要为液相色谱法，然而仅采用现有的液相色谱法来检测郁李仁汤剂是有缺陷的，无法达到中药配方颗粒质量控制要求。因此，建立一种用于药材质量控制的郁李仁标准汤剂质量检测方法是十分必要的。

发明内容

本发明的目的就是要解决现有技术的不足，提供一种郁李仁标准汤剂质量检测方法，以更好的控制郁李仁汤剂的质量，表征药物质量，提高药物稳定性。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种郁李仁标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，

通过对郁李仁标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及苦杏仁苷含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含苦杏仁苷为31.5-90.5mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及苦杏仁苷含量测定均采用液相色谱法测定；

采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以郁李仁对照药材制成的溶液作为参照物溶液，以苦杏仁苷对照品制成的溶液作为对照品溶液，以郁李仁标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：GL Sciences TP5-5328(250mm×4.6mm，5um)；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；

表a梯度洗脱程序

流速：0.8mL/min；柱温：20℃；进样量：10μL；检测波长：254nm。

在其中一实施例中，所述煎煮法包括：取郁李仁饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得郁李仁标准汤剂干膏粉。

在其中一实施例中，所述照薄层色谱法包括如下步骤：

(1)制备供试品溶液a：取郁李仁标准汤剂样品，加甲醇经过超声处理，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，制得浓度为1mg/mL的供试品溶液a；

(2)制备对照品溶液a：取苦杏仁苷对照品，加甲醇溶解，制得浓度为4mg/mL的供试品溶液a；

(3)进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液a与对照品溶液a各10uL；展开剂：体积比为15:40:22:10的三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、水在5～15℃放置12小时的下层溶液；显色剂：磷钼酸硫酸溶液，所述磷钼酸硫酸溶液通过硫钼酸2g加水20mL溶解后再缓缓加入30mL硫酸混匀的方式制得，105℃加热至斑点显色清晰。

在其中一实施例中，所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。

在其中一实施例中，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：

(1)制备参照物溶液b：取郁李仁对照药材1g，加50mL水煎煮1小时，过滤，滤液蒸干，加25mL的70％甲醇，超声处理20min，放冷，过滤，取滤液作为参照物溶液b；

(2)制备对照品溶液b：取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为0.3mg/mL的对照品溶液b；

(3)制备供试品溶液b：取郁李仁标准汤剂样品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取滤液作为供试品溶液b。

在其中一实施例中，采用液相色谱法测定苦杏仁苷含量包括：进行液相色谱仪分析，以苦杏仁苷对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以郁李仁标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：GL SciencesTP5-5328(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按规定进行梯度洗脱；流速：0.8mL/min；柱温：20℃；进样量：10μL；检测波长：254nm。

在其中一实施例中，采用液相色谱法测定苦杏仁苷含量还包括如下步骤：

(1)制备对照品溶液：取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成含苦杏仁苷的浓度为0.35mg/ml的溶液，作为对照品溶液c；

(2)制备供试品溶液：取郁李仁(欧李)标准汤剂样品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液c。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)通过对郁李仁标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及苦杏仁苷含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定郁李仁标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立郁李仁汤剂可行的质量标准，实现郁李仁标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。

(2)郁李仁饮片依煎煮法制得郁李仁饮片标准汤剂，苦杏仁苷平均含量为60.98mg/g，测得含量范围为47.80～79.67mg/g，SD(标准差)为9.85，按均值±3SD计算，苦杏仁苷含量允许范围为31.43～90.53mg/g，故拟定本标准汤剂的苦杏仁苷含量范围为：31.5mg/g～90.5mg/g；苦杏仁苷平均转移率为33.32％，转移率范围为22.92％-41.90％，SD为6.41，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，苦杏仁苷含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为23.32-43.31％，按照±3SD来算，为14.08～52.56％，故拟定本标准汤剂的苦杏仁苷含量转移率范围为：14.08～52.56％，结果表明，本发明多个批次标准汤剂中苦杏仁苷含量及其转移率均在允许范围之内，因此本发明可为郁李仁(欧李)配方颗粒质量标准研究提供参考依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一实施例中郁李仁饮片15批次标准汤剂薄层图谱；其中，A组图谱为阴性对照样品薄层图谱，S组为苦杏仁苷对照品溶液薄层图谱，1～15组为郁李仁饮片15批次标准汤剂薄层图谱。

