CN114577939B - 一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱构建方法 - Google Patents

一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇‑0.1％磷酸为流动相进行梯度洗脱，以迷迭香酸为参照物，建立了大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。

Description

一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图 谱构建方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法。
背景技术
大肺筋草，为伞形科植物薄片变豆菜Saniculalamelligera Hance和天蓝变豆菜Sanicula coerulescens Franch.的全草。薄片变豆菜分布于安徽、浙江、台湾、江西、湖北、广东、广西、四川、贵州等地；天蓝变豆菜分布于四川、贵州、云南等地。具有散寒止咳，行血痛经，祛风发表，化痰止咳，活血调经之功效。常用于感冒，咳嗽，哮喘，月经不调，经闭，痛经，疮肿，跌打肿痛，外伤出血。
鉴于有多数国内专利将肺筋草作为抗肺癌、肺炎及治疗各种咳嗽药物的主方成分之一，其开发应用前景较大。本发明旨在构建一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的HPLC特征图谱方法，为鉴别大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒提供更多更为科学的技术手段。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，本发明构建的大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱方法稳定，可靠，可以对大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。
本发明提供了一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：
A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸，梯度洗脱。
优选的，还包括制备参照物溶液：取迷迭香酸，采用甲醇溶解，得到参照物溶液；所述迷迭香酸的浓度为50μg/mL；
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行定性。
优选的，所述梯度洗脱具体为：
0～15min，A相：5％～15％、B相：95％～85％；
15～20min，A相：15％～20％、B相：85％～80％；
20～45min，A相：20％～40％、B相：80％～60％；
45～65min，A相：40％～65％、B相：60％～35％。
优选的，所述色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent Eclipse Plus C18(250×4.6mm，5μm)、Kromasil 100-5-C18(250×4.6mm，5μm)；柱温30℃；
所述流动相流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；进样量为5～10μL，理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于5000。
优选的，所述供试品原料为大肺筋草药材、饮片，大肺筋草标准汤剂或大肺筋草配方颗粒中的一种或几种；
所述提取的溶剂为70％甲醇；所述提取为超声提取；所述超声提取的时间为20～30min；所述超声的功率为600W，频率40kHz；所述供试品原料的质量g和溶剂的体积mL的比为(0.1～0.5)：(20～25)。
优选的，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对大肺筋草药材、饮片HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由10个特征峰构成的大肺筋草药材、饮片HPLC标准特征图谱，其中迷迭香酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.292(峰1)、0.326(峰2)、0.391(峰3)、0.400(峰4)、0.557(峰5)、0.588(峰6)、0.756(峰7)、0.900(峰8)、1.089(峰10)。
优选的，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对大肺筋草标准汤剂HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由10个特征峰构成的大肺筋草标准汤剂HPLC标准特征图谱，其中迷迭香酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.304(峰1)、0.339(峰2)、0.400(峰3)、0.415(峰4)、0.562(峰5)、0.598(峰6)、0.760(峰7)、0.900(峰8)、1.081(峰10)。
优选的，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对大肺筋草配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由10个特征峰构成的大肺筋草配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中迷迭香酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.304(峰1)、0.338(峰2)、0.400(峰3)、0.414(峰4)、0.562(峰5)、0.598(峰6)、0.760(峰7)、0.900(峰8)、1.081(峰10)。
本发明提供了一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，采用上述技术方案任一项所述的方法进行检测，分析检测结果。
与现有技术相比，本发明提供了一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇-0.1％磷酸为流动相进行梯度洗脱，以迷迭香酸为参照物，建立了大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。
附图说明
图1为大肺筋草标准汤剂特征图谱流动相选择结果图；
图2为大肺筋草标准汤剂的3D图；
图3为大肺筋草标准汤剂不同波长色谱图；
图4为大肺筋草标准汤剂特征图谱流速考察结果；
图5为大肺筋草标准汤剂特征图谱柱温考察结果；
图6为大肺筋草标准汤剂特征图谱延迟性试验色谱图；
图7为大肺筋草标准汤剂特征图谱提取溶剂考察结果图；
图8为大肺筋草标准汤剂特征图谱提取方式考察结果图；
图9为大肺筋草标准汤剂特征图谱提取时间考察结果图；
图10为大肺筋草对照药材色谱图；
图11为色谱图指认结果图；
图12为图12为不同色谱柱考察结果图；
图13为大肺筋草标准汤剂特征图谱；
图14为大肺筋草标准汤剂特征图谱；
图15为大肺筋草标准汤剂对照特征图谱；
图16为大肺筋草药材、饮片特征图谱流动相选择结果；
图17为大肺筋草药材、饮片的3D图；
图18为大肺筋草药材、饮片不同波长色谱图；
图19为大肺筋草药材、饮片特征图谱流速考察结果；
图20为柱温考察结果；
图21为大肺筋草药材、饮片特征图谱延迟性试验色谱图；
图22为大肺筋草药材、饮片特征图谱提取溶剂考察结果图；
图23为大肺筋草药材、饮片特征图谱提取方式考察结果图；
图24为大肺筋草药材、饮片特征图谱提取时间考察结果图；
图25为大肺筋草对照药材色谱图；
图26为色谱图指认结果图；
图27为不同色谱柱考察结果图；
图28为大肺筋草药材特征图谱；
图29为大肺筋草药材特征图谱；
图30为大肺筋草药材对照特征图谱；
图31为大肺筋草配方颗粒特征图谱流动相选择结果；
图32为大肺筋草配方颗粒的3D图；
图33为大肺筋草配方颗粒不同波长色谱图；
图34为大肺筋草配方颗粒特征图谱流速考察结果；
图35为柱温考察结果；
图36为大肺筋草配方颗粒特征图谱延迟性试验色谱图；
图37为大肺筋草配方颗粒特征图谱提取溶剂考察结果图；
图38为大肺筋草配方颗粒特征图谱提取方式考察结果图；
图39为大肺筋草配方颗粒特征图谱提取时间考察结果图；
图40为大肺筋草对照药材色谱图；
图41为色谱图指认结果图；
图42为不同色谱柱考察结果图；
