CN116539761A - 白土苓制品的检测方法 - Google Patents

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CN116539761A CN202310574560.7A CN202310574560A CN116539761A CN 116539761 A CN116539761 A CN 116539761A CN 202310574560 A CN202310574560 A CN 202310574560A CN 116539761 A CN116539761 A CN 116539761A
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Abstract

本发明涉及检测技术领域，公开了一种白土苓制品的检测方法，包括：将待测样品进行高效液相色谱检测，得到待测样品的指纹图谱；将所述待测样品的指纹图谱与预先建立白土苓制品的标准对照指纹图谱进行对比；所述高效液相色谱检测中，流动相包括：甲醇和磷酸溶液，进行梯度洗脱。本发明采用合适的高效液相色谱检测条件，能够建立包含8个特征峰的白土苓指纹图谱，便于对白土苓进行鉴别；且能够确认有效成分的特征峰较多，从而对白土苓的质量检测结果更加准确。

Description

白土苓制品的检测方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种白土苓制品的检测方法。
背景技术
白土苓为现代品种，其性味甘、淡、平，具有除湿、解毒、通利关节等功效，临床上常用于治疗湿热淋浊、带下、痈肿及汞中毒所致的肢体拘挛、筋骨疼痛。
目前市售白土苓以短柱肖菝葜Heterosmilax yunnanensis Gagnep.为多，在贵州、云南、四川等产地均有一定的栽培基础。因白土苓产品的品种、产地不同，难以把控产品质量。要从整体上有效地表征白土苓质量，需要建立标准对照指纹图谱对其进行质量鉴别。
专利文件CN102608236A提供了短柱肖菝葜药材的检测方法，以丁香酸葡萄糖苷为对照品，以乙腈-磷酸为流动相进行液相色谱分析，构建短柱肖菝葜的指纹图谱。但是该方法对短柱肖菝葜的分离效果较差，重复性不佳，不足以全面准确地反应短柱肖菝葜的质量特征。
发明内容
为达此目的，本发明提供一种具有较优的分离效果和重复性的白土苓制品的检测方法，以达到全面准确地鉴别其质量。
本发明的白土苓制品的检测方法，包括如下步骤：
将待测样品进行高液相色谱检测，得到待测样品的指纹图谱；
将所述待测样品的指纹图谱与预先建立白土苓制品的标准对照指纹图谱进行对比；
所述高液相色谱检测中，流动相包括：甲醇和磷酸溶液，进行梯度洗脱。
作为优选，所述磷酸溶液的浓度为0.05-0.15％。
优选地，磷酸溶液的浓度为0.1％。
作为优选，所述梯度洗脱按如下程序进行：
0-12mi n，所述流动相B的体积百分比为100％；
12-18mi n，所述流动相B的体积百分比由100％下降至96％；
18-24mi n，所述流动相B的体积百分比由96％下降至90％；
24-36mi n，所述流动相B的体积百分比由90％下降至87％；
36-55mi n，所述流动相B的体积百分比为87％。
作为优选，所述高效液相色谱检测的波长为220-360nm。
优选地，高效液相色谱检测的波长为254nm。
作为优选，所述高效液相色谱检测的流速为0.8-1.2m l/mi n。
优选地，高效液相色谱检测的流速为1.0m l/mi n。
作为优选，所述高效液相色谱检测的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
作为优选，色谱柱的柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为3.5μm。
作为优选，所述色谱柱的柱温为20-35℃。
优选地，色谱柱的柱温为30℃。
优选地，高效液相色谱检测的进样量为10μl；检测时间为55min。
本发明根据上述高效液相色谱检测的条件，对待测样品进行检测，得到待测样品的指纹图谱。作为优选，将待测样品溶于甲醇水溶液中，超声提取处理，过滤后，取续滤液，进行高效液相色谱检测。
优选地，超声提取的功率为600W，频率为40kHz。
作为优选，甲醇水溶液的浓度为30％-80％；优选为30％。
作为优选，甲醇水溶液的添加量为25-100ml；优选为25ml。
作为优选，超声提取的时间为30-90min；优选为30min。
本发明预先建立白土苓制品的标准对照指纹图谱，包括以下步骤：
将多个白土苓制品分别溶解，得到多个供试品溶液；
将参照物与各供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到参照物和多个白土苓制品的指纹图谱；
根据参照物和多个白土苓制品的指纹图谱，将所述多个白土苓制品的指纹图谱合成获得白土苓制品的标准对照指纹图谱。
具体而言，白土苓制品制成供试品溶液的方法与待测样品相同，此处不再赘述。根据上述高效液相色谱检测的条件，对参照物与各供试品溶液进行高效液相色谱检测，根据参照物和多个白土苓制品的指纹图谱，标定出指纹图谱中的共有特征峰，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对多个白土苓制品的指纹图谱进行合成，建立白土苓制品的标准对照指纹图谱。
在本发明提供的一些实施例中，白土苓制品的标准对照指纹图谱包含8个特征峰，其中峰2为原儿茶酸，峰4为4-羟基苯甲酸，峰7为香草酸，峰8为丁香酸葡萄糖苷。
作为优选，所述白土苓制品包括白土苓配方颗粒、白土苓标准汤剂、白土苓药材或白土苓饮片。
本发明对每一种类的白土苓制品分别建立不同的标准对照指纹图谱，具体包含：白土苓配方颗粒的标准对照指纹图谱、白土苓标准汤剂的标准对照指纹图谱、白土苓药材的标准对照指纹图谱和白土苓饮片的标准对照指纹图谱，其建立方法类似，本发明不再赘述。
作为优选，所述参照物为原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷。
在本发明提供的一些实施例中，将原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷加入甲醇，得到每1ml含原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷各30μg的混合溶液，进行高液相色谱检测。
从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：
本发明采用合适的高效液相色谱检测条件，能够建立包含8个特征峰的白土苓制品的标准对照指纹图谱，便于对白土苓制品进行鉴别；且能够确认有效成分的特征峰较多，从而对白土苓制品的质量检测结果更加准确；选用甲醇-磷酸溶液为流动相，使白土苓制品的分离度合适，能够获得具有更高峰值、更佳分离效果的色谱图。
另外，本发明的白土苓制品的检测方法具备较佳的重复性，且适用于不同批次的白土苓药材、白土苓饮片、白土苓标准汤剂和白土苓配方颗粒，适用范围广泛，能够为白土苓制品的质量鉴别提供全面、准确的检测依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为白土苓配方颗粒在不同检测波长下的3D色谱图；
图2为白土苓配方颗粒在不同检测波长下的色谱图；
图3为白土苓配方颗粒在不同柱温下的色谱图；
图4为白土苓配方颗粒在不同流速下的色谱图；
图5为白土苓配方颗粒在不同测定时间的色谱图；
图6为白土苓配方颗粒不同提取方式时的色谱图；
图7为白土苓配方颗粒不同提取溶剂时的色谱图；
图8为白土苓配方颗粒不同提取时间的色谱图；
图9为白土苓配方颗粒提取溶剂添加量不同时的色谱图；
图10为白土苓配方颗粒、白土苓对照药材与对照品的色谱图；
图11A为丁香酸葡萄糖苷光谱图；图11B为4-羟基苯甲酸光谱图；图11C为原儿茶酸光谱图；图11D为香草酸光谱图；图11E为甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷光谱图；
图12为白土苓配方颗粒采用不同仪器测定的色谱图；