图2为本发明提取方法考察中不同提取方法对比图；其中，S1为对照品溶液特征图谱；S2为超声提取供试品溶液特征图谱；S3为回流提取供试品溶液特征图谱。

图3为本发明提取时间考察中不同提取时间对比图；其中，S1为对照品溶液特征图谱；S2为超声提取20min供试品溶液特征图谱；S3为超声提取30min供试品溶液特征图谱；S4为超声提取40min供试品溶液特征图谱。

图4为本发明提取溶剂考察中不同提取溶剂对比图；其中，S1为对照品溶液特征图谱；S2为70％甲醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S3为70％乙醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S4为甲醇提取制备的供试品溶液特征图谱。

图5为本发明样品取用量考察中不同样品量对比图；其中，S1为样品取用量0.2g的供试品溶液特征图谱；S2为样品取用量0.4g的供试品溶液特征图谱；S3为样品取用量0.8g的供试品溶液特征图谱；S4为样品取用量1.0g的供试品溶液特征图谱；S5为样品取用量1.2g的供试品溶液特征图谱；S6为对照品溶液特征图谱。

图6为本发明专属性考察中空白溶剂对比图；其中，S1为对照品溶液特征图谱；S2为空白溶剂(70％甲醇)特征图谱；S3为供试品溶液特征图谱。

图7为本发明精密度试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为精密度1下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为精密度2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为精密度3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为精密度4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为精密度5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为精密度6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。

图8为本发明重复性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为重复性1下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为重复性2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为重复性3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为重复性4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为重复性5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为重复性6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。

图9为本发明稳定性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为于0h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为于3h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为于6h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为于9h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为于12h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为于24h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。

图10为本发明标准汤剂特征图谱测定中苦杏仁苷对照品图谱。

图11为本发明标准汤剂特征图谱测定中郁李仁(欧李)对照药材图谱。

图12为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批郁李仁(欧李)中药材叠加图谱；其中，S1(5)-S15(5)表示从Y210701—Y210715这15批郁李仁(欧李)中药材叠加图谱。

图13为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批郁李仁(欧李)中药材共有峰图谱。

图14为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批郁李仁(欧李)标准汤剂叠加图谱；其中，S1(6)-S15(6)表示从T210701—T210715这15批郁李仁(欧李)标准汤剂叠加图谱。

图15为本发明标准汤剂特征图谱测定中15批郁李仁(欧李)标准汤剂拟合图。

图16为本发明线性范围试验中苦杏仁苷对照品不同浓度线性曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

本发明提供一种郁李仁标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，通过对郁李仁标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及苦杏仁苷含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含苦杏仁苷为31.5-90.5mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及苦杏仁苷含量测定均采用液相色谱法测定。

本实施例中：

制备郁李仁标准汤剂：参照《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药管理局[2009]3号)中的煎煮法，取15批次郁李仁(欧李)饮片加水至没过药材约4-5cm，浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得15批次郁李仁标准汤剂干膏粉。

1.性状考察

根据15批次郁李仁标准汤剂的实物性状特征，描述为淡黄棕色至黄棕色的粉末，气微，味微苦。

2.干浸膏出膏率测试

取上述15批次郁李仁标准汤剂干膏粉，以干膏粉计算干浸膏得率(见表1)，并计算平均得率为14.25％，按照标准汤剂出膏率允许范围(均值70％～130％)计算，出膏率允许范围为9.98％～18.52％，故拟定本品出膏率为10％～18％。

