CN114487135B - 一种小蓟与小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的高效液相检测方法及其鉴别方法 - Google Patents

一种小蓟与小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的高效液相检测方法及其鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小蓟与小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的高效液相检测方法及其鉴别方法，包括以下步骤：取小蓟炭饮片或小蓟炭标准汤剂或小蓟炭配方颗粒0.5g，加入供试品提取溶剂，提取，冷却，过滤，取续滤液；取蒙花苷和5‑羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇制成每1ml各含40μg的溶液；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm，内径为4.6 mm，硅胶粒径为5μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为240‑330nm；柱温：25°—35°；流速：0.8—1.2mL/min；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪。

Description

一种小蓟与小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的高效液相检测 方法及其鉴别方法
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种小蓟与小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的高效液相检测方法及其鉴别方法。
背景技术
小蓟，为菊科植物刺儿菜的干燥地上部分。夏、秋二季花开时采割，除去杂质，晒干。小蓟炭炮制方法：取净小蓟段，照炒炭法（不加辅料的炒法称为清炒法。清炒法包括炒黄、炒焦和炒炭三种操作工艺。）炒至黑褐色。功效为：凉血止血，散瘀解毒消痈。主治：用于衄血，吐血，尿血，血淋，便血，崩漏，外伤出血，痈肿疮毒。
现在只有对于小蓟饮片和小蓟配方颗粒检测方法，缺少小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的检测方法。并且缺少小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒与小蓟饮片、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法。
发明内容
为解决前述问题，本发明提供了一种小蓟与小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的高效液相检测方法及其鉴别方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的高效液相检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、供试品溶液的制备：取小蓟炭饮片或小蓟炭标准汤剂或小蓟炭配方颗粒0.5g，加入供试品提取溶剂，称定重量，提取，冷却，再称定重量，用供试品提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；
（2）、参照物溶液的制备：取蒙花苷和5-羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇制成每1ml各含40μg的溶液；
（3）、色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm， 内径为4.6 mm，硅胶粒径为5 μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为240-330nm；柱温：25°—35°；流速：0.8—1.2mL/min；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；
（4）、测试：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到小蓟炭饮片或小蓟炭标准汤剂或小蓟炭配方颗粒的高效液相色特征图谱。
优选的，步骤（1）中，所述供试品提取溶剂为甲醇或50%甲醇或50%乙醇或水。
优选的，步骤（1）中，所述供试品提取溶剂加入量为15mL或25mL或50mL。
优选的，步骤（1）中，所述提取方式为回流提取或超声提取。
优选的，步骤（1）中，所述提取时间为20min或30min或40min。
优选的，步骤（1）中，供试品溶液的制备：取小蓟炭饮片或小蓟炭标准汤剂或小蓟炭配方颗粒0.5g，加入25mL甲醇，称定重量，超声提取30min，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液。
优选的，步骤（3）中，所述色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm， 内径为4.6 mm，硅胶粒径为5 μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为270nm，理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1500；柱温：35°；流速：1.0mL/min；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；梯度洗脱程序为：
0-13min，流动相A保持7％(v/v)；
13-20min，流动相A由7％(v/v)升至15％(v/v)；
20-35min，流动相A由15％(v/v)升至30％(v/v)；
35-50min，流动相A由30％(v/v)升至35％(v/v)；
50-60min，流动相A由35％(v/v)升至60％(v/v)；