图13为3批白土苓配方颗粒的指纹图谱；
图14为白土苓配方颗粒指纹图谱的对照图谱；
图15为白土苓标准汤剂在不同检测波长下的3D色谱图；
图16为白土苓标准汤剂在不同检测波长下的色谱图；
图17为白土苓标准汤剂在不同柱温下的色谱图；
图18为白土苓标准汤剂在不同流速下的色谱图；
图19为白土苓标准汤剂在不同测定时间的色谱图；
图20为白土苓标准汤剂不同提取方式时的色谱图；
图21为白土苓标准汤剂不同提取溶剂时的色谱图；
图22为白土苓标准汤剂不同提取时间的色谱图；
图23为白土苓标准汤剂提取溶剂添加量不同时的色谱图；
图24为白土苓标准汤剂、白土苓对照药材与对照品的色谱图；
图25为白土苓标准汤剂采用不同仪器测定的色谱图；
图26为21批白土苓标准汤剂的指纹图谱；
图27为白土苓标准汤剂指纹图谱的对照图谱；
图28为白土苓药材在不同检测波长下的3D色谱图；
图29为白土苓药材在不同检测波长下的色谱图；
图30为白土苓标准汤剂在不同测定时间的色谱图；
图31为白土苓药材不同提取方式时的色谱图；
图32为白土苓药材、白土苓对照药材与对照品的色谱图；
图33为白土苓药材采用不同仪器测定的色谱图；
图34为21批白土苓药材的指纹图谱；
图35为21批白土苓饮片的指纹图谱；
图36为白土苓药材指纹图谱的对照图谱；
图37为白土苓饮片指纹图谱的对照图谱；
图38为白土苓配方颗粒、白土苓标准汤剂、白土苓药材和白土苓饮片对照指纹图谱；
图39为甲醇和乙腈分别作为流动相A的洗脱效果对比图；
图40为甲醇作为流动相A的洗脱效果图；
图41为乙腈作为流动相A的洗脱效果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例建立白土苓配方颗粒的标准对照指纹图谱并对其进行检测，其中色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml，柱温为30℃，检测波长为254nm。理论板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算不得低于5000。
参照物溶液的制备方法：取白土苓对照药材1g，加水50ml，水煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取丁香酸葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备方法：取白土苓配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品溶液色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，与丁香酸葡萄糖苷对照品参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.15(峰1)、0.42(峰2)、0.48(峰3)、0.63(峰4)、0.76(峰5)、0.87(峰6)、0.96(峰7)。
本实施例的方法是经过筛选的，具体过程如下：
1、仪器与试药
电子天平：ME204E/02、MS205DM、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；甲醇(色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)、甲醇(分析纯、成都市科隆化学试剂有限公司)；流动相用水为实验室自制超纯水；其余均为实验室自制纯水；原儿茶酸(中国食品药品检定研究院，批号：110809-201906，含量以97.7％计)；甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷(OST，批号：U40-1309310-02，含量以98％计)；4-羟基苯甲酸(中国食品药品检定研究院，批号：101149-202204，含量以100％计)；香草酸(中国食品药品检定研究院，批号：110776-201503，含量以99.8％计)；丁香酸葡萄糖苷(OST，批号：U40-7008658-02，含量以99.5％计)；白土苓对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121537-201502)；白土苓配方颗粒(四川新绿色药业)。
2、色谱条件与系统适用性试验
(1)检测波长考察
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在220nm、240nm、254nm、280nm、300nm、320nm、340nm、360nm波长下的色谱图(图1-2)。
结果表明，在检测波长为254nm时色谱峰信息量较丰富，色谱峰数更多，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为254nm。
(2)柱温考察
在以上拟定的实验条件下，分别对柱温为20℃、25℃、30℃、35℃时进行考察，结果见图3。
结果表明，柱温在30℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，故确定白土苓配方颗粒指纹图谱的检测柱温为30℃。
(3)流速考察
在以上拟定的实验条件下，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察，结果见图4。
结果表明，流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中，故流速确定为1.0ml/min。
(4)延迟性试验
在以上拟定的实验条件下，将色谱图采集时间延长至120分钟，结果如图5所示。
结果表明，样品在55分钟后基本无色谱峰，故测定时间确定为55分钟。
(5)色谱条件与系统适应性试验的确定
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；色谱柱柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；指纹图谱检测波长为254nm；进样体积为10μl，测定55分钟。理论板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算不得低于5000。
3、供试品溶液制备方法考察
(1)提取方式考察
精密称取白土苓配方颗粒0.2g，置具塞锥形瓶中，加80％甲醇10ml，分别回流、超声处理(功率600W，频率40kHz)60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；按上述的色谱条件进样测定，结果见图6。
结果表明，对供试品溶液进行超声提取与回流提取时效果一致，因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
(2)提取溶剂考察
精密称取白土苓配方颗粒0.2g，分别加入30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇、甲醇、50％乙醇、80％乙醇、乙醇、水各25ml，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；按上述的色谱条件进样测定，结果见图7。
结果表明，在提取溶剂为30％甲醇时，所得的色谱图峰型较好，色谱峰信息量大，故供试品提取溶剂确定为30％甲醇。
(3)提取时间考察
精密称取白土苓白土苓配方颗粒0.2g，置具塞锥形瓶中，加入30％甲醇25ml，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟、60分钟、90分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；按上述的色谱条件进样测定，实验结果见图8。
结果表明，提取时间为30分钟、60分钟、90分钟时效果一致，故供试品提取时间选择30分钟。
(4)提取溶剂添加量考察
精密称取白土苓配方颗粒0.2g，置具塞锥形瓶中，分别加入30％甲醇25ml、50ml、100ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；按上述的色谱条件进样测定，实验结果见图9。
