CN112763617A - 不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建方法及其应用，属于中药分析及质量鉴别、标准控制技术领域。基于超高效液相色谱仪，以D‑苦杏仁苷为对照品，进行不同产地的炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建，并应用于不同产地的炒桃仁标准汤剂中D‑苦杏仁苷含量测定，以及进行炒桃仁标准汤剂的产地判定；本方法稳定、可靠，精密度高，重复性好，可为其配方颗粒的质量控制研究提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药的特征图谱构建方法及其应用，尤其涉及不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建方法及其应用，属于中药分析及质量鉴别、标准控制技术领域。
背景技术
桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica(L.)Batsch的干燥成熟种子，具有活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘的功效。用于经闭痛经，癥瘕痞块，肺痈肠痈，跌扑损伤，肠燥便秘，咳嗽气喘。其中，炒桃仁为桃仁的炮制品，炮制方法为取燀桃仁，照《中国药典》2020年版第四部清炒法(通则0213)炒至黄色，用时捣碎。桃仁在我国大部分地区均有栽培，尤以四川三台、宜宾，云南昭通、文山，陕西延安、渭南，山东安丘、泰安，北京密云、怀柔，河北承德，山西黎城、壶关，甘肃陇南、甘南，贵州毕节、安顺，河南洛阳、开封、新乡等地最为适宜。桃仁的化学成分主要有脂肪酸类、苷类、甾醇及其糖苷、黄酮及其糖苷、蛋白质和氨基酸、挥发油、其他成分等多种类型的化合物。现代研究表明，其主要有效成分为苦杏仁苷，具有抗肿瘤、抗溃疡、调节免疫和抗脑缺血等作用。目前，桃仁及其炮制品的质量控制主要为含量测定及指纹图谱，为更好的保证配方颗粒质量，建立高效、快速、准确、全面的标准汤剂质控方法，可为配方颗粒的质量控制提供参考。
桃仁中活性成分主要为苦杏仁苷，药典中以苦杏仁苷的含量作为其药材的质量评价指标之一。根据2016年国家药典委员会发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》，中药标准汤剂系遵循中医药理论，采用合格饮片按照临床汤剂煎煮方法规范化煎煮，固液分离，经适当浓缩制得或经适宜方法干燥制得，作为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物。标准汤剂系由不少于15批原料分别制得，计算相关平均值，并规定其变化可接受的范围。中药配方颗粒的所有药学研究均须与标准汤剂进行对比，以保证与标准汤剂质量的一致性。
发明内容
本发明旨在解决现有技术问题，而提出了不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建方法及其应用。在本技术方案中，基于超高效液相色谱仪，以D-苦杏仁苷为对照品，进行不同产地的炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建，并应用于不同产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量测定，以及进行炒桃仁标准汤剂的产地判定；本方法稳定、可靠，精密度高，重复性好，可为其配方颗粒的质量控制研究提供依据。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建方法，包括如下步骤：
A.对照品溶液的制备：取D-苦杏仁苷对照品，加甲醇，制成每1mL含0.4mg的溶液，即得；
B.供试品溶液的制备：取不同产地炒桃仁标准汤剂0.2g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
C.建立：取所得对照品溶液和所得供试品溶液，注入至超高效液相色谱仪，测定，建立不同产地炒桃仁标准汤剂的标准特征图谱；
超高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：Agilent ZORBAX Epilse Plus-C18，柱长为50mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm；
色谱柱柱温：20～25℃；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B；
流动相流速：0.4mL/min；
进样量：1μL；
检测波长：210nm；
流动相按下表进行梯度洗脱，具体为：
0～10min，流动相A为3％，流动相B为97％；
10～12min，流动相A为3→4％，流动相B为97→96％；
12～25min，流动相A为4％，流动相B为96％。
进一步的，所述D-苦杏仁苷对照品的进样量为88.4117～1326.1755μg。
进一步的，所述标准特征图谱包括六个特征峰，其中，峰5为L-苦杏仁苷，峰6为D-苦杏仁苷，以峰6为参照峰S峰；各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.220、峰2为0.253、峰3为0.416、峰4为0.642、峰5为0.939，相对保留时间在规定值的±5％之内。
不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱在测定不同产地炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量中的应用，进行炒桃仁标准汤剂的产地判定。
进一步的，在测定不同产地炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量中，包括：