图43为大肺筋草配方颗粒特征图谱；
图44为大肺筋草配方颗粒对照特征图谱；
图45为本发明对比例1的梯度考察结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：
A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸，梯度洗脱。
本发明供试品原料包括但不限于大肺筋草药材、饮片，大肺筋草标准汤剂或大肺筋草配方颗粒中的一种或几种。
本发明提供的一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法首先将取大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒原料，溶剂溶解，提取，得到待测液。所述溶剂优选为70％甲醇。
具体的：
当原料为大肺筋草药材、饮片时，供试品溶液制备具体为：将原料加水煎煮，过滤、蒸干、而后加入70％甲醇，超声处理，放冷，摇匀，滤过，即得。所述原料和水的质量比为0.5g：50mL；
所述超声提取的时间为20～30min；所述超声的功率为600W，频率40kHz；所述供试品原料的质量g和溶剂的体积mL的比优选为(0.1～0.5)：(20～25)；更优选为0.5:25。
当原料为大肺筋草标准汤剂或者大肺筋草配方颗粒时，供试品溶液制备具体为：
将原料加入70％甲醇，超声提取，放冷，摇匀，滤过，即得。
所述超声提取的时间为20～30min；所述超声的功率为600W，频率40kHz；所述供试品原料的质量g和溶剂的体积mL的比优选为(0.1～0.5)：(20～25)；更优选为0.5:25。
本发明人发现，采用70％甲醇作为提取溶剂，色谱峰中峰型和分离度均较好。
本发明上述原料皆可通过本发明的方法进行质量控制和定性定量检测。
本发明还包括制备参照物溶液：取迷迭香酸，采用甲醇溶解，得到参照物溶液。
其中，迷迭香酸为50μg/mL。
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，分别得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行定性测定。
本发明所述流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸，梯度洗脱。
本发明所述梯度洗脱优选具体为：
0～15min，A相：5％～15％、B相：95％～85％；
15～20min，A相：15％～20％、B相：85％～80％；
20～45min，A相：20％～40％、B相：80％～60％；
45～65min，A相：40％～65％、B相：60％～35％。
本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。
本发明所述色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent Eclipse Plus C18(250×4.6mm，5μm)、Kromasil 100-5-C18(250×4.6mm，5μm)；本发明采用色谱柱进行耐用性检测，耐用性良好。
本发明柱温优选为30℃。本发明在上述色谱柱温度下色谱峰峰形较好，分离度适中。
流动相流速优选为1.0mL/min。
本发明发现流速1.0mL/min下各色谱峰分离较好，分离度适中，作为最优选方案。
本发明检测波长优选为280nm。
本发明人发现，在280nm处色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，各峰峰面积较大。
本发明理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于5000。
本发明进样量为5～10μL；优选为10μL。
本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对大肺筋草药材、饮片HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由10个特征峰构成的大肺筋草药材、饮片HPLC标准特征图谱，其中迷迭香酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.292(峰1)、0.326(峰2)、0.391(峰3)、0.400(峰4)、0.557(峰5)、0.588(峰6)、0.756(峰7)、0.900(峰8)、1.089(峰10)。
本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对大肺筋草标准汤剂HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由10个特征峰构成的大肺筋草标准汤剂HPLC标准特征图谱，其中迷迭香酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.304(峰1)、0.339(峰2)、0.400(峰3)、0.415(峰4)、0.562(峰5)、0.598(峰6)、0.760(峰7)、0.900(峰8)、1.081(峰10)。
本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对大肺筋草配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由10个特征峰构成的大肺筋草配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中迷迭香酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：0.304(峰1)、0.338(峰2)、0.400(峰3)、0.414(峰4)、0.562(峰5)、0.598(峰6)、0.760(峰7)、0.900(峰8)、1.081(峰10)。
质量判断标准：取大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒样品，按上述同法操作，得到大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版对大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90。
采用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。
本发明建立的大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒特征图谱以迷迭香酸为参照物，注重各个特征峰的顺序和与药材及中间产品的相关性，能全面评价产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。
本发明提供了一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的鉴别方法，采用上述技术方案所述的方法进行检测，分析检测结果。
本发明采用上述方法对大肺筋草进行鉴别，可以对大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。
本发明对于具体的检测方法上述已经有了清楚的描述，在此不再赘述。
本发明提供了一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％磷酸，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇-0.1％磷酸为流动相进行梯度洗脱，以迷迭香酸为参照物，建立了大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法进行详细描述。
高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪、岛津-20AD型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent EclipsePlus C18(250×4.6mm，5μm)、Kromasil 100-5-C18(250×4.6mm，5μm)
甲醇(色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)、磷酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)、甲醇(分析纯、成都市科隆化学试剂有限公司)、流动相用水为实验室自制超纯水，其余均为实验室自制纯水。
迷迭香酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111871-201706)；
绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110753-202018)；
新绿原酸对照品(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：190124-015)；
异绿原酸对照品(四川维克奇生物技术有限公司，批号：wkq1760705)；
咖啡酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110885--201703)；
大肺筋草对照药材(四川维克奇生物技术有限公司，批号：ycwkq21103006)。
大肺筋草标准汤剂：DFJC-BT-210901、DFJC-BT-210902、DFJC-BT-210903、DFJC-BT-210904、DFJC-BT-210905、DFJC-BT-210906、DFJC-BT-210907、DFJC-BT-210908、DFJC-BT-210909、DFJC-BT-210910、DFJC-BT-210911、DFJC-BT-210912、DFJC-BT-210913、DFJC-BT-210914、DFJC-BT-210915、DFJC-BT-210916、DFJC-BT-210917、DFJC-BT-210918、DFJC-BT-210919、DFJC-BT-210920、DFJC-BT-210921。
大肺筋草药材：010094-1708001、XLS202109284、XLS202109285、XLS202109286、XLS202109287、XLS202109288、XLS202109289、XLS202109290、XLS202109291、XLS202109292、XLS202109293、XLS202109294、XLS202109295、XLS202109296、XLS202109297、XLS202109298、XLS202109299、XLS202109300、XLS202109301、XLS202109302、XLS202109303。
大肺筋草饮片：DFJC-210901、DFJC-210902、DFJC-210903、DFJC-210904、DFJC-210905、DFJC-210906、DFJC-210907、DFJC-210908、DFJC-210909、DFJC-210910、DFJC-210911、DFJC-210912、DFJC-210913、DFJC-210914、DFJC-210915、DFJC-210916、DFJC-210917、DFJC-210918、DFJC-210919、DFJC-210920、DFJC-210921。
大肺筋草配方颗粒：1902061、SY2112001、SY2112002、SY2112003。
实施例1大肺筋草标准汤剂HPLC特征图谱色谱条件筛选
1.1色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；检测波长为240nm，理论板数按迷迭香酸计算应不低于5000。
Figure GDA0004250839300000081
参照物溶液的制备取大肺筋草对照药材约0.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30min，滤过，滤液蒸干，加25ml的70％甲醇，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取迷迭香酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品适量，约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照药材参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
1.2流动相选择
比较甲醇-0.1％冰乙酸、甲醇-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.1％冰乙酸三种混合溶剂对大肺筋草标准汤剂供试品溶液中色谱峰的分离效果，选择较优的组合溶剂作为大肺筋草标准汤剂特征图谱测定的流动相，结果如图1所示，图1为大肺筋草标准汤剂特征图谱流动相选择结果图。
1.3波长选择
在“1.1色谱条件”基础上，利用二极管阵列检测器分别对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在220nm、240nm、280nm波长下的色谱图。如图2和图3，图2为大肺筋草标准汤剂的3D图，图3为大肺筋草标准汤剂不同波长色谱图。
结果表明，在检测波长为280nm时色谱峰信息量较大，故大肺筋草标准汤剂特征图谱方法的检测波长最终确定为280nm。
1.4流速考察
在“1.1色谱条件”基础上，分别考察0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min三种流速对供试品溶液中色谱峰的分离效果，结果见图4。图4为大肺筋草标准汤剂特征图谱流速考察结果。
图4表明：在1.0ml/min的流速下，色谱峰峰型对称，分离度较好，故选择1.0ml/min作为大肺筋草标准汤剂特征图谱的测定流速。
1.5柱温考察
在“1.1色谱条件”基础上，分别考察20℃、30℃、35℃三种柱温对供试品溶液中色谱峰的分离效果，结果见图5，图5为大肺筋草标准汤剂特征图谱柱温考察结果。图5表明：在30℃的柱温下，色谱峰峰型对称，分离度较好，故选择30℃作为大肺筋草标准汤剂特征图谱的测定柱温。
1.6延迟性实验
在“1.1色谱条件”基础上，将分析时间延长至130分钟，观察130分钟后是否有色谱峰，结果见图6，图6为大肺筋草标准汤剂特征图谱延迟性试验色谱图；结果表明，延长65分钟后基本无较大的色谱峰，最终确定大肺筋草标准汤剂特征图谱方法的分析时间为65分钟。
综上所述，大肺筋草标准汤剂特征图谱色谱条件与系统适用性试验拟定为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为280nm，理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于5000。
Figure GDA0004250839300000101
实施例2供试品溶液的制备考察
2.1提取溶剂考察
取大肺筋草标准汤剂(DFJC-BT-210901)0.1g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、水、乙醇各25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“实施例1”结果进样测定，结果见图7。图7为大肺筋草标准汤剂特征图谱提取溶剂考察结果图。结果表明：70％甲醇提取的供试品溶液中色谱峰中峰型和分离度均较好，因此选择70％甲醇作为大肺筋草标准汤剂特征图谱测定中供试品溶液制备的提取溶剂。
2.2提取方式考察
取大肺筋草标准汤剂(DFJC-BT-210901)0.1g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“实施例1”结果进样测定，结果见图8，图8为大肺筋草标准汤剂特征图谱提取方式考察结果图。
从图8中可以看出，回流提取和超声提取的最终效果无显著差异，故选择操作更加简便的超声作为大肺筋草标准汤剂特征图谱测定中供试品溶液制备的提取方式。
2.3提取时间考察
取大肺筋草标准汤剂(DFJC-BT-210901)0.1g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，分别超声(功率600W，频率40kHz)处理20分钟、30分钟、40分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“实施例1”拟定的结果进样测定，结果见图9，图9为大肺筋草标准汤剂特征图谱提取时间考察结果图。
从上图中可以看出，超声提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时，色谱图中峰分离无明显差异，故选择时间较为简短的20分钟作为大肺筋草标准汤剂特征图谱测定中供试品溶液制备的提取时间。
综上所述，大肺筋草标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品约0.1g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例3方法学考察
3.1色谱峰指认
对照品溶液的制备：取迷迭香酸、绿原酸、新绿原酸、异绿原酸、咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50μg的溶液，作为对照品溶液。