结果表明，提取溶剂添加量为25ml时，各个色谱峰大小合适，故提取溶剂添加量选择25ml。
(5)供试品溶液制备方法的确定
取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4、方法学考察
4.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备白土苓配方颗粒的供试品溶液。
参照物溶液的制备：取白土苓对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加入30％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液；
取原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷各30μg的混合溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备白土苓配方颗粒阴性对照溶液。
分别吸取供试品溶液和参照物溶液各10μl注入高效液相色谱仪，进样测定；得到白土苓配方颗粒、白土苓对照药材与对照品的色谱图，对白土苓配方颗粒指纹图谱特征峰进行定位，结果见图10-11。
选择与白土苓对照药材保留时间相一致的9个共有峰作为白土苓配方颗粒指纹图谱的特征峰；比对对照品的特征峰与白土苓配方颗粒的特征峰，并根据对照品的光谱图(图11A-E)进行指认；结果表明，在白土苓配方颗粒指纹图谱中能找到与甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷、原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷保留时间一致的特征峰，确定峰2为甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷；峰3为原儿茶酸；峰5为4-羟基苯甲酸；峰8为香草酸；峰9(S)为丁香酸葡萄糖苷。
为全面准确地建立白土苓配方颗粒标准指纹图谱，对图谱中指认的9个特征峰进行考察。
4.2精密度实验
取白土苓配方颗粒，研细，取0.2g，按供试品溶液制备方法和拟定的色谱条件检测方法，连续进样6次，每次10μl；计算各特征峰的保留时间与峰面积，结果见表1、表2。
表1精密度考察—特征峰保留时间
表2精密度考察—特征峰峰面积
结果表明，精密度考察中各特征峰保留时间的RSD在0.06％～0.34％；各特征峰峰面积的RSD在0.91％～18.51％，精密度良好。
4.3重复性考察
取白土苓配方颗粒研细，精密称取6份，每份0.2g，按拟定的实验方法进行制备及测定，计算6份样品各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3、表4。
表3重复性考察—特征峰相对保留时间
表4重复性考察—特征峰相对峰面积
结果表明，特征峰相对保留时间的RSD在0.07％～0.36％；特征峰相对峰面积的RSD在5.90％～27.46％，重复性良好。
4.4不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取白土苓配方颗粒2份，每份0.2g，制备供试品溶液，进行测定，计算各特征峰的相对保留时间与相对峰面积，结果见表5、表6。
表5不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间
表6不同人员与时间考察—特征峰相对峰面积
结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.16％～0.84％；各特征峰相对峰面积的RSD在0.16％～0.84％。
4.5不同仪器考察
取白土苓配方颗粒研细，精密称取0.2g，制备供试品溶液，分别在三种不同类型的高效液相色谱仪上进行测定；计算各特征峰的相对保留时间与相对峰面积，结果见表7、表8和图12。
表7仪器考察—特征峰相对保留时间
表8仪器考察—特征峰相对峰面积
结果表明，用三种不同仪器检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.25％～1.57％；各特征峰相对峰面积的RSD在3.92％～30.48％，不同仪器耐用性良好。
4.6稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、16h、24h时，进行测定；计算各特征峰的保留时间与峰面积，结果见表9、表10。
表9 24小时稳定性考察—特征峰保留时间
表10 24小时稳定性考察—特征峰峰面积
结果表明，各特征峰保留时间的RSD在0.42％～0.70％；各特征峰峰面积的RSD在1.35％～24.11％。供试品溶液在24小时内稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述9个特征峰纳入后续考察。
4.7考察结果
多项考察结果汇总见表11、表12。
表11方法学各项目结果RSD％汇总标准—保留时间/相对保留时间
表12方法学各项目结果RSD％汇总标准—峰面积/相对峰面积
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。由于峰2在考察过程中出现裂峰的情况，说明峰2包峰，因此将峰2删除，保留剩下峰1、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9共8个特征峰，作为白土苓配方颗粒指纹图谱的特征峰；其中峰2为原儿茶酸；峰4为4-羟基苯甲酸；峰7为香草酸；峰8(S)为丁香酸葡萄糖苷。
4.8特征峰的确定及标准对照图谱的建立
(1)3批白土苓配方颗粒的验证结果
采用拟定的方法对3批白土苓配方颗粒，进行指纹图谱的测定；计算3批白土苓配方颗粒各特征峰相对保留时间、相对峰面积，结果见表13、表14和图13。
表13 3批白土苓配方颗粒相对保留时间
表14 3批白土苓配方颗粒相对峰面积
根据相对保留时间稳定、各批次样品均能检测出特征峰以及特征峰峰值相对较高的原则，共选择了峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8，合计8个耐用性较好的峰作为特征峰；根据方法学考察结果和3批白土苓配方颗粒验证结果，暂定理论塔板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算应不低于5000。
(2)相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表15-16：
表15方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对保留时间/保留时间
表16方法学各项目结果RSD％汇总标准—峰面积/相对峰面积
各特征峰相对保留时间稳定，且相对保留时间数值均在平均值±10％范围内，故将各峰的相对保留时间规定值范围暂定为±10％；各批次相对峰面积差异太大，无法进行规定，故相对峰面积不列入正文。
最终规定：本实施例白土苓配方颗粒供试品溶液指纹图谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应；与丁香酸葡萄糖苷峰相对应的峰为S峰；计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值具体如下：峰1为0.15、峰2为0.42、峰3为0.48、峰4为0.63、峰5为0.76、峰6为0.87、峰7为0.96。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批白土苓配方颗粒指纹图谱进行合成，建立了白土苓配方颗粒的标准对照指纹图谱，结果见图14。
结论：本实施例白土苓配方颗粒的指纹图谱检测方法能够对白土苓配方颗粒进行准确分析和检测。
5、白土苓配方颗粒指纹图谱的检测方法确定
