CN108918734B - 一种检测大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的高效液相方法 - Google Patents

一种检测大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的高效液相方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可适用于整体控制大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒质量的高效液相特征图谱检测方法。本发明的HPLC特征图谱检测方法，能整体控制大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，确保大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒整体质量的稳定，且方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高。

Description

一种检测大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的 高效液相方法
技术领域
本发明具体涉及一种大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的HPLC检测方法。
背景技术
大青叶为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥叶，具有清热解毒，凉血消斑的功效，用于温病高热，神昏，发斑发疹，作腮，喉痹，丹毒，痈肿，为临床常用中药品种。大青叶中主要含有靛蓝、菘蓝苷、靛玉红、色胺酮、喹唑酮等成分。现代研究表明，大青叶具有抗病原微生物，抗内毒素，抗氧化等药理活性，这些化学成分的整体组成与含量是大青叶发挥临床疗效的基础，因此，要确保其临床疗效，需要对其药效成分进行整体质量控制。
目前，《中国药典》2015年版一部大青叶项下仅收载采用高效液相色谱法测定靛玉红单一成分含量的方法，尚未进行其特征图谱控制。其他有部分文献研究报道建立了大青叶饮片、注射剂的指纹图谱，如李环环，王英姿，梁丽丽，等.不同产地大青叶饮片反相高效液相色谱指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(24):81-85；刘瑞,刘志刚,李磊，等.复方大青叶注射液HPLC指纹图谱研究[J].中国中药杂志,2006,31(13):1059-1062.分别收载了用于控制大青叶饮片、注射剂指纹图谱的高效液相色谱法。
然而，上述报道是均是单独针对大青叶饮片和注射剂研究建立的指纹图谱，检测方法各不相同，也未见大青叶标准汤剂、配方颗粒指纹图谱研究的报道。因此，现有的检测方法难以有效对比和分析大青叶饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的差异与变化，难以深入认识大青叶药效物质基础在从原料到配方颗粒成品的工艺过程的传递情况，难以整体评价和控制从大青叶饮片到配方颗粒成品的工艺过程。因此，建立统一的大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱测定方法，有利于整体评价大青叶相关工艺过程的科学性、合理性，更能整体控制大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的内在质量，确保大青叶的临床疗效。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种适用于大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱测定的HPLC检测方法。
本发明的整体控大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的高效液相特征图谱检测方法，包括如下操作步骤：
1)对照品溶液制备：取对照品，溶解，即得对照品溶液；
2)对照药材溶液制备：取大青叶对照药材，经提取，即得对照药材溶液；
3)分别吸取对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：240～270nm；流动相：甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：
Figure BDA0001749081190000021
其中，步骤1)所述对照品包括：尿苷、次黄嘌呤、腺苷、鸟苷、紫丁香苷、异荭草苷、异牡荆苷、异金雀花素八种对照品。
其中，步骤1)所述溶解是加入甲醇或水溶解。
其中，步骤2)所述提取是指：加入水，超声提取。
优选地，所述提取方法如下：
取大青叶药材或饮片，加入16.7倍水，或取大青叶标准汤剂粉末，加入50倍水，或取大青叶配方颗粒研细后粉末，加入25倍水；超声提取20分钟，放冷，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得大青叶标准汤剂或配方颗粒的供试品溶液；所述超声提取的功率为600W、频率为40kHz。
其中，所用色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq C18色谱柱，规格均为4.6mm×250mm，5μm。
其中，所述检测波长为260nm。
其中，所述色谱条件还包括：流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL。
本发明的大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒高效液相特征图谱的检测方法，能整体控制大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，确保大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒整体质量的稳定，且方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1大青叶药材对照图谱，峰1：尿苷；峰2：次黄嘌呤；峰3：腺苷；峰4：鸟苷；峰7(S)：紫丁香苷；峰10：异荭草苷；峰11：异牡荆苷；峰12：异金雀花素。
图2大青叶饮片对照图谱，峰1：尿苷；峰2：次黄嘌呤；峰3：腺苷；峰4：鸟苷；峰7(S)：紫丁香苷；峰10：异荭草苷；峰11：异牡荆苷；峰12：异金雀花素。
图3大青叶标准汤剂对照图谱，峰1：尿苷；峰2：次黄嘌呤；峰3：腺苷；峰4：鸟苷；峰7(S)：紫丁香苷；峰10：异荭草苷；峰11：异牡荆苷；峰12：异金雀花素。