S1.标准曲线的绘制：按进样量呈梯度分布计，取至少三份对照品溶液，加甲醇补足体积为1μL，注入至超高效液相色谱仪中测定，记录对应的色谱图和峰面积；
以对照品进样量为横坐标X(μg)，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算得回归方程；
S2.结果计算：取待测供试品溶液，注入至超高效液相色谱仪中测定，将所得峰面积带入所得标准曲线的性回归方程中，即可得出炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷的含量；
进一步的，所述炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷在不同产地含量为4.41～9.84％。
进一步的，在不同产地炒桃仁标准汤剂中：
四川产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为7.35～9.84％；
云南产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为6.88～7.98％；
陕西产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为7.17～8.14％；
甘肃产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为4.41～8.69％；
河南产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为8.84％。
其中，四川阿坝藏族羌族自治州产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量最高，甘肃镇原县产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量最低，镇原县产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量亦有含量较高批次，说明同一产地仍有差异。
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
在本发明中，基于超高效液相色谱仪，以D-苦杏仁苷为对照品，进行不同产地的炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建，并应用于不同产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量测定，以及进行炒桃仁标准汤剂的产地判定；本方法稳定、可靠，精密度高，重复性好，可为其配方颗粒的质量控制研究提供依据。
附图说明
图1为实施例4中炒桃仁标准汤剂对照特征图谱(其中，峰5：L-苦杏仁苷；峰6：D-苦杏仁苷(S))；
图2为实施例4中十六批炒桃仁标准汤剂特征图谱；
图3为实施例5的线性关系考察中苦杏仁苷标准曲线图；
图4为实施例5的流动相考察结果色谱图；
图5为实施例5的延迟性考察结果色谱图；
图6为实施例5的波长中炒桃仁标准汤剂3D色谱图；
图7为实施例5的波长中炒桃仁标准汤剂各波长比较图；
图8为实施例5的流速考察结果色谱图；
图9为实施例5的柱温考察结果色谱图；
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一、在以下实施例中，涉及的仪器包括：
超高效液相色谱仪：安捷伦1290型超高效液相色谱仪(美国Aglient公司)，
色谱柱：Agilent ZORBAX Epilse Plus-C18(柱长为50mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)，
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)，
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)，
超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)，分体式陶瓷煎药壶(4L，美味世家)，
干燥机：LGJ-100F型真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)。
二、在以下实施例中，涉及的试剂包括：
甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、磷酸(色谱纯)、水(超纯水)，其余试剂均为分析纯；
三、在以下实施例中，涉及的对照品包括：
D-苦杏仁苷(中国食品药品检定研究院，批号：110820-201802，纯度88.2％)
四、在以下实施例中，涉及的样品信息(炒桃仁饮片批号、产地及收集时间)如下表1：
表1炒桃仁饮片产地信息
| 编号 | 饮片批号 | 具体产地 | 收集时间 |
| 1 | CTR180201 | 河南省辉县市 | 2018年2月 |
| 2 | CTR180206 | 甘肃省镇原县 | 2018年2月 |
| 3 | CTR180202 | 甘肃省镇原县 | 2018年2月 |
| 4 | CTR180205 | 甘肃省镇原县 | 2018年2月 |
| 5 | CTR180203 | 甘肃省镇原县 | 2018年2月 |
| 6 | CTR180204 | 甘肃省平凉市 | 2018年2月 |
| 7 | CTR180207 | 四川省阿坝藏族羌族自治州 | 2018年2月 |
| 8 | CTR180208 | 四川省阿坝藏族羌族自治州 | 2018年2月 |
| 9 | CTR180211 | 云南省昭通市 | 2018年2月 |
| 10 | CTR180212 | 云南省昭通市 | 2018年2月 |