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A；以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0m l，柱温为30℃，检测波长为254nm。理论板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算不得低于5000。
(2)参照物溶液的制备：取白土苓对照药材1g，加水50m l，水煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加30％甲醇25m l，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。另取丁香酸葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1m l含30μg的溶液，作为对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：取白土苓配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25m l，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(4)检测方法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，与丁香酸葡萄糖苷对照品参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.15(峰1)、0.42(峰2)、0.48(峰3)、0.63(峰4)、0.76(峰5)、0.87(峰6)、0.96(峰7)。
实施例2
实施例1对白土苓配方颗粒指纹图谱的检测方法同样适用于白土苓标准汤剂。具体如下：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0m l，柱温为30℃，检测波长为254nm。理论板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算不得低于5000。
参照物溶液的制备方法：取白土苓对照药材1g，加水50ml，水煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取丁香酸葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备方法：取白土苓标准汤剂冻干粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品溶液色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，与丁香酸葡萄糖苷对照品参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.15(峰1)、0.42(峰2)、0.48(峰3)、0.63(峰4)、0.77(峰5)、0.88(峰6)、0.95(峰7)。
本实施例的方法是经过筛选的，具体过程如下：
1、仪器与试药
电子天平：ME204E/02、MS205DM、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
甲醇(色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)、甲醇(分析纯、成都市科隆化学试剂有限公司)、流动相用水为实验室自制超纯水，其余均为实验室自制纯水。原儿茶酸(中国食品药品检定研究院，批号：110809-201906，含量以97.7％计)；甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷(OST，批号：U40-1309310-02，含量以98％计)；4-羟基苯甲酸(中国食品药品检定研究院，批号：101149-202204，含量以100％计)；香草酸(中国食品药品检定研究院，批号：110776-201503，含量以99.8％计)；丁香酸葡萄糖苷(OST，批号：U40-7008658-02，含量以99.5％计)；白土苓对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121537-201502)；
本实施例中用到的白土苓标准汤剂冻干粉为四川新绿色药业科技发展有限公司制备(批号：BTLBT01、BTLBT02、BTLBT03、BTLBT04、BTLBT05、BTLBT06、BTLBT07、BTLBT08、BTLBT09、BTLBT10、BTLBT11、BTLBT12、BTLBT13、BTLBT14、BTLBT15、BTLBT16、BTLBT17、BTLBT18、BTLBT19、BTLBT20、BTLBT21)。
2、色谱条件与系统适用性试验
(1)检测波长考察
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对白土苓标准汤剂供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在220nm、240nm、254nm、280nm、300nm、320nm、340nm、360nm波长下的色谱图。结果见图15-16。
结果表明，在检测波长为254nm时色谱峰信息量较丰富，色谱峰数更多，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为254nm。
(2)柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、25℃、30℃、35℃时进行考察。结果见图17。
柱温考察结果表明，当柱温为30℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度较好，故最终确定30℃作为白土苓标准汤剂指纹图谱检测方法的柱温。
(3)流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。见图18。
结果表明，流速在1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0ml/min。
(4)延迟性考察
在以上拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至120分钟。如图19所示。
结果表明，在色谱图采集到55分钟时，已将色谱峰采集完全。故将色谱图采集时间确定为55分钟。
(5)色谱条件与系统适应性试验的确定
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；色谱柱柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；指纹图谱检测波长为254nm；进样体积为10μl，测定55分钟。理论板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算不得低于5000。
3、供试品溶液制备方法考察
(1)提取方式考察
取白土苓标准汤剂冻干粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加30％甲醇10ml，分别回流、超声处理(功率600W，频率40kHz)60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定结果见图20。
结果表明，对白土苓标准汤剂的供试品溶液分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
(2)提取溶剂考察
取白土苓标准汤剂冻干粉约0.2g，分别加30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇、80％乙醇、50％乙醇、甲醇、乙醇、水各10ml，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定结果见图21。