图4大青叶配方颗粒对照图谱，峰1：尿苷；峰2：次黄嘌呤；峰3：腺苷；峰4：鸟苷；峰7：紫丁香苷；峰10：异荭草苷；峰11：异牡荆苷；峰12：异金雀花素。
具体实施方式
仪器与试药
1仪器
高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、waters2695型高效液相色谱仪、岛津20AD型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18 4.6×250mm 5μm、岛津InertSustain AQ-C18 5μm 250×4.6mm、Agilent Polaris 5C18-A 5μm 250×4.6mm、Sepax HP-C18 5μm 250×4.6mm。
2试药
甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
靛玉红(中国食品药品检定研究院，批号：110717-200204)；靛蓝(中国食品药品检定研究院，批号：110716-201612，含量以98.7％计)；腺苷(中国食品药品检定研究院，批号：110879-201703，含量以99.7％计)；鸟苷(中国药品生物制品检定所，批号：111977-201501，含量以93.6％计)；尿苷(中国药品生物制品检定所，批号：887-200202)；紫丁香苷(中国食品药品检定研究院，批号：111574-200603)；异牡荆苷(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-18041301，含量以99.78％计)；次黄嘌呤(中国食品药品检定研究院，批号：140661-201704，含量以100.0％计)；异荭草苷(中国食品药品检定研究院，批号：111974-201401，含量以94.0％计)；异金雀花素(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18012401)；大青叶对照药材(中国药品生物制品检定所，批号：121367-200602)
大青叶标准汤剂冻干粉(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：DQYBT170801、DQYBT180301、DQYBT180302、DQYBT180303、DQYBT180304、DQYBT180305、DQYBT180306、DQYBT180307、DQYBT180308、DQYBT180309、DQYBT180310、DQYBT180311、DQYBT180312、DQYBT180313、DQYBT180314、DQYBT180315、DQYBT180316、DQYBT180317、DQYBT180318、DQYBT180319、DQYBT180401)
大青叶药材(批号：2017-054、G16111293、G16111294、G16111295、17050203、17050205、2017-1-052、2017-1-053、XLS1705194、XLS1705196、XLS1708293、XLS1708294、XLS1708295、KRT170704、KRT170705、YC17071012、YC17071013、YC17071014、YC17071015、YC17071016、010099-1801001)
大青叶饮片(批号：DQY170701、DQY180104、DQY180105、DQY180106、DQY180109、DQY180111、DQY180115、DQY180116、DQY180117、DQY180119、DQY180120、DQY180121、DQY180122、DQY180123、DQY180124、DQY180126、DQY180127、DQY180128、DQY180129、DQY180130、DQY180301)
大青叶配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：
SY1805001、SY1805002、SY1805003)。
实施例1本发明检测方法用于大青叶标准汤剂高效液相特征图谱的检测
1对照品溶液制备：取尿苷对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含60μg的溶液，即得。取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含20μg的溶液，即得。取腺苷对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含60μg的溶液，即得。取鸟苷对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含60μg的溶液，即得。取紫丁香苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。取异荭草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。取异牡荆苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。取异金雀花素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。
2对照药材溶液制备：取大青叶对照药材1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3供试品溶液制备：取大青叶标准汤剂粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4检测：分别吸取对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为240nm。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000。
Figure BDA0001749081190000051
5结果：供试品特征图谱中应呈现12个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与紫丁香苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.575(峰5)、0.692(峰6)、1.000(峰7S)、1.154(峰8)、1.301(峰9)、1.343(峰10)、1.456(峰11)、1.501(峰12)。
实施例2本发明检测方法用于大青叶配方颗粒高效液相特征图谱的检测
1对照品溶液制备：配制方法同实施例1。
2对照药材溶液制备：配制方法同实施例1。