60-70min，流动相A由60％(v/v)升至85％(v/v)；
70-85min，流动相A保持80％(v/v)。
一种小蓟和小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取待小蓟与小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒粉末按制备供试品溶液；
(2)按权利要求7项所述的高效液相色谱法检测；
(3)分析检测结果。
优选的，所述的高效液相色谱法检测的小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的图谱呈现4个特征峰。
优选的，所述的高效液相色谱法检测的小蓟饮片、标准汤剂、配方颗粒的图谱呈现2个特征峰。
本技术方案的有益效果如下：
（1）本发明的HPLC特征图谱检测方法，能整体控制小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，确保小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒整体质量的稳定，且方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高。
（2）本发明可以有效对比和分析小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的差异与变化，可以深入认识小蓟炭药效物质基础在从原料到配方颗粒成品的工艺过程的传递情况，从而整体评价和控制从小蓟炭药材到配方颗粒成品的工艺过程。因此，建立统一的小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱测定方法，有利于整体评价小蓟炭相关工艺过程的科学性、合理性，更能整体控制小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的内在质量，确保小蓟炭的临床疗效。
（3）小蓟和小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒的鉴别方法，可以对小蓟与小蓟炭炒炭前后进行质量控制，还能有效辨识炒炭前后饮片差异、标准汤剂的差异、配方颗粒的差异。可为小蓟、小蓟炭饮片、标准汤剂、配方颗粒及相关制剂的质量控制提供参考。
附图说明
图1为蒙花苷紫外吸收光谱图；
图2为5-羟甲基糠醛紫外吸收光谱图；
图3为小蓟炭标准汤剂3D图；
图4为小蓟炭标准汤剂在不同波长时的色谱图；
图5为小蓟炭标准汤剂不同柱温时的色谱图；
图6为小蓟炭标准汤剂不同流速时的色谱图；
图7为小蓟炭标准汤剂采用不同提取溶剂时的色谱图；
图8为小蓟炭标准汤剂采用不同提取方式时的色谱图；
图9为小蓟炭标准汤剂采用不同提取时间时的色谱图；
图10为小蓟炭标准汤剂采用不同提取溶剂量时的色谱图；
图11为小蓟炭标准汤剂特征图谱色谱峰指认；
图12为小蓟炭标准汤剂采用不同仪器时的色谱图；
图13为小蓟炭标准汤剂采用不同色谱柱时的色谱图；
图14为15批小蓟炭标准汤剂特征图谱验证图；
图15为小蓟炭标准汤剂对照特征图谱；
图16为3批小蓟炭配方颗粒特征图谱验证图；
图17为小蓟炭配方颗粒对照特征图谱；
图18为15批小蓟药材特征图谱；
图19为小蓟药材对照特征图谱，峰1（S）：蒙花苷；
图20为15批小蓟炭饮片特征图谱；
图21为小蓟炭饮片对照图谱，峰1：5-羟甲基糠醛；峰3（S）：蒙花苷；
图22为小蓟饮片、小蓟炭饮片对照图谱叠加图，峰1：5-羟甲基糠醛；峰3（S）：蒙花苷；
图23为小蓟标准汤剂、小蓟炭标准汤剂对照图谱叠加图，峰1：5-羟甲基糠醛；峰3（S）：蒙花苷；
图24为小蓟配方颗粒、小蓟炭配方颗粒对照图谱叠加图，峰1：5-羟甲基糠醛；峰3（S）：蒙花苷。
具体实施方式
1、实验仪器及材料
高效液相色谱仪：Waters 2695-2996型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、岛津20-AD型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A（上海摩勒科学仪器有限公司）；
超声波清洗器：KQ5200DB型（600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司）；
乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；
色谱柱：Agilent 5 TC-C18 250×4.6mm、Kromasil C18 5μm 4.6×250mm、Phenomenex Luna 5um C18(2)100A 4.6×250mm；
蒙花苷（中国食品药品检定研究院，批号：111528-201710，含量以96.6%计））；
5-羟甲基糠醛（中国食品药品检定研究院，批号：111626-201509，含量以97.8%计）。
小蓟标准汤剂（XJBT180801）；
小蓟配方颗粒（SY1809001）；
小蓟药材（010484-1806001；XLS201807897；XLS201807898；XLS201807899；XLS201807900；XLS201807902；XLS201807903；XLS201808157；XLS201808158；XLS201808159；XLS201808160；XLS201808161；XLS201808162；XLS201808163；XLS201808164）。
小蓟炭饮片（XJT180801；XJT180802；XJT180803；XJT180804；XJT180805；XJT180807；XJT180808；XJT180809；XJT180810；XJT180811；XJT180812； XJT180813；XJT180814；XJT180815；XJT180816）。
小蓟炭标准汤剂：小蓟炭标准汤剂为冻干粉（XJTBT180801、XJTBT180802、XJTBT180803、XJTBT180804、XJTBT180805、XJTBT180807、XJTBT180808、XJTBT180809、XJTBT180810、XJTBT180811、XJTBT180812、XJTBT180813、XJTBT180814、XJTBT180815、XJTBT180816）。