结果表明，在提取溶剂为30％甲醇时，所得的色谱图峰型较好，色谱峰信息量大，故供试品提取溶剂确定为30％甲醇。
(3)提取时间考察
取白土苓标准汤剂冻干粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加30％甲醇10ml，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟、60分钟、90分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定结果见图22。
结果表明，对白土苓标准汤剂的供试品分别提取时间为30分钟、60分钟、90分钟时效果一致。故供试品提取时间选择30分钟。
(4)提取溶剂添加量考察
取白土苓标准汤剂冻干粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入30％甲醇5ml、10ml、15ml、25ml进行考察，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图23。
结果表明，提取溶剂为25ml时，各个色谱峰大小合适，故溶剂量选择25ml。
(5)供试品溶液制备方法的确定
取白土苓标准汤剂冻干粉约0.2g，置具塞锥形瓶中，精密加30％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4、方法学考察
4.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备白土苓标准汤剂的供试品溶液。
参照物溶液的制备：取白土苓对照药材1g，加入水50ml，水煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液；
取原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷各30μg的混合溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备白土苓标准汤剂阴性对照溶液。
分别吸取供试品溶液和参照物溶液各10μl注入高效液相色谱仪，进样测定；得到白土苓标准汤剂、白土苓对照药材与对照品的色谱图，对白土苓标准汤剂指纹图谱特征峰进行定位，结果见图24。
选择与白土苓对照药材保留时间相一致的9个共有峰作为白土苓标准汤剂指纹图谱的特征峰；比对对照品的特征峰与白土苓标准汤剂的特征峰，并根据对照品的光谱图(图11A-E)进行指认；结果表明，在白土苓标准汤剂指纹图谱中能找到与甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷、原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷保留时间一致的特征峰，确定峰2为甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷；峰3为原儿茶酸；峰5为4-羟基苯甲酸；峰8为香草酸；峰9(S)为丁香酸葡萄糖苷。
为全面准确地建立白土苓标准汤剂的指纹图谱，对图谱中指认的9个特征峰进行考察。
4.2精密度实验
取白土苓标准汤剂冻干粉制备供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的保留时间及峰面积，结果见表17-18。
表17精密度考察—特征峰保留时间
表18精密度考察—特征峰峰面积
/>
结果表明，各特征峰保留时间和峰面积的RSD值符合要求，该仪器精密度良好。
4.3重复性考察
精密称取白土苓标准汤剂冻干粉6份，按拟定实验方法进行制备及测定，计算特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见表19-20。
表19重复性考察—特征峰相对保留时间
表20重复性考察—特征峰相对峰面积
结果表明，各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值符合要求，表明该方法重复性良好。
4.4不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取白土苓标准汤剂冻干粉2份，制备供试品溶液，分别在三种不同类型的高效液相色谱仪上进行测定，计算特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见图25、表21-22。
表21仪器考察—特征峰相对保留时间
表22仪器考察—特征峰相对峰面积
结果表明，用上述三种仪器检测时，各特征峰相对保留时间的RSD为0.25％～1.58％。不同仪器耐用性良好。
4.5不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取白土苓标准汤剂冻干粉各2份，每份0.2g，制备供试品溶液，进行测定，计算各特征峰的相对保留时间与相对峰面积，结果见表23-24。
表23不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间
表24不同人员与时间考察—特征峰相对峰面积
结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.24％～1.07％；各特征峰相对峰面积的RSD在6.86％～24.66％。
4.6稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，制备一份供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、16h、24h时，进行测定；计算各特征峰的保留时间与峰面积，结果见表25-26。
表25 24小时稳定性考察—特征峰保留时间
表26 24小时稳定性考察—特征峰峰面积
结果表明，特征峰保留时间的RSD为0.27％-1.06％，峰面积RSD为0.98％-13.38％，样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述9个特征峰纳入后续考察。
4.7考察结果
多项考察结果汇总见表27-28。
表27方法学各项目结果RSD％汇总标准—保留时间/相对保留时间
表28方法学各项目结果RSD％汇总标准—峰面积/相对峰面积
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。由于峰2在考察过程中出现裂峰的情况，说明峰2包峰，因此将峰2删除，保留剩下峰1、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9共8个特征峰，作为白土苓标准汤剂指纹图谱的特征峰；其中峰2为原儿茶酸；峰4为4-羟基苯甲酸；峰7为香草酸；峰8(S)为丁香酸葡萄糖苷。
4.8特征峰的确定及对照指纹图谱的建立
(1)21批白土苓标准汤剂的验证结果
采用拟定的方法对21批白土苓标准汤剂进行指纹图谱的测定；计算21批白土苓标准汤剂各特征峰相对保留时间、相对峰面积，结果见表29、表30和图26。
表29 21批白土苓标准汤剂验证结果
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表30 21批白土苓标准汤剂相对峰面积
根据相对保留时间稳定、各批次样品均能检测出特征峰以及特征峰峰值相对较高的原则，共选择了8个耐用性较好的峰作为特征峰；根据方法学考察结果和21批标汤验证结果，暂定理论板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算不得低于5000。
(2)相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表31-32：
表31方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对保留时间
表32方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对峰面积