3供试品溶液制备：取大青叶配方颗粒适量，研细，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。。
4检测：分别吸取对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序同实施例1；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为260nm。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000。
5结果：供试品特征图谱中应呈现12个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与紫丁香苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.567(峰5)、0.686(峰6)、1.000(峰7S)、1.159(峰8)、1.308(峰9)、1.352(峰10)、1.465(峰11)、1.511(峰12)。
实施例3本发明检测方法用于大青叶药材高效液相特征图谱的检测
1对照品溶液制备：配制方法同实施例1。
2对照药材溶液制备：配制方法同实施例1。
3供试品溶液制备：取大青叶药材1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
4检测：分别吸取对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序同实施例1；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为260nm。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000。
5结果：供试品特征图谱中呈现12个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与紫丁香苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。
实施例4本发明检测方法用于大青叶饮片高效液相特征图谱的检测
1对照品溶液制备：配制方法同实施例1。
2对照药材溶液制备：配制方法同实施例1。
3供试品溶液制备：取大青叶饮片1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
4检测：分别吸取对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序同实施例1；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为260nm。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000。
5结果：供试品特征图谱中呈现12个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与紫丁香苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。
实验例1色谱条件与系统适用性试验
流动相选择：考察了3种不同流动相的分离效果，分别为：(1)乙腈-0.1％甲酸梯度洗脱；(2)甲醇-0.1％甲酸梯度洗脱；(3)甲醇-0.1％磷酸梯度洗脱。结果表明，甲醇-0.1％磷酸梯度洗脱条件下色谱峰分离度、理论板数、对称性均更好，故将甲醇-0.1％磷酸梯度洗脱作为大青叶特征图谱测定方法的流动相。
波长选择：在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器分别对腺苷对照品溶液、尿苷对照品溶液、鸟苷对照品溶液、次黄嘌呤对照品溶液、紫丁香苷对照品溶液、异荭草苷对照品溶液、异牡荆苷对照品溶液、异金雀花素对照品溶液、供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液在220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm波长下的色谱图。结果表明，在检测波长为220nm～240nm范围内，色谱峰信息量较大，但是在极性0～20min内色谱峰峰形较差，且基线噪音较大，而270nm～300nm范围内，峰较少，主峰峰面积较小，250nm与260nm波长比较，260nm波长下主峰峰形和对称性更好，故检测波长确定为260nm。
柱温考察：在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察。结果表明，在柱温为30℃时，各特征峰峰形和分离度优于25℃和30℃，故暂定柱温为30℃进行后续考察。
流速考察：在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1ml/min、1.2ml/min时进行了考察。结果表明，流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0ml/min。
实验例2供试品溶液的制备考察
提取方法考察：取大青叶标准汤剂冻干粉(批号DQYBT180401)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果无显著差异。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
提取溶剂考察：取大青叶标准汤剂冻干粉(批号DQYBT180401)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为甲醇、70％甲醇、水时进行考察，溶剂加入量为25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果表明，《中国药典》2015年版大青叶【含量测定】项下以靛玉红为含量测定指标，【薄层鉴别】项下以靛玉红和靛蓝为检测对照品，检测波长289为靛玉红的最大吸收波长，而靛玉红和靛蓝为脂溶性化合物，在提取溶剂考察中，以70％甲醇和甲醇为提取溶剂时，0～30min范围内主峰峰形变差，故以水为提取溶剂。同时，以水为提取溶剂时，靛玉红和靛蓝峰面积极小，故不将靛玉红和靛蓝纳入特征峰的考察中。
提取时间考察：取大青叶标准汤剂冻干粉(批号DQYBT180401)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果表明，在提取时间为20分钟，即可充分提取。故供试品提取时间确定为20分钟。
综上所述，大青叶标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实验例3精密度试验