小蓟炭配方颗粒SY1809004、SY1809005、SY1809006。
2、拟定高效液效检测方法
2.1、供试品溶液的制备
取小蓟炭标准汤剂0.5g，加入25mL甲醇，称定重量，超声提取30min，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液。
2.2、参照物溶液的制备
取蒙花苷和5-羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇制成每1ml各含40μg的溶液。
2.3、色谱条件如下
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm， 内径为4.6 mm，硅胶粒径为5 μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为270nm，理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1500；柱温：35°；流速：1.0mL/min；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；梯度洗脱程序为：
0-13min，流动相A保持7％(v/v)；
13-20min，流动相A由7％(v/v)升至15％(v/v)；
20-35min，流动相A由15％(v/v)升至30％(v/v)；
35-50min，流动相A由30％(v/v)升至35％(v/v)；
50-60min，流动相A由35％(v/v)升至60％(v/v)；
60-70min，流动相A由60％(v/v)升至85％(v/v)；
70-85min，流动相A保持80％(v/v)。
2.4 测试：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到小蓟炭标准汤剂的高效液相色特征图谱。
3、色谱条件考察
3.1、波长考察
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器分别对蒙花苷、5-羟甲基糠醛进行全光谱扫描，并分别提取供试品溶液在240nm、270nm、284nm、330nm波长下的色谱图。
如图1—图4所示，结果表明，在检测波长为270nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为270nm。
3.2、柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察。表1为：柱温考察—特征峰相对保留时间比值。
表1 柱温考察—特征峰相对保留时间比值
如图5所示，结果表明，柱温在35℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，规定其柱温为35℃。
3.3、流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2 mL/min时进行了考察。表2为：流速考察—特征峰相对保留时间比值。
表2 流速考察—特征峰相对保留时间比值
如图6所示，结果表明，流速分别为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min时，各特征峰的相对保留时间RSD为5.42%-14.78%，在流速为1.0mL/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0mL/min。
综上所述，小蓟炭标准汤剂特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm， 内径为4.6 mm，硅胶粒径为5 μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为270nm，理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1500；柱温：35°；流速：1.0mL/min；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；梯度洗脱程序为：
0-13min，流动相A保持7％(v/v)；
13-20min，流动相A由7％(v/v)升至15％(v/v)；
20-35min，流动相A由15％(v/v)升至30％(v/v)；
35-50min，流动相A由30％(v/v)升至35％(v/v)；
50-60min，流动相A由35％(v/v)升至60％(v/v)；
60-70min，流动相A由60％(v/v)升至85％(v/v)；
70-85min，流动相A保持80％(v/v)。
4、供试品溶液的制备考察
4.1、提取溶剂考察
取本品（批号XJTBT180801）0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为甲醇、50%甲醇、50%乙醇、水各25mL进行考察，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
如图7所示，结果表明，在提取溶剂为甲醇时，所得色谱峰信息量大，且基线更平稳，故供试品提取溶剂确定为甲醇。
4.2、提取方式考察
取本品（批号XJTBT180801）0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
如图8所示，结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
4.3、提取时间考察
取本品（批号XJTBT180801）0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率40kHz），分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
如图9所示，结果表明，提取时间为20min-40min时，均能提取完全，综合考虑各因素，提取时间定为30min。
4.4、提取溶剂量考察