各特征峰相对保留时间稳定，且相对保留时间数值均在平均值±10％范围内，故将各峰的相对保留时间规定值范围暂定为±10％；各批次相对峰面积差异太大，无法进行规定，故相对峰面积不列入正文。
最终规定：本实施例白土苓标准汤剂冻干粉供试品溶液的指纹图谱中应呈现8个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应；与丁香酸葡萄糖苷峰相对应的峰为S峰；计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值具体如下：峰1为0.15、峰2为0.42、峰3为0.48、峰4为0.63、峰5为0.77、峰6为0.88、峰7为0.95。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批白土苓标准汤剂指纹图谱进行合成，建立了白土苓标准汤剂指纹图谱的对照图谱，结果见图27。
结论：本实施例白土苓标准汤剂的指纹图谱检测方法能够对白土苓标准汤剂进行准确分析和检测。
5、白土苓标准汤剂指纹图谱的检测方法确定
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A；以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0m l，柱温为30℃，检测波长为254nm。理论板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算不得低于5000。
(2)参照物溶液的制备：取白土苓对照药材1g，加水50m l，水煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加30％甲醇25m l，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。另取丁香酸葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1m l含30μg的溶液，作为对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：取白土苓标准汤剂适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25m l，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(4)检测方法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品溶液色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，与丁香酸葡萄糖苷对照品参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.15(峰1)、0.42(峰2)、0.48(峰3)、0.63(峰4)、0.77(峰5)、0.88(峰6)、0.95(峰7)。
实施例3
实施例1对白土苓配方颗粒指纹图谱的检测方法同样适用于白土苓药材和饮片。具体如下：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0m l，柱温为30℃，检测波长为254nm。理论板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算不得低于5000。
参照物溶液的制备方法：取白土苓对照药材1g，加水50m l，水煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加30％甲醇25m l，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取丁香酸葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1m l含30μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备方法：取白土苓药材或饮片粉末，过三号筛，精密称定1g，加入水50ml，水煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品溶液色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，与丁香酸葡萄糖苷对照品参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.15(峰1)、0.42(峰2)、0.48(峰3)、0.63(峰4)、0.76(峰5)、0.87(峰6)、0.95(峰7)。
本实施例的方法是经过筛选的，具体过程如下：
1、仪器与试药
电子天平：ME204E/02、MS205DM、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
甲醇(色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)、甲醇(分析纯、成都市科隆化学试剂有限公司)、流动相用水为实验室自制超纯水，其余均为实验室自制纯水。原儿茶酸(中国食品药品检定研究院，批号：110809-201906，含量以97.7％计)；甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷(OST，批号：U40-1309310-02，含量以98％计)；4-羟基苯甲酸(中国食品药品检定研究院，批号：101149-202204，含量以100％计)；香草酸(中国食品药品检定研究院，批号：110776-201503，含量以99.8％计)；丁香酸葡萄糖苷(OST，批号：U40-7008658-02，含量以99.5％计)；白土苓对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121537-201502)；
本实施例中用到的白土苓药材为四川新绿色药业科技发展有限公司制备(批号：BTL01、BTL02、BTL03、BTL04、BTL05、BTL06、BTL07、BTL08、BTL09、BTL10、BTL11、BTL12、BTL13、BTL14、BTL15、BTL16、BTL17、BTL18、BTL19、BTL20、BTL21)；
本实施例中用到的白土苓饮片为四川新绿色药业科技发展有限公司制备(批号：BTL001、BTL002、BTL003、BTL004、BTL005、BTL006、BTL007、BTL008、BTL009、BTL010、BTL011、BTL012、BTL013、BTL014、BTL015、BTL016、BTL017、BTL018、BTL019、BTL020、BTL021)；
2、色谱条件与系统适用性试验
(1)检测波长考察
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在220nm、240nm、254nm、280nm、300nm、320nm、340nm、360nm波长下的色谱图。见图28-29。
结果表明，在检测波长为254nm时色谱峰信息量较丰富，色谱峰数更多，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为254nm。
(2)柱温与流速考察
根据白土苓配方颗粒柱温、流速考察结果，拟定白土苓药材指纹图谱的测定柱温为30℃，流速为1.0ml/min进行后续考察。
(3)延迟性考察
在以上拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至120分钟，结果如图30所示。
结果表明，样品在55分钟后基本无色谱峰，故样品检测时间定为55分钟。
(4)色谱条件与系统适应性试验的确定
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；色谱柱柱温为30℃；流速为每分钟1.0m l；指纹图谱检测波长为254nm；进样体积为10μl，测定55分钟。理论板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算不得低于5000。