精密称取大青叶标准汤剂冻干粉(批号：DQYBT180401)1份，按拟定实验方法进行制备，连续进样6次，每次10μl。结果表明，精密度考察中，各特征峰保留时间的RSD在0.01％～0.32％，各特征峰峰面积的RSD在0.16％～1.78％。该仪器精密度良好。
实验例4重复性试验
精密称取大青叶标准汤剂冻干粉(批号：DQYBT180401)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD为0.02％～1.11％，各特征峰相对峰面积的RSD在4.90％～10.66％。该方法重复性良好。
实验例5色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq C18 4.6×250mm 5μm、岛津InertSustain AQ-C18 5μm 250×4.6mm、Agilent Polaris 5C18-A 5μm250×4.6mm、Sepax HP-C18 5μm 250×4.6mm。进行考察。结果表明，运用上述4种色谱柱分别对样品进行检测，只有Agilent ZORBAX SB-Aq C18色谱柱能够对大青叶标准汤剂色谱峰进行较好的分离，故暂定将Agilent ZORBAX SB-Aq C18作为该方法的推荐色谱柱。
实验例6稳定性试验
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、4h、6h、12h、18h、24h时测定，测定结果显示，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.02％～0.99％，特征峰峰面积的RSD在0.38％～4.43％。该方法供试品在24小时内稳定性良好。
实验例7大青叶样品对照图谱的建立
1.大青叶标准汤剂特征图谱的建立
采用最终确定的分析方法，对本品21批大青叶标准汤剂样品(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：DQYBT170801、DQYBT180301、DQYBT180302、DQYBT180303、DQYBT180304、DQYBT180305、DQYBT180306、DQYBT180307、DQYBT180308、DQYBT180309、DQYBT180310、DQYBT180311、DQYBT180312、DQYBT180313、DQYBT180314、DQYBT180315、DQYBT180316、DQYBT180317、DQYBT180318、DQYBT180319、DQYBT180401)进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了12个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰7作为S峰时，21批次大青叶标准汤剂特征峰相对峰面积RSD在21.49％～77.59％，特征峰相对保留时间RSD在0.03％～0.59％，均小于2.0％。最终规定：大青叶标准汤剂供试品特征图谱中应呈现12个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与紫丁香苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.575(峰5)、0.692(峰6)、1.000(峰7S)、1.154(峰8)、1.301(峰9)、1.343(峰10)、1.456(峰11)、1.501(峰12)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批大青叶标准汤剂进行合成，建立了大青叶标准汤剂特征图谱的对照图谱，建立的特征图谱检测方法可以较为准确地整体控制大青叶标注汤剂的质量。
2.大青叶配方颗粒特征图谱的建立
采用拟定的方法对大青叶配方颗粒3批样品(批号：SY1805001；SY1805002；SY1805003)进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积和相对峰高。
结果表明，3批次大青叶配方颗粒特征峰相对峰面积的RSD差异较大，因此不列入质量标准正文，3批次大青叶配方颗粒12个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。最终规定：供试品特征图谱中应呈现12个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与紫丁香苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.567(峰5)、0.686(峰6)、1.000(峰7S)、1.159(峰8)、1.308(峰9)、1.352(峰10)、1.465(峰11)、1.511(峰12)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批次大青叶配方颗粒进行合成，建立了大青叶配方颗粒特征图谱的对照图谱，建立的特征图谱检测方法可以较为准确地整体控制大青叶配方颗粒的质量。
3.大青叶药材特征图谱的建立
采用最终确定的分析方法，对本品21批大青叶药材(四川新绿色药业科技发展有限公司，批号：2017-054、G16111293、G16111294、G16111295、17050203、17050205、2017-1-052、2017-1-053、XLS1705194、XLS1705196、XLS1708293、XLS1708294、XLS1708295、KRT170704、KRT170705、YC17071012、YC17071013、YC17071014、YC17071015、YC17071016、010099-1801001)进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了12个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰7作为S峰时，21批次大青叶标准汤剂特征峰相对峰面积RSD在62.93％～204.13％，差异过大；特征峰相对保留时间RSD在0.09％～1.25％，均小于2.0％。最终规定：大青叶标准汤剂供试品特征图谱中应呈现12个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与紫丁香苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批大青叶药材进行合成，建立了大青叶药材特征图谱的对照图谱，建立的特征图谱检测方法可以较为准确地整体控制大青叶药材的质量。
4.大青叶饮片特征图谱的建立