取本品（批号XJTBT180801）0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇15mL、25mL、50mL进行考察，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率40kHz），30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
如图10所示，结果表明，提取溶剂为25ml时，各个色谱峰大小合适，故溶剂量选择25mL。
综上所述，小蓟炭标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率600W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5、方法学考察
5.1、色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备小蓟炭标准汤剂供试品溶液。
取蒙花苷、5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含40μg的溶液，即得。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺小蓟炭标准汤剂阴性对照溶液。
对小蓟炭标准汤剂特征图谱峰进行指认。
如图11所示，结果表明，峰1为5-羟甲基糠醛；峰3为蒙花苷。在以下方法学考察中，对样品中的4个峰进行考察。
5.2、精密度试验
取小蓟炭标准汤剂（批号XJTBT180801）供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μL，计算各特征峰的保留时间及峰面积。表3为：精密度考察-保留时间。表4为：精密度考察-峰面积。
表3 精密度考察-保留时间
表4精密度考察-峰面积
结果表明，各特征峰保留时间和峰面积的RSD值符合要求，该仪器精密度良好。
5.3、重复性考察
精密称取小蓟炭标准汤剂冻干粉（批号XJTBT180801）6份，按拟定实验方法进行制备及测定。表5为：重复性考察-相对保留时间。表6为：重复性考察-相对峰面积。
表5 重复性考察-相对保留时间
表6 重复性考察-相对峰面积
结果表明，各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值符合要求，表明该方法重复性良好。
5.4、中间精密度考察
5.41、不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取小蓟炭标准汤剂冻干粉（批号XJTBT180801）两份，制备供试品溶液，分别在Waters2695-2996、岛津20-AD、安捷伦1260型高效液相色谱仪上进行测定。表7为：仪器耐用性考察-相对保留时间。表8为：仪器耐用性考察-相对峰面积。
表7 仪器耐用性考察-相对保留时间
表8 仪器耐用性考察-相对峰面积
如图12所示，结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.91%-2.05%之间，故3个品牌仪器耐用性良好。
5.42、不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员（A、B）在不同时间（T1 、T2）分别精密称取小蓟炭标准汤剂冻干粉（批号XJTBT180801）各两份，制备供试品，进行测定。表9为：人员和时间考察-相对保留时间。表10为：人员和时间考察-相对峰面积。
表9 人员和时间考察-相对保留时间
表10 人员和时间考察-相对峰面积
结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。
5.5、耐用性考察
5.51、色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为Agilent 5 TC-C18 250×4.6mm、Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm、Phenomenex Luna 5um C18(2) 100A 4.6×250mm。进行考察。表11为：色谱柱耐用性考察-相对保留时间。表12为：色谱柱耐用性考察-相对峰面积。
表11 色谱柱耐用性考察-相对保留时间
表12 色谱柱耐用性考察-相对峰面积
如图13所示，结果表明，用上述3批次色谱柱对样品进行检测，特征峰相对保留时间的RSD在1.57%-5.02%，特征峰相对峰面积的RSD在3..08%-10.33%。
5.52、稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，2h，4h，8h，16h，24h时测定。表13为：稳定性考察-保留时间。表14为：稳定性考察-峰面积。
表13 稳定性考察-保留时间
表14 稳定性考察-峰面积
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.07%-0.13%，特征峰峰面积在0.53%-6.81%样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述4个特征峰纳入后续考察。
下面通过几个具体的实施例来进一步说明实现本发明目的技术方案，需要说明的是，本发明要求保护的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
小蓟炭标准汤剂特征图谱的建立
供试品溶液的制备：取小蓟炭标准汤剂0.5g，加入25mL甲醇，称定重量，超声提取30min，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液。
参照物溶液的制备：取蒙花苷和5-羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇制成每1ml各含40μg的溶液。