| 11 | CTR180213 | 云南省文山市 | 2018年2月 |
| 12 | CTR180209 | 云南省昭通市 | 2018年2月 |
| 13 | CTR180214 | 四川九寨沟 | 2018年2月 |
| 14 | CTR180215 | 陕西延安 | 2018年2月 |
| 15 | CTR180216 | 陕西延安 | 2018年2月 |
| 16 | CTR180210 | 陕西延安 | 2018年2月 |
其中，炒桃仁标准汤剂制备方法为：取炒桃仁饮片100g，加水煎煮二次，一煎加10倍水，沸水投料，再次煮沸后保持微沸煎煮30min，200目筛网过滤，立即冷却至室温；二煎加8倍水，沸水投料，煮沸，保持微沸煎煮20min，200目筛网过滤，合并水煎液，立即冷却至室温，冷冻干燥，分装，即得，收膏率如下表2。
表2炒桃仁标准汤剂收膏率汇总
| 批次 | 饮片批号 | 投料量(g) | 标准汤剂批号 | 标准汤剂收量(g) | 收膏率(％) |
| 1 | CTR180201 | 100.42 | CTRBT180201 | 8.59 | 8.6 |
| 2 | CTR180202 | 100.69 | CTRBT180202 | 12.18 | 12.1 |
| 3 | CTR180203 | 100.07 | CTRBT180203 | 16.61 | 15.5 |
| 4 | CTR180204 | 100.20 | CTRBT180204 | 10.37 | 10.4 |
| 5 | CTR180205 | 100.65 | CTRBT180205 | 10.58 | 10.5 |
| 6 | CTR180206 | 100.08 | CTRBT180206 | 10.12 | 10.1 |
| 7 | CTR180207 | 100.18 | CTRBT180207 | 10.94 | 10.9 |
| 8 | CTR180208 | 100.55 | CTRBT180208 | 12.17 | 12.1 |
| 9 | CTR180209 | 100.38 | CTRBT180209 | 10.18 | 10.2 |
| 10 | CTR180210 | 100.15 | CTRBT180210 | 11.32 | 11.3 |
| 11 | CTR180211 | 100.01 | CTRBT180211 | 9.58 | 9.5 |
| 12 | CTR180212 | 100.44 | CTRBT180212 | 11.52 | 11.5 |
| 13 | CTR180213 | 100.45 | CTRBT180213 | 10.03 | 10.0 |
| 14 | CTR180214 | 100.47 | CTRBT180214 | 11.53 | 11.5 |
| 15 | CTR180215 | 100.09 | CTRBT180215 | 9.94 | 9.9 |
| 16 | CTR180216 | 100.41 | CTRBT180216 | 9.26 | 9.3 |
可得：十六批炒桃仁标准汤剂收膏率范围为8.6～12.1％，平均值为10.8％，平均值的70～130％的范围为7.6～14.0％。
实施例1
不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建方法，包括如下步骤：
A.对照品溶液的制备：取D-苦杏仁苷对照品，加甲醇，制成每1mL含0.4mg的溶液，即得；
B.供试品溶液的制备：取不同产地炒桃仁标准汤剂0.2g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
C.建立：取所得对照品溶液和所得供试品溶液，注入至超高效液相色谱仪，测定，建立不同产地炒桃仁标准汤剂的标准特征图谱；
超高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：Agilent ZORBAX Epilse Plus-C18，柱长为50mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm；
色谱柱柱温：20～25℃；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B；
流动相流速：0.4mL/min；
进样量：1μL；
检测波长：210nm；
流动相按下表进行梯度洗脱，具体为：
0～10min，流动相A为3％，流动相B为97％；
10～12min，流动相A为3→4％，流动相B为97→96％；
12～25min，流动相A为4％，流动相B为96％。
其中，D-苦杏仁苷对照品的进样量为88.4117～1326.1755μg。
其中，标准特征图谱包括六个特征峰，其中，峰5为L-苦杏仁苷，峰6为D-苦杏仁苷，以峰6为参照峰S峰；各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.220、峰2为0.253、峰3为0.416、峰4为0.642、峰5为0.939，相对保留时间在规定值的±5％之内。
实施例2
基于实施例1，本实施例中提出：不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱在测定不同产地炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量中的应用，进行炒桃仁标准汤剂的产地判定。
进一步的，在测定不同产地炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量中，包括：
S1.标准曲线的绘制：按进样量呈梯度分布计，取至少三份对照品溶液，加甲醇补足体积为1μL，注入至超高效液相色谱仪中测定，记录对应的色谱图和峰面积；