对照药材溶液的制备取大肺筋草对照药材约0.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30min，滤过，滤液蒸干，加25ml的70％甲醇，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
供试品溶液的制备：按“实施例2”结果制备大肺筋草标准汤剂供试品溶液。
阴性对照溶液的制备：按“实施例2”结果制备缺大肺筋草标准汤剂的阴性对照溶液。按“实施例1”结果进样测定，结果见图10、11，图10为大肺筋草对照药材色谱图；图11为色谱图指认结果图。
3.2精密度试验
取大肺筋草标准汤剂(DFJC-BT-210901)按实施例2结果制备供试品溶液，按实施例1结果进样测定，连续6次，每次5μl，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果见表1-2。
表1精密度考察-相对保留时间
Figure GDA0004250839300000111
表2精密度考察-相对峰面积
Figure GDA0004250839300000112
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％-0.04％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.14％-2.36％，说明该仪器精密度良好。
3.3重复性考察
取大肺筋草标准汤剂(DFJC-BT-210901)6份，按实施例2结果制备供试品溶液，按“实施例1”结果进样测定。结果见表3、4。
表3重复性考察-相对保留时间
Figure GDA0004250839300000121
表4重复性考察-相对峰面积
Figure GDA0004250839300000122
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％-0.05％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.23％-2.76％，说明该方法重复性良好。
4.4中间精密度考察
取同一供试品(批号：DFJC-BT-210901)由不同人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、Ⅱ)下下按“实施例2”结果制备供试品溶液，并按“实施例1”结果分别在仪器a、b上进样测定，结果见表5、6。
表5中间精密度-相对保留时间
Figure GDA0004250839300000123
注：A人员：汪席敏，B人员：樊帅珂，a：岛津LC～20AD型高效液相色谱仪，b：安捷伦1260型高效液相色谱仪，Ⅰ：2021.11.08，Ⅱ:2021.11.09.
表6中间精密度-相对峰面积
Figure GDA0004250839300000131
注：A人员：汪席敏，B人员：樊帅珂，a：岛津LC～20AD型高效液相色谱仪，b：安捷伦1260型高效液相色谱仪，Ⅰ：20211108，Ⅱ:20211109
由表16、17可知，不同供试品溶液制备人员和不同供试品溶液制备时间下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.06％-0.92％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.32％-1.61％，说明本方法适用性较好。
5.5色谱柱耐用性考察
在以上实验条件基础上，分别对色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent Eclipse Plus C18(250×4.6mm，5μm)、Kromasil 100-5-C18(250×4.6mm，5μm)
进行考察。结果见表7、表8和图12，图12为不同色谱柱考察结果图。
表7色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值
Figure GDA0004250839300000132
表8色谱柱耐用性考察-相对峰面积比值
Figure GDA0004250839300000133
结果表明，用上述表7、8中的3种色谱柱对样品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.41％-7.12％，各特征峰相对峰面积的RSD在1.87％-17.42％，说明本方法对不同色谱柱耐用性较好。
3.6稳定性
按“实施例2”结果制备供试品溶液一份，并按“实施例1”结果，分别于0h，4h，7h，13h，19h，24h时进样测定。结果见表9、10。
表9稳定性考察-相对保留时间
Figure GDA0004250839300000141
表10稳定性考察-相对保留峰面积
Figure GDA0004250839300000142
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％～0.07％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.14％-2.57％，说明供试品溶液的稳定性良好，在24小时内可供检测。
实施例4特征峰的确定及对照图谱的建立
按“实施例2”结果制备21批标准汤剂的供试品溶液，并按“实施例1”结果进样测定分析，计算相对保留时间和相对峰面积比值。结果见图13～图14，表11、12。图13～14为大肺筋草标准汤剂特征图谱，图13(从下到上批号依次为：DFJC-BT-210901、DFJC-BT-210902、DFJC-BT-210903、DFJC-BT-210904、DFJC-BT-210905、DFJC-BT-210906、DFJC-BT-210907、DFJC-BT-210908、DFJC-BT-210909、DFJC-BT-210910)；图14(从下到上批号依次为：DFJC-BT-210911、DFJC-BT-210912、DFJC-BT-210913、DFJC-BT-210914、DFJC-BT-210915、DFJC-BT-210916、DFJC-BT-210917、DFJC-BT-210918、DFJC-BT-210919、DFJC-BT-210920、DFJC-BT-210921)。
表11 21批大肺筋草标准汤剂相对保留时间
Figure GDA0004250839300000143
Figure GDA0004250839300000151
表12 21批大肺筋草标准汤剂相对峰面积
Figure GDA0004250839300000152
Figure GDA0004250839300000161
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出共有峰峰相对较高的原则，共选择了10个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰9作为S峰时，21批次大肺筋草标准汤剂10个特征峰相对保留时间RSD在0.02％～0.07％，均小于10％。
最终规定：供试品特征图谱中应呈现10个特征峰，并应与对照药材参照物中的10个特征峰保留时间相对应，其中与迷迭香酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.304(峰1)、0.339(峰2)、0.400(峰3)、0.415(峰4)、0.562(峰5)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批大肺筋草标准汤剂进行合成，建立了大肺筋草标准汤剂特征图谱的对照图谱。见图15。图15为大肺筋草标准汤剂对照特征图谱；峰3：新绿原酸；峰5：绿原酸；峰6：咖啡酸；峰8：异绿原酸；峰9(S)：迷迭香酸；色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB C18(250×4.6mm,5μm)。
实施例5大肺筋草标准药材、饮片HPLC特征图谱色谱条件筛选
5.1色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；检测波长为240nm，理论板数按迷迭香酸计算应不低于5000。
Figure GDA0004250839300000162