表1：出膏率

上述结果表明，15批次标准汤剂干浸膏出膏率为10.34％～15.60％，均符合拟定限度范围10％～18％。

3.薄层鉴别

本发明的产品为单味饮片郁李仁(欧李)的干燥提取物，参考《中国药典》郁李仁(欧李)“薄层鉴别”项下的方法，用苦杏仁苷对照品作对照，调整显色剂，建立了本品薄层鉴别方法，经15批次样品试验，供试品斑点基本清晰，故拟定为本品鉴别项。试验方法和结果如下：

试验方法：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验

供试品溶液制备：取本品1g，加甲醇10ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液制备：取苦杏仁苷对照品2.5g，加甲醇溶解，制得浓度为4mg/mL的对照品溶液。

薄层色谱条件：薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液与对照品溶液各10uL；展开剂：三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、水(体积比为15:40:22:10)在5～15℃放置12小时的下层溶液；显色剂：磷钼酸硫酸溶液(磷钼酸硫酸溶液通过硫钼酸2g加水20mL溶解后再缓缓加入30mL硫酸混匀的方式制得)，在105℃加热至斑点显色清晰。

结果：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。详见图1所示本实施例中，15批次标准汤剂TLC图谱。

4.浸出物测定

取15批次标准汤剂，以乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定，结果详见表2。

表2：浸出物测定结果

上述结果表明，15批次标准汤剂浸出物均值为41.39％，参考标准限度允许范围(均值70％～130％)的下限，拟定本品醇溶性浸出物不得少于29.0％，15批次标准汤剂测定结果均符合拟定限度要求。

5.特征图谱测试

5.1液相色谱法

色谱条件：色谱柱：GL Sciences TP5-5328(250mm×4.6mm，5um)；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱；流速：0.8mL/min；柱温：20℃；进样量：10μL；检测波长：254nm。

表3：

(1)制备参照物溶液：取郁李仁对照药材1g，加50mL水煎煮1小时，过滤，滤液蒸干，加70％甲醇25mL，超声处理20min，放冷，过滤，取滤液作为参照物溶液；

(2)制备对照品溶液：取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为0.3mg/mL的对照品溶液；

(3)制备供试品溶液：取郁李仁(欧李)标准汤剂样品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取滤液作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

5.2方法学考察

提取方法的考察：分别以不同的提取方法制备供试品溶液，包括超声30min提取、回流30min提取，按上述5.1试验方法进行测定。结果表明，如图2所示，超声30min与回流30min的主峰个数一致，样品超声30min的主峰总峰面积相对较大，故选择样品提取方式为操作简便的超声处理30分钟。

提取时间的考察：分别以不同的超声提取时间制备供试品溶液，按上述5.1试验方法进行测定。结果表明，不同提取时间主峰个数一致，如图3所示，主峰总峰面积无明显差异，故确定提取时间为较短时间即可。

提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按5.1试验方法进行测定。结果表明，主峰个数一致，含量无差异，如图4所示，提取溶剂为70％甲醇时，主峰总峰面积稍大，故确定以70％甲醇为提取溶剂。

样品取用量考察：分别取不同样品量制备供试品溶液，按5.1试验方法进行测定。结果表明，不同取样量，主峰个数一致，如图5所示，供试品取样量为0.2g时，含量相对较高(详见表4)，故确定供试品称样量为0.2g。

表4：不同样品取用量考察结果

综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取郁李仁(欧李)标准汤剂样品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声20min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

5.3特征图谱分析方法验证

专属性考察：取供试品用溶剂70％甲醇10μL，按5.1色谱条件进行测定，试验表明，如图6所示，空白溶剂无干扰。

精密度试验：取同批样品约0.2g，按5.1色谱条件进行测定，连续进样6针测定，峰形、峰数基本一致，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的6个共有特征峰进行相似度的评价，相似度均＞0.9，相对峰面积及相对保留时间RSD小于3％(详见表5、表6以及图7)，表明仪器精密度良好。