以对照品进样量为横坐标X(μg)，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算得回归方程；
S2.结果计算：取待测供试品溶液，注入至超高效液相色谱仪中测定，将所得峰面积带入所得标准曲线的性回归方程中，即可得出炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷的含量；
其中，炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷在不同产地含量为4.41～9.84％。
其中，在不同产地炒桃仁标准汤剂中：
四川产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为7.35～9.84％；
云南产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为6.88～7.98％；
陕西产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为7.17～8.14％；
甘肃产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为4.41～8.69％；
河南产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为8.84％。
其中，四川阿坝藏族羌族自治州产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量最高，甘肃镇原县产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量最低，镇原县产地的炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量亦有含量较高批次，说明同一产地仍有差异。
实施例3
基于实施例1，本实施例就特征图谱建立中的精密度、稳定性、重复性、中间精密度进行考察，以对本发明中的技术方案作进一步的说明。
一、精密度考察
取炒桃仁标准汤剂(批号：CTRBT180201)，以实施例1中的方法制备供试品溶液，连续进样六次，色谱条件同实施例1，记录色谱图。以D-苦杏仁苷色谱峰为参照峰(S峰)，计算各峰的保留时间，结果如下表3。
表3精密度考察-特征峰保留时间
结果表明：六个共有峰的保留时间的RSD值为0.08～0.20％，表明该仪器精密度良好。
二、稳定性考察
取所得同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h时测定，色谱条件同实施例1，记录色谱图。以D-苦杏仁苷色谱峰为参照峰(S峰)，计算各峰的相对保留时间，结果如下表4。
表4稳定性考察—特征峰保留时间
结果表明：六个共有峰的相对保留时间的RSD值为0.06～0.35％，说明供试品溶液在24h内稳定性良好。
三、重复性考察
取炒桃仁标准汤剂(批号：CTRBT180201)，六份，以实施例1中的方法制备供试品溶液，色谱条件同实施例1，记录色谱图。以D-苦杏仁苷色谱峰为参照峰(S峰)，计算各峰的相对保留时间，结果如下表5。
表5重复性考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明：六个共有峰的相对保留时间的RSD值为0.03～0.27％，说明方法重复性良好。
四、中间精密度考察
取炒桃仁标准汤剂(批号：CTRBT180201)，以实施例1中的方法制备供试品溶液，色谱条件同实施例1，分别对不同人员时间、不同色谱柱(Agilent ZORBAX Eclipse plus-C1850×2.1mm 1.8μm、ACQUITY UPLC HSS T3 C18 2.1×50mm 1.8μm、Agilent SB-C18 RRHD2.1×50mm 1.8μm)、不同仪器(WATERS H-CLASS、安捷伦1290、岛津LC-30AD超高效液相)进行考察，以D-苦杏仁苷色谱峰为参照峰(S峰)，计算各峰的相对保留时间，结果如下表6-7。
表6不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间比值
表7色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间
结果表明：六个共有峰的相对保留时间的RSD值分别为0.07～0.87％、0.09～5.26％、0.00～7.19％，说明方法中间精密度良好。
实施例4
基于实施例1，本实施例取十六批炒桃仁标准汤剂供试品，进行测定，建议特征图谱，以对本发明中的技术方案作进一步的说明。
取十六批炒桃仁标准汤剂供试品，分别制备为供试品溶液，进样测定，将所得数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)”，以D-苦杏仁苷色谱峰为参照峰(S峰)，建立十六批炒桃仁标准汤剂的特征图谱，经系统自动匹配，生成对照图谱(如图1-2所示)，共标定六个共有峰。
通过与D-苦杏仁苷对照品比对，确定峰5为L-苦杏仁苷，峰6为D-苦杏仁苷。以炒桃仁标准汤剂(批号：CTRBT180201)色谱图为参照，采用中位数法，时间窗为0.1，进行相似度计算，结果如下表8。
十六批炒桃仁标准汤剂供试品与对照图谱的相似度为0.984～0.999，表明不同产地炒桃仁标准汤剂特征图谱相似度较高，具有较好的一致性，质量相对较稳定，建立的六个共有峰及对照指纹图谱可反映其指纹特征，具有鉴别评价意义。
表8十六准汤剂特征图谱相似度计算结果
| 批号 | 与对照指纹图谱相似度 | 批号 | 与对照指纹图谱相似度 |
| CTR180201 | 0.998 | CTR180209 | 0.998 |
| CTR180202 | 0.990 | CTR180210 | 0.985 |
| CTR180203 | 0.997 | CTR180211 | 0.994 |