参照物溶液的制备取大肺筋草对照药材约0.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30min，滤过，滤液蒸干，加25ml的70％甲醇，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取迷迭香酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取粉末(过三号筛)，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，加25ml的70％甲醇，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照药材参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.2流动相选择
比较甲醇-0.1％冰乙酸、甲醇-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.1％冰乙酸三种混合溶剂对大肺筋草标准汤剂供试品溶液中色谱峰的分离效果，选择较优的组合溶剂作为大肺筋草药材、饮片特征图谱测定的流动相，结果如图16所示，图16为大肺筋草药材、饮片特征图谱流动相选择结果。
5.3波长选择
在“5.1色谱条件”基础上，利用二极管阵列检测器分别对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在220nm、240nm、280nm波长下的色谱图。如图17和图18，图17为大肺筋草药材、饮片的3D图，图18为大肺筋草药材、饮片不同波长色谱图。
结果表明，在检测波长为280nm时色谱峰信息量较大，故大肺筋草药材、饮片特征图谱方法的检测波长最终确定为280nm。
5.4流速考察
在“5.1色谱条件”基础上，分别考察0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min三种流速对供试品溶液中色谱峰的分离效果，结果见图19。图19为大肺筋草药材、饮片特征图谱流速考察结果。
图19表明：在1.0ml/min的流速下，色谱峰峰型对称，分离度较好，故选择1.0ml/min作为大肺筋草药材、饮片特征图谱的测定流速。
5.5柱温考察
在“5.1色谱条件”基础上，分别考察20℃、30℃、35℃三种柱温对供试品溶液中色谱峰的分离效果，结果见图20，图20为柱温考察结果。图20表明：在30℃的柱温下，色谱峰峰型对称，分离度较好，故选择30℃作为大肺筋草药材、饮片特征图谱的测定柱温。
5.6延迟性实验
在“5.1色谱条件”基础上，将分析时间延长至130分钟，观察130分钟后是否有色谱峰，结果见图21，图21为大肺筋草药材、饮片特征图谱延迟性试验色谱图；结果表明，延长65分钟后基本无较大的色谱峰，最终确定大肺筋草药材、饮片特征图谱方法的分析时间为65分钟。
综上所述，大肺筋草药材、饮片特征图谱色谱条件与系统适用性试验拟定为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为280nm，理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于5000。
Figure GDA0004250839300000181
实施例6供试品溶液的制备考察
6.1提取溶剂考察
取大肺筋草药材(010094-1708001)0.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，分别加入甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、水、乙醇各25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“实施例5”结果进样测定，结果见图22。图22为大肺筋草药材、饮片特征图谱提取溶剂考察结果图。结果表明：70％甲醇提取的供试品溶液中色谱峰中峰型和分离度均较好，因此选择70％甲醇作为大肺筋草药材、饮片特征图谱测定中供试品溶液制备的提取溶剂。
6.2提取方式考察
取大肺筋草药材(010094-1708001)0.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，加入70％甲醇25ml，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)和回流各30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“实施例5”结果进样测定，结果见图23，图23为大肺筋草药材、饮片特征图谱提取方式考察结果图。
从图23中可以看出，回流提取和超声提取的最终效果无显著差异，故选择操作更加简便的超声作为大肺筋草药材、饮片特征图谱测定中供试品溶液制备的提取方式。
6.3提取时间考察
取大肺筋草药材(010094-1708001)0.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，加入70％甲醇25ml，分别超声(功率600W，频率40kHz)处理20分钟、30分钟、40分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“实施例5”拟定的结果进样测定，结果见图24，图24为大肺筋草药材、饮片特征图谱提取时间考察结果图。
从上图中可以看出，超声提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时，色谱图中峰分离无明显差异，故选择时间较为简短的20分钟作为大肺筋草标准汤剂特征图谱测定中供试品溶液制备的提取时间。
综上所述，大肺筋草标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品约0.1g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例7方法学考察
7.1色谱峰指认
对照品溶液的制备：取迷迭香酸、绿原酸、新绿原酸、异绿原酸、咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50μg的溶液，作为对照品溶液。
对照药材溶液的制备取大肺筋草对照药材约0.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30min，滤过，滤液蒸干，加25ml的70％甲醇，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
供试品溶液的制备：按“实施例6”结果制备大肺筋草药材、饮片供试品溶液。
阴性对照溶液的制备：按“实施例6”结果制备缺大肺筋草药材、饮片的阴性对照溶液。按“实施例5”结果进样测定，结果见图25、26，图25为大肺筋草对照药材色谱图；图26为色谱图指认结果图。
7.2精密度试验
取取大肺筋草药材(010094-1708001)按实施例6结果制备供试品溶液，按实施例5结果进样测定，连续6次，每次5μl，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果见表13-14。
表13精密度考察-相对保留时间
Figure GDA0004250839300000191
表14精密度考察-相对峰面积
Figure GDA0004250839300000192
Figure GDA0004250839300000201
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％-0.03％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.14％-2.73％，说明该仪器精密度良好。
7.3重复性考察
取大肺筋草药材(010094-1708001)6份，按实施例6结果制备供试品溶液，按“实施例5”结果进样测定。结果见表15、16。
表15重复性考察-相对保留时间
Figure GDA0004250839300000202
表16重复性考察-相对峰面积
Figure GDA0004250839300000203
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％-0.07％，各特征峰相对峰面积的RSD在2.00％-6.35％，说明该方法重复性良好。
7.4中间精密度考察
取同一供试品(批号：010094-1708001)由不同人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、Ⅱ)下按“实施例6”结果制备供试品溶液，并按“实施例5”结果分别在仪器a、b上进样测定，结果见表17、18。
表17中间精密度-相对保留时间
Figure GDA0004250839300000204
Figure GDA0004250839300000211
注：A人员：汪席敏，B人员：樊帅珂，a：岛津LC～20AD型高效液相色谱仪，b：安捷伦1260型高效液相色谱仪，Ⅰ：2021.11.28，Ⅱ:2021.11.29.