3、供试品溶液制备方法考察
根据白土苓标准汤剂及配方颗粒的供试品溶液制备考察结果，拟定白土苓药材的提取溶剂、提取时间与白土苓标准汤剂及配方颗粒一致，在此条件基础上进行提取方式考察。
(1)提取方式考察
提取方法一(水煮)：取白土苓药材(过三号筛)1.0g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，水煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，用30％甲醇25ml溶解，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
提取方法二(超声)：取白土苓药材(过三号筛)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；结果见图31。
结果表明，对白土苓药材供试品进行水煮和超声提取时，水煮的提取方式使各特征峰的峰形分离较好，故供试品溶液提取方法确定为水煮提取。
(2)供试品溶液制备方法的确定
取白土苓药材粉末(过三号筛)约1g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，水煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，用30％甲醇25ml超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，过滤，取续滤液，即得。
4、方法学考察
4.1色谱峰指认
参照物溶液的制备：取白土苓对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加入水50ml，水煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加30％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液；
取原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷各30μg的混合溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备白土苓药材阴性对照溶液。
供试品溶液的制备：取白土苓药材粉末(过三号筛)约1g，同对照药材溶液的制备方法制成白土苓药材的供试品溶液。
分别吸取供试品溶液和参照物溶液各10μl注入高效液相色谱仪，进样测定；得到白土苓药材、白土苓对照药材与对照品的色谱图，对白土苓药材指纹图谱特征峰进行定位，结果见图32。
选择与白土苓对照药材保留时间相一致的9个共有峰作为白土苓药材指纹图谱的特征峰；比对对照品的特征峰与白土苓药材的特征峰，并根据对照品的光谱图(图11A-E)进行指认；结果表明，在白土苓药材指纹图谱中能找到与甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷、原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷保留时间一致的特征峰，确定峰2为甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷；峰3为原儿茶酸；峰5为4-羟基苯甲酸；峰8为香草酸；峰9(S)为丁香酸葡萄糖苷。
为全面准确地建立白土苓药材标准指纹图谱，对图谱中指认的9个特征峰进行考察。
4.2精密度考察
取白土苓药材供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的保留时间及峰面积。见表33、34。
表33精密度考察—特征峰保留时间
表34精密度考察—特征峰峰面积
结果表明，样品各特征峰的保留时间RSD为0.24％～0.63％，该仪器精密度良好。
4.3重复性考察
取白土苓药材供试品溶液6份，按拟定实验方法进行制备及测定，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表35、36。
表35重复性考察—特征峰相对保留时间
表36重复性考察—特征峰相对峰面积
结果所示，6份样品的相对保留时间RSD为0.11％～0.31％，说明该方法重复性良好。
4.4不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取白土苓药材粉末3份，制备供试品溶液，分别在三种不同类型高效液相色谱仪上进行测定，计算特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见图33、表37-38。
表37仪器考察—特征峰相对保留时间
表38仪器考察—特征峰相对峰面积
结果表明，用上述三种仪器检测时，各特征峰相对保留时间的RSD为0.35％～1.10％，不同仪器耐用性良好。
4.5不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取白土苓药材粉末各两份，制备供试品溶液，进行测定，计算各特征峰的相对保留时间与相对峰面积，结果见表39-40。
表39不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间
表40不同人员与时间考察—特征峰相对峰面积
结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，各特征峰相对保留时间的RSD为0.28％～1.75％，方法稳定性较好。
4.6稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、16h、24h时，进行测定；计算各特征峰的保留时间与峰面积，结果见表41-42。
表41 24小时稳定性考察—特征峰保留时间
表42 24小时稳定性考察—特征峰峰面积
结果表明，特征峰保留时间的RSD在0.37％～1.11％，样品溶液在24小时内稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述9个特征峰纳入后续考察。
4.7考察结果
多项考察结果汇总见表43-44。
表43方法学各项目结果RSD％汇总标准—保留时间/相对保留时间
表44方法学各项目结果RSD％汇总标准—峰面积/相对峰面积
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。由于峰2在考察过程中出现裂峰的情况，说明峰2包峰，因此将峰2删除，保留剩下峰1、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9共8个特征峰，作为白土苓药材指纹图谱的特征峰纳入后续考察；其中峰2为原儿茶酸；峰4为4-羟基苯甲酸；峰7为香草酸；峰8(S)为丁香酸葡萄糖苷。
4.8特征峰的确定及对照指纹图谱的建立
(1)21批白土苓药材的验证结果
采用拟定的方法对21批白土苓药材进行指纹图谱的测定，并对得到的指纹图谱进行检验；计算21批白土苓药材各特征峰相对保留时间、相对峰面积，结果见表45-46和图34。
表45 21批白土苓药材相对保留时间
表46 21批白土苓药材相对峰面积
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根据相对保留时间稳定、各批次样品均能检测出特征峰以及特征峰峰值相对较高的原则，共选择了峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8合计8个耐用性较好的峰作为特征峰；根据方法学考察结果和21批药材验证结果，暂定理论塔板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算应不低于5000。
(2)21批白土苓饮片的验证结果
采用拟定的方法对21批白土苓饮片进行指纹图谱的测定，并对得到的指纹图谱进行检验；计算21批白土苓饮片各特征峰相对保留时间、相对峰面积，结果见表47-48和图35。