| CTR180204 | 0.991 | CTR180212 | 0.994 |
| CTR180205 | 0.998 | CTR180213 | 0.997 |
| CTR180206 | 0.997 | CTR180214 | 0.984 |
| CTR180207 | 0.991 | CTR180215 | 0.984 |
| CTR180208 | 0.994 | CTR180216 | 0.987 |
实施例5
基于实施例1-2，本实施例就不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱在测定不同产地炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量中的应用，进行线性关系、精密度、稳定性、重复性、加样回收率等进行考察，以对本发明申请中的技术做进一步的说明。
一、线性关系考察
取D-苦杏仁苷对照品溶液，在色谱条件进行测定，记录色谱图，以对照品溶液进样量为横坐标(X，μg)，峰面积为纵坐标(Y)，如表9所示，绘制标准曲线(如图3所示)，得到线性回归方程。
表9苦杏仁苷标准曲线分析结果
线性回归方程为Y＝2.4423X+1.8635，r＝1.000，进样量为88.4117～1326.1755μg时，线性关系良好。
二、精密度考察
取D-苦杏仁苷对照品溶液，连续进样六次，记录D-苦杏仁苷的峰面积，计算RSD值，如下表10所示。
表10精密度考察结果
结果表明：D-苦杏仁苷的峰面积RSD值为0.20％，表明仪器精密度良好。
三、稳定性考察
取同一供试品溶液(批号：CTRBT180201)，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定，如下表11所示。
表11稳定性实验结果
结果表明：D-苦杏仁苷在24h内峰面积RSD值为0.43％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
四、重复性
取炒桃仁标准汤剂(批号：CTRBT180201)，六份，分别以实施例1中方法制备供试品溶液，测定，如下表12所示。
表12重复性实验结果
结果表明：计算得到的D-苦杏仁苷含量RSD值为2.46％，表明本方法重复性良好。
五、加样回收率
称取已知成分含量的炒桃仁标准汤剂供试品粉末(CTRBT180201)，六份，每份0.1g，精密称定，加入已知量的苦杏仁苷对照品，测定，结果如下表13所示，计算加样回收率。
表13苦杏仁苷加样回收实验结果
结果表明：平均回收率为95.57％，RSD值为1.60％，表明本方法准确度良好。
六、样品测定
对十六批炒桃仁标准汤剂进行含量测定，并计算其转移率(转移率＝标准汤剂中D-苦杏仁苷量/饮片中D-苦杏仁苷量×100％)，结果如下表14。
表14十六批标准汤剂含量测定结果
| 序号 | 标准汤剂批号 | 饮片批号 | 饮片含量(％) | 含量(％) | 转移率(％) |
| 1 | CTRBT080201 | CTR180201 | 2.6 | 8.84 | 27.85 |
| 2 | CTRBT080202 | CTR180202 | 2.19 | 4.58 | 24.57 |
| 3 | CTRBT080203 | CTR180203 | 2.15 | 4.41 | 33.00 |
| 4 | CTRBT080204 | CTR180204 | 2.26 | 8.69 | 39.21 |
| 5 | CTRBT080205 | CTR180205 | 2.79 | 8.4 | 30.63 |
| 6 | CTRBT080206 | CTR180206 | 2.43 | 6.63 | 27.10 |
| 7 | CTRBT080207 | CTR180207 | 3.6 | 9.84 | 28.98 |
| 8 | CTRBT080208 | CTR180208 | 3.67 | 9.14 | 29.48 |
| 9 | CTRBT080209 | CTR180209 | 2.8 | 7.11 | 25.37 |
| 10 | CTRBT080210 | CTR180210 | 2.39 | 7.16 | 33.06 |
| 11 | CTRBT080211 | CTR180211 | 1.93 | 6.88 | 33.18 |
| 12 | CTRBT080212 | CTR180212 | 2.44 | 7.98 | 36.84 |
| 13 | CTRBT080213 | CTR180213 | 2.02 | 7.35 | 35.98 |
| 14 | CTRBT080214 | CTR180214 | 2.49 | 7.17 | 32.21 |
| 15 | CTRBT080215 | CTR180215 | 2.23 | 8.14 | 34.77 |
| 16 | CTRBT080216 | CTR180216 | 2.79 | 7.66 | 25.43 |
结果表明：炒桃仁标准汤剂苦杏仁苷含量测定范围为4.41～9.84％，平均含量为7.50％，本品平均值的70～130％限量为含苦杏仁苷5.25～9.75％。十六批炒桃仁标准汤剂转移率为24.57～39.21％，平均值为31.10％，转移率均值的70～130％的范围为21.77～40.43％。
七、关于产地的代表性
共收集十六批桃仁药材，产自河南省辉县、甘肃省镇原县、甘肃省平凉市、四川阿坝藏族羌族自治州、四川九寨沟、云南省昭通市、云南省文山市、陕西延安等地，覆盖了多个产区，具有较强的代表性，能充分反映目前市场上的桃仁药材情况，保证了标准汤剂质量的全面性。
八、关于样品提取方法
涉及对供试品的提取方式、提取溶剂、提取时间及溶媒用量进行了考察，以特征图谱峰形、分离度、共有峰的峰面积、D-苦杏仁苷含量为评价指标，考察了甲醇、50％甲醇、70％甲醇等提取溶剂，超声提取与回流提取的提取方式，20min、30min、40min提取时间，10mL、25mL、50mL提取溶媒用量。