表5：精密度试验特征图谱相对峰面积

峰号	S1	S2	S3	S4	S5	S6	RSD％
								1	0.351	0.351	0.353	0.348	0.348	0.345	0.88
2	0.329	0.313	0.330	0.314	0.310	0.311	2.85
								3	0.341	0.358	0.357	0.351	0.347	0.347	1.89
4	0.076	0.073	0.073	0.072	0.072	0.072	2.18
								5	0.503	0.501	0.500	0.491	0.494	0.493	1.01
6(S)	1	1	1	1	1	1	0.00

表6：精密度试验特征图谱相对保留时间

峰号	S1	S2	S3	S4	S5	S6	RSD％
								1	0.317	0.317	0.317	0.317	0.316	0.316	0.16
2	0.465	0.465	0.465	0.465	0.465	0.465	0.00
								3	0.53	0.53	0.53	0.53	0.53	0.53	0.00
4	0.764	0.764	0.763	0.764	0.764	0.764	0.05
								5	0.967	0.966	0.966	0.966	0.967	0.966	0.05
6(S)	1	1	1	1	1	1	0.00

重复性试验：取同批样品约0.2g，共6份，按5.1色谱条件进行测定，结果显示，6份供试品特征图谱中有6个共有峰，采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的6个共有特征峰进行相似度的评价，相似度均＞0.9，相对峰面积及相对保留时间RSD小于3％(详见表6、表7及图8)，表明该方法重现性良好。

表6：重复性试验特征图谱相对峰面积

峰号	S1	S2	S3	S4	S5	S6	RSD％
								1	0.345	0.341	0.359	0.348	0.346	0.340	2.03
2	0.311	0.314	0.322	0.316	0.311	0.309	1.45
								3	0.347	0.358	0.352	0.354	0.363	0.355	1.55
4	0.072	0.074	0.075	0.074	0.075	0.072	1.66
								5	0.493	0.507	0.499	0.495	0.496	0.494	1.10
6(s)	1	1	1	1	1	1	0.00

表7：重复性试验特征图谱相对保留时间

峰号	S1	S2	S3	S4	S5	S6	RSD％
								1	0.316	0.316	0.317	0.317	0.317	0.317	0.16
2	0.465	0.464	0.465	0.465	0.465	0.465	0.09
								3	0.53	0.53	0.53	0.53	0.53	0.53	0.00
4	0.764	0.763	0.764	0.763	0.764	0.763	0.07
								5	0.966	0.967	0.966	0.966	0.966	0.966	0.04
6(s)	1	1	1	1	1	1	0.00

稳定性试验：取同批样品约0.2g，按5.1色谱条件进行测定，分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h进样测定，特征图谱的峰形、峰数基本稳定，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的6个共有特征峰进行相似度的评价，相似度均＞0.9，相对峰面积及相对保留时间RSD小于3％(详见表8、表9及图9)，表明供试品溶液在24小时内较稳定。

表8：稳定性试验特征图谱相对峰面积

峰号	0	3h	6h	9h	12h	24h	RSD％
								1	0.351	0.353	0.348	0.345	0.345	0.349	0.90
2	0.335	0.330	0.316	0.312	0.315	0.328	2.69
								3	0.345	0.357	0.347	0.355	0.347	0.364	1.94
4	0.076	0.073	0.072	0.072	0.074	0.076	2.27
								5	0.503	0.500	0.494	0.492	0.502	0.509	1.15
6(s)	1	1	1	1	1	1	0.00

表9：稳定性试验特征图谱相对保留时间

峰号	0	3h	6h	9h	12h	24h	RSD％
								1	0.317	0.317	0.316	0.316	0.317	0.293	2.82
2	0.465	0.465	0.465	0.465	0.465	0.457	0.64
								3	0.53	0.53	0.53	0.53	0.53	0.533	0.21
4	0.764	0.763	0.764	0.763	0.764	0.762	0.10
								5	0.967	0.966	0.967	0.966	0.966	0.966	0.05
6(s)	1	1	1	1	1	1	0.00