表47 21批白土苓饮片相对保留时间
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表48 21批白土苓饮片相对峰面积
/>
根据相对保留时间稳定、各批次样品均能检测出特征峰以及特征峰峰值相对较高的原则，共选择了峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8合计8个耐用性较好的峰作为特征峰；根据方法学考察结果和21批饮片验证结果，暂定理论塔板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算应不低于5000。
最终规定：本实施例白土苓药材以及白土苓饮片的供试品溶液的色谱中均应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，与丁香酸葡萄糖苷峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值具体如下：峰1为0.15、峰2为0.42、峰3为0.48、峰4为0.63、峰5为0.76、峰6为0.87、峰7为0.95。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批白土苓药材指纹图谱进行合成，建立了白土苓药材指纹图谱的对照图谱，结果见图36。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批白土苓饮片指纹图谱进行合成，建立了白土苓饮片指纹图谱的对照图谱，结果见图37。
结论：本实施例白土苓药材的指纹图谱检测方法能够对白土苓药材进行准确分析和检测；本实施例白土苓饮片的指纹图谱检测方法能够对白土苓饮片进行准确分析和检测。
5、白土苓药材、饮片指纹图谱的检测方法确定
(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A；以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0m l，柱温为30℃，检测波长为254nm。理论板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算不得低于5000。
(2)参照物溶液的制备：取白土苓对照药材1g，加水50m l，水煮30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加30％甲醇25m l，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。另取丁香酸葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1m l含30μg的溶液，作为对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：取白土苓药材或饮片粉末(过三号筛)1g，同对照药材溶液的制备方法制成供试品溶液。
(4)检测方法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品溶液色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应，与丁香酸葡萄糖苷对照品参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.15(峰1)、0.42(峰2)、0.48(峰3)、0.63(峰4)、0.76(峰5)、0.87(峰6)、0.95(峰7)。
参阅图38，为白土苓配方颗粒、白土苓标准汤剂、白土苓药材和白土苓饮片的对照指纹图谱的对比图。由图可知，白土苓配方颗粒、白土苓标准汤剂、白土苓药材和白土苓饮片呈现8个共有特征峰，其中峰2为原儿茶酸特征峰，峰4为4-羟基苯甲酸特征峰，峰7为香草酸特征峰，峰8为丁香酸葡萄糖苷特征峰；因此土苓配方颗粒与白土苓标准汤剂、白土苓药材、白土苓饮片具有相关性。
对比例1
(1)不同流动相A的对比选择
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈代替甲醇作为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。流速为每分钟1.0ml，柱温30℃，检测波长为254nm。理论板数按丁香酸葡萄糖苷峰计算不得低于5000。
在以上拟定的实验条件基础上，考察了2种不同流动相的分离效果，两种流动相分别为：甲醇-0.1％磷酸、乙腈-0.1％磷酸；结果如图39-41。
由图可知，甲醇为有机相洗脱效果比乙腈洗脱效果较好，分离度较好，且前面溶剂峰较小，整体峰高较明显，色谱峰信息更丰富。因此选择甲醇作为流动相有机相。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
注意，以上实施例仅为本发明的几种实施方式及所运动技术原理，而非对其限制。对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，对前述各实施例所记载的技术方案进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种白土苓制品的检测方法，其特征在于，包括：
将待测样品进行高效液相色谱检测，得到待测样品的指纹图谱；
将所述待测样品的指纹图谱与预先建立白土苓制品的标准对照指纹图谱进行对比；
所述高效液相色谱检测中，流动相包括：甲醇和磷酸溶液，进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的白土苓制品的检测方法，其特征在于，所述磷酸溶液的浓度为0.05-0.15％。
3.根据权利要求1所述的白土苓制品的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱按如下程序进行：
0-12min，所述流动相B的体积百分比为100％；
12-18min，所述流动相B的体积百分比由100％下降至96％；
18-24min，所述流动相B的体积百分比由96％下降至90％；
24-36min，所述流动相B的体积百分比由90％下降至87％；
36-55min，所述流动相B的体积百分比为87％。
4.根据权利要求1所述的白土苓制品的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的波长为220-360nm。
5.根据权利要求1所述的白土苓制品的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的流速为0.8-1.2ml/min。
6.根据权利要求1所述的白土苓制品的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
7.根据权利要求6所述的白土苓制品的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为20-35℃。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的白土苓制品的检测方法，其特征在于，所述预先建立白土苓制品的标准对照指纹图谱，包括以下步骤：
将多个白土苓制品分别溶解，得到多个供试品溶液；
将参照物与各供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到参照物和多个白土苓制品的指纹图谱；
根据参照物和多个白土苓制品的指纹图谱，合成获得白土苓制品的标准对照指纹图谱。
9.根据权利要求8所述的白土苓制品的检测方法，其特征在于，所述参照物为原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸葡萄糖苷、甲基氧化偶氮甲醇樱草糖苷。
10.根据权利要求1所述白土苓制品的检测方法，其特征在于，所述白土苓制品包括白土苓配方颗粒、白土苓标准汤剂、白土苓药材或白土苓饮片。
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