表18中间精密度-相对峰面积
Figure GDA0004250839300000212
注：A人员：汪席敏，B人员：樊帅珂，a：岛津LC～20AD型高效液相色谱仪，b：安捷伦1260型高效液相色谱仪，Ⅰ：2021.11.28，Ⅱ:2021.11.29.
由表17、18可知，不同供试品溶液制备人员和不同供试品溶液制备时间下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.02％-0.26％，各特征峰相对峰面积的RSD在2.17％-6.22％，说明本方法适用性较好。
7.5色谱柱耐用性考察
在以上实验条件基础上，分别对色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent Eclipse Plus C18(250×4.6mm，5μm)、Kromasil 100-5-C18(250×4.6mm，5μm)
进行考察。结果见表19、表20和图27，图27为不同色谱柱考察结果图。
表19色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值
Figure GDA0004250839300000213
表20色谱柱耐用性考察-相对峰面积比值
Figure GDA0004250839300000221
结果表明，用上述表19、20中的3种色谱柱对样品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.25％-2.28％，各特征峰相对峰面积的RSD在2.00％-15.41％，说明本方法对不同色谱柱耐用性较好。
7.6稳定性
按“实施例6”结果制备供试品溶液一份，并按“实施例5”结果，分别于0h，4h，7h，13h，19h，24h时进样测定。结果见表21、22。
表21稳定性考察-相对保留时间
Figure GDA0004250839300000222
表22稳定性考察-相对保留峰面积
Figure GDA0004250839300000223
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％～0.05％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.21％～2.61％，说明供试品溶液的稳定性良好，在24小时内可供检测。
实施例8特征峰的确定及对照图谱的建立
按“实施例6”结果制备21批药材的供试品溶液，并按“实施例5”结果进样测定分析，计算相对保留时间和相对峰面积比值。结果见图28～图29，表23、24。图28～29为大肺筋草药材特征图谱，图28(从下到上批号依次为：010094-1708001、XLS202109284、XLS202109285、XLS202109286、XLS202109287、XLS202109288、XLS202109289、XLS202109290、XLS202109291、XLS202109292)；图29(从下到上批号依次为：XLS202109293、XLS202109294、XLS202109295、XLS202109296、XLS202109297、XLS202109298、XLS202109299、XLS202109300、XLS202109301、XLS202109302、XLS202109303)。
表23 21批大肺筋草药材相对保留时间
Figure GDA0004250839300000231
表24 21批大肺筋草药材相对峰面积
Figure GDA0004250839300000232
Figure GDA0004250839300000241
/>
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出共有峰峰相对较高的原则，共选择了10个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰9作为S峰时，21批次大肺筋草饮片10个特征峰相对保留时间RSD在0.02％～0.51％，均小于10％。
最终规定：供试品特征图谱中应呈现10个特征峰，并应与对照药材参照物中的10个特征峰保留时间相对应，其中与迷迭香酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.292(峰1)、0.326(峰2)、0.391(峰3)、0.400(峰4)、0.557(峰5)、0.588(峰6)、0.756(峰7)、0.900(峰8)、1.089(峰10)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批大肺筋草标准汤剂进行合成，建立了大肺筋草药材特征图谱的对照图谱。见图30。图30为大肺筋草药材对照特征图谱；峰3：新绿原酸；峰5：绿原酸；峰6：咖啡酸；峰8：异绿原酸；峰9(S)：迷迭香酸；色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB C18(250×4.6mm,5μm)。
实施例9大肺筋草标准配方颗粒HPLC特征图谱色谱条件筛选
9.1色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；检测波长为240nm，理论板数按迷迭香酸计算应不低于5000。
Figure GDA0004250839300000251
参照物溶液的制备取大肺筋草对照药材约0.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30min，滤过，滤液蒸干，加25ml的70％甲醇，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取迷迭香酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品适量，约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照药材参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
9.2流动相选择
比较甲醇-0.1％冰乙酸、甲醇-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.1％冰乙酸三种混合溶剂对大肺筋草配方颗粒供试品溶液中色谱峰的分离效果，选择较优的组合溶剂作为大肺筋草配方颗粒特征图谱测定的流动相，结果如图31所示，图31为大肺筋草配方颗粒特征图谱流动相选择结果。
9.3波长选择
在“9.1色谱条件”基础上，利用二极管阵列检测器分别对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在220nm、240nm、280nm波长下的色谱图。如图32和图33，图32为大肺筋草配方颗粒的3D图，图33为大肺筋草配方颗粒不同波长色谱图。
结果表明，在检测波长为280nm时色谱峰信息量较大，故大肺筋草标准汤剂特征图谱方法的检测波长最终确定为280nm。
9.4流速考察