5.4标准汤剂特征图谱表征分析

标准汤剂特征图谱测定

按照5.3拟定的特征图谱分析方法，测定15批郁李仁(欧李)饮片标准汤剂及其制备使用的15批次药材特征图谱，结果显示，标准汤剂及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有6个共有峰，并应与对照药材参照物溶液色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中与苦杏仁苷对照品溶液相对应的峰为峰6，共有峰特征图谱详见图10至图15。

特征色谱图相似度评价

采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对选定的6个共有特征峰进行相似度的评价，结果表明本标准汤剂质量相对稳定。以苦杏仁苷对照品峰相对应的峰(6)为S峰，计算共有峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间及范围详见表10。

表10：15批标准汤剂共有峰相对保留时间

综上所述，采用高效液相色谱法建立的标准汤剂特征图谱测定方法，按照《中国药典》2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了精密度、重复性、稳定性验证，均符合要求。采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”对15批标准汤剂样品的特征图谱进行相似度评价，标定了6个共有特征峰，其中峰6为苦杏仁苷。以苦杏仁苷对照品相对应的峰为S峰，计算另5个特征峰相对保留时间，以15批次样品峰相对保留时间均值拟定为规定值分别为：0.32(峰1)、0.47(峰2)、0.54(峰3)、0.77(峰4)、0.97(峰5)，考虑试验操作、仪器、试剂等多因素误差，其相对保留时间允许范围拟定为±10％。

6.含量测定

6.1试验方法

郁李仁含有的化学成分主要包括黄酮类、脂肪酸类、氨基酸类、氰类及矿物元素。其中苦杏仁苷是郁李仁中重要成分之一，也是郁李仁的主要有效成分之一，通常将其作为郁李仁的指标性成分用于郁李仁的鉴别及含量测定，具有润燥滑肠、抗炎、镇痛、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗惊厥、降血压、抗动脉粥样硬化、镇咳、治疗便秘、水肿、呼吸道等疾病的药理作用。2020版《中国药典》中郁李仁含量测定项下含量测定成分为苦杏仁苷，故郁李仁配方颗粒选择苦杏仁苷作为含测成分。

试验方法如上述特征图谱测试中的液相色谱法。

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，GL Sciences TP5-5328色谱柱(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，水溶液为流动相B，按表11中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为20℃；流速为每分钟0.8mL。

表11：

制备对照品溶液：取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成含苦杏仁苷的浓度为0.35mg/ml的溶液，作为对照品溶液。

制备供试品溶液：取郁李仁(欧李)标准汤剂样品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声(功率250W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

6.2方法学考察

提取方法的考察：分别以样品回流30min、超声(功率250W,频率40KHZ)30min的提取方法制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，超声处理方式得到的苦杏仁苷含量相对较高(详见表12)，故选择超声处理为提取方式。

表12：不同提取方法苦杏仁苷含量对比

提取时间的考察：分别以不同的提取时间制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，样品超声(功率250W,频率40KHZ)提取20min与40min时，苦杏仁苷含量相对偏高，但两者无明显差异(详见表13)，故选择提取时间为20分钟。

表13：不同提取时间苦杏仁苷含量对比

提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，提取溶剂为70％甲醇时，苦杏仁苷含量最高(详见表14)，故确定以70％甲醇为提取溶剂。

表14：不同提取溶剂苦杏仁苷含量对比

样品量考察：分别取不同样品量制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，供试品取样量为0.2g时，苦杏仁苷含量相对较高(详见表15)，故确定供试品称样量为0.2g。

表15：不同样品量苦杏仁苷含量对比

6.2含量测定方法学验证

精密度试验：取6.1所示供试品溶液制备方式制备的郁李仁(欧李)饮片标准汤剂样品溶液，连续进样6针，照上述6.1试验方法测定其峰面积，计算样品中苦杏仁苷峰面积的RSD值为1.36％，表明仪器精密度良好(详见表16)。