色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm， 内径为4.6 mm，硅胶粒径为5 μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为270nm，理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1500；柱温：35°；流速：1.0mL/min；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；梯度洗脱程序为：
0-13min，流动相A保持7％(v/v)；
13-20min，流动相A由7％(v/v)升至15％(v/v)；
20-35min，流动相A由15％(v/v)升至30％(v/v)；
35-50min，流动相A由30％(v/v)升至35％(v/v)；
50-60min，流动相A由35％(v/v)升至60％(v/v)；
60-70min，流动相A由60％(v/v)升至85％(v/v)；
70-85min，流动相A保持80％(v/v)。
测试：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到小蓟炭标准汤剂的高效液相色特征图谱。
采用上述方法对本品15批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。表15为：15批小蓟炭标准汤剂相对保留时间。表16为：15批小蓟炭标准汤剂相对峰面积。
表15 15批小蓟炭标准汤剂相对保留时间
表16 15批小蓟炭标准汤剂相对峰面积
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根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了4个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰3作为S峰时，15批次小蓟炭标准汤剂特征峰相对峰面积RSD在53.71% ~130.17%，15批次小蓟炭标准汤剂4个特征峰相对保留时间RSD均小于1.0%。表17为：方法学各项目结果RSD(%)汇总标准—相对保留时间。表18为：方法学各项目结果RSD(%)汇总标准—相对峰面积。
表17 方法学各项目结果RSD(%)汇总标准—相对保留时间
表18 方法学各项目结果RSD(%)汇总标准—相对峰面积
最终规定：供试品特征图谱中应呈现4个特征峰，其中1个峰应与参照物峰保留时间相同，与蒙花苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内。规定值为：0.192（峰1）、0.307（峰2）、1.471（峰4）。
如图14和图15所示，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）对15批小蓟炭标准汤剂进行合成，建立了小蓟炭标准汤剂特征图谱的对照图谱。
实施例2
小蓟炭配方颗粒特征图谱的建立
供试品溶液的制备：取小蓟炭配方颗粒0.5g，加入25mL甲醇，称定重量，超声提取30min，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液。
参照物溶液的制备：取蒙花苷和5-羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇制成每1ml各含40μg的溶液。
色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm， 内径为4.6 mm，硅胶粒径为5 μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为270nm，理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1500；柱温：35°；流速：1.0mL/min；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；梯度洗脱程序为：
0-13min，流动相A保持7％(v/v)；
13-20min，流动相A由7％(v/v)升至15％(v/v)；
20-35min，流动相A由15％(v/v)升至30％(v/v)；
35-50min，流动相A由30％(v/v)升至35％(v/v)；
50-60min，流动相A由35％(v/v)升至60％(v/v)；
60-70min，流动相A由60％(v/v)升至85％(v/v)；
70-85min，流动相A保持80％(v/v)。
测试：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到小蓟炭配方颗粒的高效液相色特征图谱。
采用拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。表19为：3批小蓟炭配方颗粒相对保留时间。表20为：3批小蓟炭配方颗粒相对峰面积。
表19 3批小蓟炭配方颗粒相对保留时间
表20 3批小蓟炭配方颗粒相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了4个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰3作为S峰时，3批次小蓟炭配方颗粒4个特征峰相对保留时间RSD均小于1.0%。
如图16和图17所示，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）对3批小蓟炭配方颗粒进行合成，建立了小蓟炭配方颗粒特征图谱的对照图谱。
实施例3
小蓟药材特征图谱的建立
供试品溶液的制备：取小蓟药材0.5g，加入25mL甲醇，称定重量，超声提取30min，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液。
参照物溶液的制备：取蒙花苷和5-羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇制成每1ml各含40μg的溶液。