1.提取方式考察
将供试品(批号：CTRBT180201)研细，取四份，各0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，两份超声提取、两份回流提取，提取时间均为30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。各取1μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下苦杏仁苷含量，结果见表15。
表15不同提取方式分析结果
结果表明，回流提取和超声提取所得苦杏仁苷含量分别为4.120％和4.084％，二者无显著差异，最终以操作简捷的超声法为提取方式。
2.提取溶剂考察
将供试品(批号：CTRBT180201)研细，取十二份，各0.2g，精密称定，分别加甲醇25mL、50％甲醇25mL、70％甲醇25mL，超声提取30min，放冷，以相应溶剂补足减失重量，滤过，取续滤液1μL注入色谱仪，分析计算不同溶剂提取苦杏仁苷含量，结果见表16。
表16不同提取溶剂的分析结果
结果表明，三种溶剂的提取效率相差不大，综合考虑，以70％甲醇作为其提取溶剂。
3.提取时间考察
将供试品(批号：CTRBT180201)研细，取六份，各0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，分别超声提取20min、30min、40min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。各取1μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下苦杏仁苷含量，结果见表17。
表17不同提取时间的分析结果
结果表明，提取时间对苦杏仁苷的含量基本无差别，综合考虑，选择提取时间为30min
4.溶剂量考察
将供试品(批号：CTRBT180201)研细，取六份，各0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10mL、25mL、50mL，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。各取1μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下苦杏仁苷含量，结果见表18。
表18不同溶剂量的分析结果
结果表明，供试品溶剂量为10mL时，含量最高，但考虑样品处理及重复性问题等，综合选择25mL较为合适。
综上所述，供试品的制备方法为：取本品细粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。
结果表明：以70％甲醇25mL为提取溶剂，超声提取30min时，色谱峰最佳。
九、关于色谱条件
比较不同柱温(20℃、25℃、30℃)、不同流速(0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min)、不同流动相(甲醇-0.1％磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸)条件下的特征图谱。
1.流动相选择
流动相分别考察了甲醇-0.1％磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸，结果见图4。
最终确定以将乙腈-0.1％磷酸梯度洗脱，作为炒桃仁标准汤剂成品特征图谱测定方法的流动相。
2.延迟性试验
在相应流动相及洗脱条件下，对供试品溶液进行延迟洗脱，结果见图5。
可知：在25min后，没有色谱峰信息，故洗脱时间定为25min。
3.波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在210nm、240nm、260nm、280nm、300nm、323nm、345nm、360nm波长下的色谱图，结果见图6-7。
结果表明：在检测波长为208-214nm时色谱峰信息量均合适，色谱图基线平稳，综合考虑《中国药典》2015版苦杏仁苷含量测定最佳波长，故，检测波长应为210nm。
4.流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min时进行了考察，结果如下表19及图8。
表19流速考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明，流速分别为0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min时，各特征峰的相对保留时间RSD为0.00～8.62％；在流速为0.4mL/min时，色谱图峰形较好，分离度适中，故，流速确定为0.4mL/min。
5.柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、25℃、30℃时进行考察，结果如下表20及图9。
表20柱温考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明，在柱温为20～25℃时，色谱图峰形最为对称，分离度较好，故，最终将柱温确定为20～25℃。
综上所述：柱温为20～25℃、流速为0.4mL/min时，样品分离度较高、峰形对称，能够满足分析要求。
不同产地的炒桃仁标准汤剂在特征图谱建立的六个共有峰相似度较高，具有较好的一致性，质量相对较稳定，表明不同产地制备的炒桃仁标准汤剂成分差异较小，该特征图谱方法具有参考意义。