采用最终确定的分析方法，对本品21批大青叶药材(四川新绿色药业科技发展有限公司，批号：DQY170701、DQY180104、DQY180105、DQY180106、DQY180109、DQY180111、DQY180115、DQY180116、DQY180117、DQY180119、DQY180120、DQY180121、DQY180122、DQY180123、DQY180124、DQY180126、DQY180127、DQY180128、DQY180129、DQY180130、DQY180301)进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了12个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰7作为S峰时，21批次大青叶标准汤剂特征峰相对峰面积RSD在130.92％～397.50％，差异过大；特征峰相对保留时间RSD在0.02％～0.40％，均小于2.0％。最终规定：大青叶标准汤剂供试品特征图谱中应呈现12个特征峰，其中8个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与紫丁香苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批大青叶饮片进行合成，建立了大青叶饮片特征图谱的对照图谱，建立的特征图谱检测方法可以较为准确地整体控制大青叶饮片的质量。
实验例8本发明检测方法用于大青叶药材、饮片、标准汤剂高效液相特征图谱的对比
1对照药材溶液的制备：配制方法同实施例1。
2大青叶药材供试品溶液的制备：取21批次大青叶药材各1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
3大青叶饮片供试品溶液的制备：取21批次大青叶饮片各1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
4大青叶标准汤剂供试品溶液的制备：取21批次大青叶标准汤剂各1.5g，实施例1相同方法配制。
5检测：分别吸取大青叶对照药材溶液，大青叶药材、饮片、标准供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序同实施例1；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为270nm。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000。
6结果：采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)分别将21批大青叶药材特征图谱合成一张大青叶药材对照图谱，21批大青叶饮片特征图谱合成一张饮片对照图谱，21批大青叶标准汤剂特征图谱合成一张标准汤剂对照图谱。将以上大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的对照图谱进行对比。结果表明，大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中均能检出12个特征峰，其物质基础一致，本发明方法可以准确高效地检测出大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，实现整体控制大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒质量的目的。
综上，本发明的大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒高效液相特征图谱的检测方法，能整体控制大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，确保大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒质量的整体稳定，且方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高。

Claims (9)

1.一种大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱的检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：
1)对照品溶液制备：取对照品，溶解，即得对照品溶液；
2)供试品溶液制备：取大青叶药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒，经提取，即得供试品溶液；
3)分别吸取对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：240～270nm；流动相：甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：
Figure FDA0003008691750000011
步骤1)所述对照品为：尿苷、次黄嘌呤、腺苷、鸟苷、紫丁香苷、异荭草苷、异牡荆苷、异金雀花素八种对照品。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述溶解是加入水或甲醇溶解。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述提取是指：加入水，超声提取。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述提取方法如下：
取大青叶药材或饮片，加入16.7倍水，或取大青叶标准汤剂粉末，加入50倍水，或取大青叶配方颗粒研细后粉末，加入25倍水；超声提取20分钟，放冷，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得大青叶标准汤剂或配方颗粒的供试品溶液；所述超声提取的功率为600W、频率为40kHz。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)中，所用色谱柱为AgilentZORBAX SB-Aq C18色谱柱，规格均为4.6mm×250mm，5μm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)中，所述检测波长为260nm。
7.根据权利要求1所述的色谱条件，其特征在于：步骤3)中，所述高效液相色谱的流速为1.0mL/min。
8.根据权利要求1所述的色谱条件，其特征在于：步骤3)中，所述高效液相色谱的柱温为30℃。
9.根据权利要求1所述的色谱条件，其特征在于：步骤3)中，所述高效液相色谱的进样量为10μL。
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