表16：

重复性试验：取同批次标准汤剂样品约0.2g，共6份，按上述6.1试验方法进行测定，计算样品中苦杏仁苷含量的平均值为66.0mg/g，RSD值为1.62％，试验表明该方法重现性良好(详见表17)。

表17：

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稳定性试验：取一批标准汤剂样品约0.2g，按上述9.1试验方法，分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h进样，测定其峰面积，计算其峰面积的RSD值为0.30％，试验表明供试品溶液在24小时内较稳定(详见表18)。

表18：

线性范围试验：取苦杏仁苷对照品溶液，浓度为0.9718mg/ml，分别取4ml至5ml容量瓶，浓度：0.7774mg/ml；取0.7774mg/ml的溶液3.75ml至5ml容量瓶，浓度：0.5831mg/ml；取0.5831mg/ml的溶液3.2ml至5ml容量瓶，浓度：0.3732mg/ml；取0.3732mg/ml的溶液2.5ml至5ml容量瓶，浓度：0.1833mg/ml；同样方法得到，浓度：0.0933mg/ml。按6.1项下色谱条件进行测定。

以苦杏仁苷峰面积为纵坐标，供试液浓度为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，其回归方程为：

Y＝400035x-8727.4，R2＝0.9994，

可知，苦杏仁苷在0.0933mg/ml～0.9718mg/ml范围内与其峰面积具有良好的线性关系(详见表19与图16)。

表19：苦杏仁苷线性关系考察结果

加样回收率试验：精密称取样品0.05g，共6份，在6份样品中加入已知浓度的苦杏仁苷对照品溶液(0.9718mg/ml)3.2ml，按6.1项下方法制备供试品溶液，并按6.1项下色谱条件进行测定，计算苦杏仁苷平均加样回收率为99.05％，RSD为0.76％(详见表20)。

表20：苦杏仁苷加样回收率试验结果

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6.3标准汤剂及中药材含量测定

郁李仁(欧李)药材经产地初加工成约1cm段片，经净制后加工成郁李仁(欧李)饮片，净制过程中未经水洗、烘烤，只通过筛选，其苦杏仁苷含量不会发生变化，因此郁李仁(欧李)饮片特征色谱图及苦杏仁苷含量参考其药材数据。

按照上述拟定的含量分析方法，测定15批郁李仁(欧李)标准汤剂及其制备使用的15批次中药饮片苦杏仁苷含量，结果详见表21和表22。

表21：15批郁李仁(欧李)中药饮片苦杏仁苷测定结果

表22：15批郁李仁(欧李)标准汤剂苦杏仁苷测定结果

苦杏仁苷含量转移率：依据标准汤剂方法学研究确定的检测方法，对15批标准汤剂及其制备使用的中药饮片测定结果，计算苦杏仁苷含量转移率，掌握其量质传递情况，为制定物料内控标准及其表征参数允许范围提供依据。郁李仁(欧李)饮片标准汤剂由郁李仁(欧李)饮片加水煎煮2次，滤液浓缩、冷冻干燥制得。其苦杏仁苷含量转移率详见表23。

表23：15批郁李仁(欧李)饮片标准汤剂苦杏仁苷含量转移率

由以上数据可知，郁李仁(欧李)饮片依方案煎煮制得郁李仁(欧李)饮片标准汤剂，本品苦杏仁苷平均转移率为33.32％，测得转移率范围为22.92％-41.90％，SD为6.41。依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，苦杏仁苷含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为23.32-43.31％；按照±3SD来算，为14.08～52.56％。故拟定本标准汤剂的苦杏仁苷含量转移率范围为：14.08～52.56％。结果表明，15批次标准汤剂中苦杏仁苷转移率均在±3SD允许范围之内。

本品苦杏仁苷平均含量为60.98mg/g，测得含量范围为47.80～79.67mg/g，SD为9.85；按均值±3SD计算，苦杏仁苷含量允许范围为31.43～90.53mg/g。故拟定本标准汤剂的苦杏仁苷含量范围为：31.5mg/g～90.5mg/g。结果表明，15批次标准汤剂中苦杏仁苷含量及其转移率均在允许范围之内，可为郁李仁(欧李)配方颗粒质量研究提供参考依据。