四川产地含量范围为7.35～9.84％，云南产地含量范围为6.88～7.98％，陕西产地含量范围为7.17～8.14％，甘肃产地含量范围为4.41～8.69％，河南产地含量范围为8.84％。其中四川阿坝藏族羌族自治州含量最高，甘肃镇原县含量最低，但镇原县亦有含量较高批次，说明同一产地仍有差异。但从转移率分析，各地范围为24.57～39.21％，数据范围集中，说明煎煮达到最佳效果，能保证临床用药的有效性和安全性。
本研究制备了炒桃仁标准汤剂十六批炒桃仁标准汤剂样品，并以苦杏仁苷为质控指标，结合特征图谱对标准汤剂的化学成分进行整体把控，得到相关数据结果，该研究可以为炒桃仁配方颗粒质量标准的研究建立提供参考依据，保证成品与标准汤剂的质量一致性。
Claims (9)
1.不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
A．对照品溶液的制备：取D-苦杏仁苷对照品，加甲醇，制成每1mL含0.4mg的溶液，即得；
B．供试品溶液的制备：取不同产地炒桃仁标准汤剂，加入70%甲醇，超声提取，滤过，取续滤液，即得；
C．建立：取所得对照品溶液和所得供试品溶液，注入至超高效液相色谱仪，测定，建立不同产地炒桃仁标准汤剂的标准特征图谱；
超高效液相色谱仪内色谱条件满足：
色谱柱：Agilent ZORBAX Epilse Plus-C18，柱长为50mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm；
色谱柱柱温：20～25℃；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B；
流动相流速：0.4mL/min；
进样量：1μL；
检测波长：210nm；
流动相按下表进行梯度洗脱，具体为：
0～10min，流动相A为3%，流动相B为97%；
10～12min，流动相A为3→4%，流动相B为97→96%；
12～25min，流动相A为4%，流动相B为96%。
2.根据权利要求1所述的不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建方法，其特征在于，在步骤B的超声处理中，功率600W，频率40kHz。
3.根据权利要求1所述的不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建方法，其特征在于，在步骤B中，取不同产地炒桃仁标准汤剂0.2g，分别置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
4.根据权利要求1所述的不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建方法，其特征在于，所述D-苦杏仁苷对照品的进样量为88.4117～1326.1755μg。
5.根据权利要求1所述的不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱构建方法，其特征在于，所述标准特征图谱包括六个特征峰，其中，峰5为L-苦杏仁苷，峰6为D-苦杏仁苷，以峰6为参照峰S峰；各特征峰的相对保留时间分别为：峰1为0.220、峰2为0.253、峰3为0.416、峰4为0.642、峰5为0.939，相对保留时间在规定值的±5%之内。
6.不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱在测定不同产地炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量中的应用，并进行炒桃仁标准汤剂的产地判定。
7.根据权利要求6所述的不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱的应用，其特征在于，在测定不同产地炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量中，包括：
S1．标准曲线的绘制：按进样量呈梯度分布计，取至少三份对照品溶液，加甲醇补足体积为1μL，注入至超高效液相色谱仪中测定，记录对应的色谱图和峰面积；
以对照品进样量为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算得回归方程；
S2．结果计算：取待测供试品溶液，注入至超高效液相色谱仪中测定，将所得峰面积带入所得标准曲线的性回归方程中，即可得出炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷的含量。
8.根据权利要求6所述的不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱的应用，其特征在于，所述炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷在不同产地的含量为4.41～9.84%。
9.根据权利要求6所述的不同产地炒桃仁标准汤剂的特征图谱的应用，其特征在于，所述炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为7.35～9.84%时，判定炒桃仁标准汤剂来源于四川产地；
所述炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为6.88～7.98%时，判定炒桃仁标准汤剂来源于云南产地；
所述炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为7.17～8.14%时，判定炒桃仁标准汤剂来源于陕西产地；
所述炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为4.41～8.69%时，判定炒桃仁标准汤剂来源于甘肃产地；
所述炒桃仁标准汤剂中D-苦杏仁苷含量为8.84%时，判定炒桃仁标准汤剂来源于河南产地。
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