色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm， 内径为4.6 mm，硅胶粒径为5 μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为270nm，理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1500；柱温：35°；流速：1.0mL/min；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；梯度洗脱程序为：
0-13min，流动相A保持7％(v/v)；
13-20min，流动相A由7％(v/v)升至15％(v/v)；
20-35min，流动相A由15％(v/v)升至30％(v/v)；
35-50min，流动相A由30％(v/v)升至35％(v/v)；
50-60min，流动相A由35％(v/v)升至60％(v/v)；
60-70min，流动相A由60％(v/v)升至85％(v/v)；
70-85min，流动相A保持80％(v/v)。
测试：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到小蓟药材的高效液相色特征图谱。
按照以上方法对15批样品进行测定，计算相对保留时间、相对峰面积的比值。表21为：15批小蓟药材特征图谱相对保留时间比值。表22为：15批小蓟药材特征图谱相对峰面积。
表21 15批小蓟药材特征图谱相对保留时间比值
表22 15批小蓟药材特征图谱相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了2个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰1作为S峰时，15批小蓟药材特征峰相对峰面积RSD太大，因此不列入质量标准正文，特征峰相对保留时间RSD均小于2.0%。最终规定：供试品特征图谱中应呈现2个特征峰，其中1个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与蒙花苷参照物相应的峰为S峰，计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内。规定值为：1.472（峰2）。
如图18和图19所示，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）对15批小蓟药材特征图谱进行合成，建立了小蓟药材特征图谱的对照图谱。
实施例4
小蓟炭饮片特征图谱的建立
供试品溶液的制备：取小蓟炭饮片0.5g，加入25mL甲醇，称定重量，超声提取30min，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液。
参照物溶液的制备：取蒙花苷和5-羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇制成每1ml各含40μg的溶液。
色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250 mm， 内径为4.6 mm，硅胶粒径为5 μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为270nm，理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1500；柱温：35°；流速：1.0mL/min；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度脱洗；梯度洗脱程序为：
0-13min，流动相A保持7％(v/v)；
13-20min，流动相A由7％(v/v)升至15％(v/v)；
20-35min，流动相A由15％(v/v)升至30％(v/v)；
35-50min，流动相A由30％(v/v)升至35％(v/v)；
50-60min，流动相A由35％(v/v)升至60％(v/v)；
60-70min，流动相A由60％(v/v)升至85％(v/v)；
70-85min，流动相A保持80％(v/v)。
测试：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到小蓟炭饮片的高效液相色特征图谱。
按照以上方法对15批样品进行测定，计算相对保留时间、相对峰面积的比值。表23为：15批小蓟炭饮片特征峰相对保留时间。表24为：15批小蓟炭饮片特征峰相对峰面积。
表23 15批小蓟炭饮片特征峰相对保留时间
表24 15批小蓟炭饮片特征峰相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了4个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰3作为S峰时，15批次小蓟炭饮片特征峰相对峰面积RSD太大，因此不列入质量标准正文，特征峰相对保留时间RSD均小于2.0%。最终规定：供试品特征图谱中应呈现4个特征峰，其中2个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与蒙花苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8％之内。规定值为：规定值为：0.192（峰1）、0.307（峰2）、1.471（峰4）。
如图20和图21所示，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）对15批小蓟炭饮片特征图谱进行合成，建立了小蓟炭饮片特征图谱的对照图谱。
实施例5
小蓟饮片与小蓟炭饮片鉴别
采用上述小蓟炭饮片特征图谱拟定方法分别对小蓟饮片、小蓟炭饮片样品进行特征图谱测定，记录图谱。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）分别将小蓟饮片特征图谱合成一张对照图谱；小蓟炭特征图谱合成一张对照图谱。将以上小蓟饮片和小蓟炭饮片对照图谱进行对比，结果见图22。
结果表明：小蓟炭饮片能检测出4个特征峰，而小蓟饮片只有峰3（S）蒙花苷和峰4能检出，峰1 （5-羟甲基糠醛）和峰2不能检出，说明小蓟饮片在炒炭过程中化学成分发生了改变。小蓟炭与小蓟饮片特征图谱有显著差异性，此方法可以作为控制小蓟炭饮片质量标准指标之一。
实施例6