本发明提供的郁李仁标准汤剂质量检测方法，通过对郁李仁标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及苦杏仁苷含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定郁李仁标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立郁李仁汤剂可行的质量标准，实现郁李仁标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。郁李仁饮片依煎煮法制得郁李仁饮片标准汤剂，苦杏仁苷平均含量为60.98mg/g，测得含量范围为47.80～79.67mg/g，SD(标准差)为9.85，按均值±3SD计算，苦杏仁苷含量允许范围为31.43～90.53mg/g，故拟定本标准汤剂的苦杏仁苷含量范围为：31.5mg/g～90.5mg/g；苦杏仁苷平均转移率为33.32％，转移率范围为22.92％-41.90％，SD为6.41，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，苦杏仁苷含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为23.32-43.31％，按照±3SD来算，为14.08～52.56％，故拟定本标准汤剂的苦杏仁苷含量转移率范围为：14.08～52.56％，实验结果表明，本发明多个批次标准汤剂中苦杏仁苷含量及其转移率均在允许范围之内，因此本发明可为郁李仁(欧李)配方颗粒质量标准研究提供参考依据。

所述领域技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种郁李仁标准汤剂质量检测方法，其特征在于，包括如下检测方法，

通过对郁李仁标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及苦杏仁苷含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含苦杏仁苷为31.5-90.5mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及苦杏仁苷含量测定均采用液相色谱法测定；

采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以郁李仁对照药材制成的溶液作为参照物溶液，以苦杏仁苷对照品制成的溶液作为对照品溶液，以郁李仁标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：GL Sciences TP5-5328，柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5um；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；

表a梯度洗脱程序

流速：0.8mL/min；柱温：20℃；进样量：10μL；检测波长：254nm；

所述煎煮法包括：取郁李仁饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得郁李仁标准汤剂干膏粉；

所述照薄层色谱法包括如下步骤：

（1）制备供试品溶液a：取郁李仁标准汤剂样品，加甲醇经过超声处理，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，制得浓度为1mg/mL的供试品溶液a；

（2）制备对照品溶液a：取苦杏仁苷对照品，加甲醇溶解，制得浓度为4mg/mL的对照品溶液a；

（3）进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液a与对照品溶液a各10uL；展开剂：体积比为15:40:22:10的三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、水在5~15℃放置12小时的下层溶液；显色剂：磷钼酸硫酸溶液，所述磷钼酸硫酸溶液通过硫钼酸2g加水20mL溶解后再缓缓加入30mL硫酸混匀的方式制得，105℃加热至斑点显色清晰。

2.如权利要求1所述的郁李仁标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。

3.如权利要求1所述的郁李仁标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：

（1）制备参照物溶液b：取郁李仁对照药材1g，加50mL水煎煮1小时，过滤，滤液蒸干，加25mL的70%甲醇，超声处理20min，放冷，过滤，取滤液作为参照物溶液b；

（2）制备对照品溶液b：取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为0.3mg/mL的对照品溶液b；

（3）制备供试品溶液b：取郁李仁标准汤剂样品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的70%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理20min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取滤液作为供试品溶液b。

4. 如权利要求1所述的郁李仁标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定苦杏仁苷含量包括：进行液相色谱仪分析，以苦杏仁苷对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以郁李仁标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：GL Sciences TP5-5328，柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5um；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按规定进行梯度洗脱；流速：0.8mL/min；柱温：20℃；进样量：10μL；检测波长：254nm。

5.如权利要求4所述的郁李仁标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定苦杏仁苷含量还包括如下步骤：

（1）制备对照品溶液：取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成含苦杏仁苷的浓度为0.35mg/ml的溶液，作为对照品溶液c；

（2）制备供试品溶液：取欧李种仁制成的郁李仁标准汤剂样品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声20min，所述超声为功率250W、频率40kHz超声，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液c。