在“9.1色谱条件”基础上，分别考察0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min三种流速对供试品溶液中色谱峰的分离效果，结果见图34。图34为大肺筋草配方颗粒特征图谱流速考察结果。
图34表明：在1.0ml/min的流速下，色谱峰峰型对称，分离度较好，故选择1.0ml/min作为大肺筋草配方颗粒特征图谱的测定流速。
9.5柱温考察
在“9.1色谱条件”基础上，分别考察20℃、30℃、35℃三种柱温对供试品溶液中色谱峰的分离效果，结果见图35，图35为柱温考察结果。图35表明：在30℃的柱温下，色谱峰峰型对称，分离度较好，故选择30℃作为大肺筋草配方颗粒特征图谱的测定柱温。
9.6延迟性实验
在“9.1色谱条件”基础上，将分析时间延长至130分钟，观察130分钟后是否有色谱峰，结果见图36，图36为大肺筋草配方颗粒特征图谱延迟性试验色谱图；结果表明，延长65分钟后基本无较大的色谱峰，最终确定大肺筋草配方颗粒特征图谱方法的分析时间为65分钟。
综上所述，大肺筋草配方颗粒特征图谱色谱条件与系统适用性试验拟定为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为280nm，理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于5000。
Figure GDA0004250839300000261
实施例10供试品溶液的制备考察
10.1提取溶剂考察
取大肺筋草配方颗粒(1902061)0.1g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、水、乙醇各25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“实施例9”结果进样测定，结果见图37。图37为大肺筋草配方颗粒特征图谱提取溶剂考察结果图。结果表明：70％甲醇提取的供试品溶液中色谱峰中峰型和分离度均较好，因此选择70％甲醇作为大肺筋草配方颗粒特征图谱测定中供试品溶液制备的提取溶剂。
10.2提取方式考察
取大肺筋草配方颗粒(1902061)0.1g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“实施例9”结果进样测定，结果见图38，图38为大肺筋草配方颗粒特征图谱提取方式考察结果图。
从图38中可以看出，回流提取和超声提取的最终效果无显著差异，故选择操作更加简便的超声作为大肺筋草配方颗粒特征图谱测定中供试品溶液制备的提取方式。
10.3提取时间考察
取大肺筋草配方颗粒(1902061)0.1g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，分别超声(功率600W，频率40kHz)处理20分钟、30分钟、40分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“实施例9”拟定的结果进样测定，结果见图39，图39为大肺筋草配方颗粒特征图谱提取时间考察结果图。
从上图中可以看出，超声提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时，色谱图中峰分离无明显差异，故选择时间较为简短的20分钟作为大肺筋草配方颗粒特征图谱测定中供试品溶液制备的提取时间。
综上所述，大肺筋草配方颗粒特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品约0.1g，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例11方法学考察
11.1色谱峰指认
对照品溶液的制备：取迷迭香酸、绿原酸、新绿原酸、异绿原酸、咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50μg的溶液，作为对照品溶液。
对照药材溶液的制备取大肺筋草对照药材约0.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，煎煮30min，滤过，滤液蒸干，加25ml的70％甲醇，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
供试品溶液的制备：按“实施例10”结果制备大肺筋草配方颗粒供试品溶液。
阴性对照溶液的制备：按“实施例10”结果制备缺大肺筋草配方颗粒的阴性对照溶液。按“实施例9”结果进样测定，结果见图40、41，图40为大肺筋草对照药材色谱图；图41为色谱图指认结果图。
11.2精密度试验
取大肺筋草配方颗粒(1902061)按实施例10结果制备供试品溶液，按实施例9结果进样测定，连续6次，每次10μl，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果见表25-26。
表25精密度考察-相对保留时间
Figure GDA0004250839300000271
表26精密度考察-相对峰面积
Figure GDA0004250839300000281
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％-0.02％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.14％-0.85％，说明该仪器精密度良好。
11.3重复性考察
取大肺筋草配方颗粒(1902061)6份，按实施例10结果制备供试品溶液，按“实施例9”结果进样测定。结果见表27、28。
表27重复性考察-相对保留时间
Figure GDA0004250839300000282
表28重复性考察-相对峰面积
Figure GDA0004250839300000283
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％-0.05％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.28％-1.46％，说明该方法重复性良好。
11.4中间精密度考察
取同一供试品(批号：1902061)由不同人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、Ⅱ)下按“实施例10”结果制备供试品溶液，并按“实施例9”结果分别在仪器a、b上进样测定，结果见表29、30。
表29中间精密度-相对保留时间
Figure GDA0004250839300000284
/>
Figure GDA0004250839300000291
注：A人员：汪席敏，B人员：樊帅珂，a：岛津LC～20AD型高效液相色谱仪，b：安捷伦1260型高效液相色谱仪，Ⅰ：2021.11.15，Ⅱ:2021.11.16
表30中间精密度-相对峰面积
Figure GDA0004250839300000292
注：A人员：汪席敏，B人员：樊帅珂，a：岛津LC～20AD型高效液相色谱仪，b：安捷伦1260型高效液相色谱仪，Ⅰ：2021.11.15，Ⅱ:2021.11.16.