小蓟标准汤剂与小蓟炭标准汤剂鉴别
采用上述小蓟炭标准汤剂特征图谱拟定方法分别对小蓟标准汤剂、小蓟炭标准汤剂样品进行特征图谱测定，记录图谱。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）分别将小蓟饮片标准汤剂特征图谱合成一张对照图谱；小蓟炭标准汤剂特征图谱合成一张对照图谱。将以上小蓟饮片标准汤剂和小蓟炭标准汤剂对照图谱进行对比，结果见图23。
结果表明：小蓟炭标准汤剂能检测出4个特征峰，而小蓟标准汤剂只有峰3（S）蒙花苷和峰4能检出，说明小蓟炭标准汤剂与小蓟标准汤剂特征图谱有差异性。差异显示这两个峰（峰1与峰2）为炮制之后产生新成分。建立的小蓟炭标准汤剂特征图谱检测法能够将两种饮片进行鉴别，其中小蓟炭标准汤剂中的峰1和峰2为主要的鉴别点。从而可以更好地区分小蓟炭标准汤剂与小蓟标准汤剂特征图谱。可为小蓟与小蓟炭标准汤剂的质量控制提供参考。
实施例7
小蓟配方颗粒与小蓟炭配方颗粒鉴别
采用上述小蓟炭配方颗粒特征图谱拟定方法分别对小蓟炭配方颗粒和小蓟配方颗粒样品进行特征图谱测定，记录图谱。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）分别将小蓟炭配方颗粒特征图谱合成一张对照图谱；小蓟配方颗粒特征图谱合成一张对照图谱。将以上小蓟配方颗粒、小蓟炭配方颗粒对照图谱进行对比，结果图24。
结果表明：小蓟炭配方颗粒检测出的4个特征峰，小蓟配方颗粒检测出2个特征峰，小蓟配方颗粒没有峰1（5-羟甲基糠醛）和峰2，从而可以很好的区分小蓟炭配方颗粒与小蓟配方颗粒。小蓟炭配方颗粒中的峰1和峰2为主要的鉴别点。其中峰2经指认为5-羟甲基糠醛，差异显示这两个峰为炮制之后产生新成分。建立的小蓟炭配方颗粒特征图谱检测法能够将两种饮片进行鉴别，其中从而可以更好地有效辨别小蓟炭配方颗粒与小蓟配方颗粒特征图谱。可为小蓟与小蓟炭配方颗粒的质量控制提供参考。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种小蓟炭饮片、标准汤剂或配方颗粒的高效液相检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、供试品溶液的制备：取小蓟炭饮片或小蓟炭标准汤剂或小蓟炭配方颗粒0.5g，加入供试品提取溶剂，所述供试品提取溶剂为甲醇或50%甲醇或50%乙醇或水；称定重量，提取，冷却，再称定重量，用供试品提取溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液；
（2）、参照物溶液的制备：取蒙花苷和5-羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇制成每1ml各含40μg的溶液；
（3）、步骤（3）中，色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱长为250mm， 内径为4.6 mm，硅胶粒径为5 μm；检测器：二极管阵列检测器，检测波长为270nm，理论板数按蒙花苷峰计算应不低于1500；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸/水混合液，梯度洗脱；梯度洗脱程序为：
0-13min，流动相A保持7％(v/v)；
13-20min，流动相A由7％(v/v)升至15％(v/v)；
20-35min，流动相A由15％(v/v)升至30％(v/v)；
35-50min，流动相A由30％(v/v)升至35％(v/v)；
50-60min，流动相A由35％(v/v)升至60％(v/v)；
60-70min，流动相A由60％(v/v)升至85％(v/v)；
70-85min，流动相A保持80％(v/v)；
（4）、测试：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到小蓟炭饮片或小蓟炭标准汤剂或小蓟炭配方颗粒的高效液相色特征图谱。
2.根据权利要求1所述的一种小蓟炭饮片、标准汤剂或配方颗粒的高效液相检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述供试品提取溶剂加入量为15mL或25mL或50mL。
3.根据权利要求1所述的一种小蓟炭饮片、标准汤剂或配方颗粒的高效液相检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述提取的方式为回流提取或超声提取。
4.根据权利要求1所述的一种小蓟炭饮片、标准汤剂或配方颗粒的高效液相检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述提取的时间为20min或30min或40min。
5.根据权利要求1所述的一种小蓟炭饮片、标准汤剂或配方颗粒的高效液相检测方法，其特征在于：步骤（1）中，供试品溶液的制备：取小蓟炭饮片或小蓟炭标准汤剂或小蓟炭配方颗粒0.5g，加入25mL甲醇，称定重量，超声提取30min，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液。
6.一种小蓟和小蓟炭饮片、小蓟和小蓟炭标准汤剂或小蓟和小蓟炭配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取小蓟与小蓟炭饮片、小蓟和小蓟炭标准汤剂或小蓟和小蓟炭配方颗粒粉末按权利要求1所述的供试品溶液的制备步骤制备供试品溶液；
(2)按权利要求1项所述的高效液相色谱法检测；
(3)分析检测结果。
7.根据权利要求6所述的一种小蓟和小蓟炭饮片、小蓟和小蓟炭标准汤剂或小蓟和小蓟炭配方颗粒的鉴别方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法检测的小蓟炭饮片、标准汤剂或配方颗粒的图谱呈现4个特征峰。
8.根据权利要求6所述的一种小蓟和小蓟炭饮片、小蓟和小蓟炭标准汤剂或小蓟和小蓟炭配方颗粒的鉴别方法，其特征在于：所述的高效液相色谱法检测的小蓟饮片、标准汤剂或配方颗粒的图谱呈现2个特征峰。
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