由表29、30可知，不同供试品溶液制备人员和不同供试品溶液制备时间下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.00％-0.07％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.62％-7.89％，说明本方法适用性较好。
11.5色谱柱耐用性考察
在以上实验条件基础上，分别对色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent Eclipse Plus C18(250×4.6mm，5μm)、Kromasil 100-5-C18(250×4.6mm，5μm)
进行考察。结果见表31、表32和图42，图42为不同色谱柱考察结果图。
表31色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值
Figure GDA0004250839300000293
Figure GDA0004250839300000301
表32色谱柱耐用性考察-相对峰面积比值
Figure GDA0004250839300000302
结果表明，用上述表7、8中的3种色谱柱对样品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.03％-4.13％，各特征峰相对峰面积的RSD在3.24％-10.15％，说明本方法对不同色谱柱耐用性较好。
11.6稳定性
按“实施例10”结果制备供试品溶液一份，并按“实施例9”结果，分别于0h，4h，7h，13h，19h，24h时进样测定。结果见表33、34。
表33稳定性考察-相对保留时间
Figure GDA0004250839300000303
表34稳定性考察-相对保留峰面积
Figure GDA0004250839300000304
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％～0.04％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.18％-1.47％，说明供试品溶液的稳定性良好，在24小时内可供检测。
实施例12特征峰的确定及对照图谱的建立
按“实施例10”结果制备3批配方颗粒的供试品溶液，并按“实施例9”结果进样测定分析，计算相对保留时间和相对峰面积比值。结果见图43，表35、36。图43为大肺筋草配方颗粒特征图谱，(从下到上批号依次为：SY2112001、SY2112002、SY2112003)。
表35 3批大肺筋草配方颗粒相对保留时间
Figure GDA0004250839300000311
表36 3批大肺筋草配方颗粒相对峰面积
Figure GDA0004250839300000312
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出共有峰峰相对较高的原则，共选择了10个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰9作为S峰时，3批次大肺筋草配方颗粒特征峰相对峰面积RSD在0.13％～2.29％，3批次大肺筋草配方颗粒10个特征峰相对保留时间RSD在0.01％～0.47％，均小于10％。
最终规定：供试品特征图谱中应呈现10个特征峰，并应与对照药材参照物中的10个特征峰保留时间相对应，其中与迷迭香酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.304(峰1)、0.338(峰2)、0.400(峰3)、0.414(峰4)、0.562(峰5)、0.598(峰6)、0.760(峰7)、0.900(峰8)、1.081(峰10)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批大肺筋草配方颗粒进行合成，建立了大肺筋草配方颗粒特征图谱的对照图谱。见图44。图44为大肺筋草配方颗粒对照特征图谱；峰3：新绿原酸；峰5：绿原酸；峰6：咖啡酸；峰8：异绿原酸；峰9(S)：迷迭香酸；色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB C18(250×4.6mm,5μm)。
对比例1
测试梯度1：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为280nm，理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于5000。
Figure GDA0004250839300000321
测试梯度2：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为280nm，理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于5000。
Figure GDA0004250839300000322
测试梯度3：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为280nm，理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于5000。
Figure GDA0004250839300000323
Figure GDA0004250839300000331
如图45所示，图45为本发明对比例1的梯度考察结果图；确认梯度比测试梯度1、测试梯度2、测试梯度3峰多且峰分离效果较好，故选择此梯度为本方法梯度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：
A )将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；
B）将待测液采用高效液相色谱法测定，得到大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱；还包括制备参照物溶液：取迷迭香酸，采用甲醇溶解，得到参照物溶液；所述迷迭香酸的浓度为50μg/mL；
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行定性；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C 18柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%磷酸，梯度洗脱；
所述梯度洗脱具体为：
0～15min，A相：5%～15%、B相：95%～85%；
15～20min，A相：15%～20%、B相：85%～80%；
20～45min，A相：20%～40%、B相：80%～60%；
45～65min，A相：40%～65%、B相：60%～35%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18 250×4.6 mm,5 µm、Agilent Eclipse Plus C18 250×4.6 mm，5µm 、Kromasil100-5-C18 250×4.6 mm，5µm ；柱温30℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；进样量为5~10μL，理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于5000。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品原料为大肺筋草药材、饮片，大肺筋草标准汤剂或大肺筋草配方颗粒中的一种或几种；
所述提取的溶剂为70%甲醇；所述提取为超声提取；所述超声提取的时间为20~30min；所述超声的功率为600W，频率40kHz；所述供试品原料的质量g和溶剂的体积mL的比为（0.1~0.5）：（20~25）。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对大肺筋草药材、饮片HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由10个特征峰构成的大肺筋草药材、饮片HPLC标准特征图谱，其中迷迭香酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：峰1：0.292、峰2：0. 326、峰3：0.391、峰4：0.400、峰5：0.557、峰6：0.588、峰7：0.756、峰8：0.900、峰10：1.089。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对大肺筋草标准汤剂HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由10个特征峰构成的大肺筋草标准汤剂HPLC标准特征图谱，其中迷迭香酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：峰1：0.304、峰2：0.339、峰3：0.400、峰4：0.415、峰5：0.562、峰6：0.598、峰7：0.760、峰8：0.900、峰10：1.081。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对大肺筋草配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由10个特征峰构成的大肺筋草配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中迷迭香酸参照物相应的峰为S峰；在所述标准特征图谱中，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；规定值为：峰1：0.304、峰2：0.338、峰3：0.400、峰4：0.414、峰5：0.562、峰6：0.598、峰7：0.760、峰8：0.900、峰10：1.081。
8.一种大肺筋草药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，采用权利要求1~7任一项所述的方法进行检测，分析检测结果。
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血盆草的亲缘关系与化学成分的简述;陶小艳;罗国勇;杨武德;;贵州科学(第06期);第26-32页 *

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