CN108333289B - 一种多组分检测控制蛴螬含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多组分检测控制蛴螬含量的方法，该方法为定量测定蛴螬中尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷成分，检测时色谱条件为，Waters HSS T3色谱柱；检测波长为260 nm；流速为1.0 mL·min‑1；柱温为30℃；进样量为5µL；以乙腈为流动相A，水为流动相B进行梯度洗脱；该测定方法简单、专属性强、分离效果好，精密度、重现性高，稳定性良好，能够有效的为蛴螬药材的质量评价提供科学依据。
Description
技术领域
本发明属于中药材技术领域中质量检测方法，具体涉及了一种多组分检测控制蛴螬含量的检测方法。
背景技术
蛴螬为金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子Holotrichia diomphalia Bates的干燥幼虫，收载于《中药大辞典》下册，第二版3224页，为我国习用药材，具有破瘀、散结、止痛和解毒的功效，外用可治疗丹毒、痔漏、跌打损伤。内服可用于妇女经闭、症瘕。主血瘀经闭，症瘕；折伤瘀痛；痛风；破伤风；喉痹；痈肿；丹毒等。在治疗眼部疾病以及抗肿瘤、提高免疫力等方面具有良好作用。
蛴螬为成方制剂大黄
虫丸、大虻虫丸、干漆丸、山茱萸丸、天浆子丸等的组方用药，蛴螬被列入《中国药典》附录中。现有地方标准收录该药材，这些标准中含量测定采用定氮法测定，为蛋白质通用方法。少量文献报道中，蛴螬采用氨基酸测定进行质量评价，但针对蛴螬的质量控制不具有专属性研究，而且未见有采用高效液相色谱法测定含量的报道。因蛴螬未有完善的质量标准控制方法，地方标准不具有专属性，且国内数十家药品企业生产的中成药中均用到了蛴螬药材，鉴于企业发展与需求，建立蛴螬的质量标准，有助于推行业的规范与发展，为质量评价和控制提供科学、有效的方法和依据。此外，建立蛴螬质量标准对于提升药品质量起到关键作用，具有重要的社会效益和经济效益。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种多组分检测控制蛴螬含量的检测方法，具体包括以下步骤：
步骤1、尿嘧啶对照品溶液的制备：精密称取尿嘧啶对照品6.01mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得尿嘧啶对照品溶液；
步骤2、胞苷对照品溶液的制备：精密称取胞苷对照品5.03mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得胞苷对照品溶液；
步骤3、次黄嘌呤对照品溶液的制备：精密称取次黄嘌呤对照品10.05mg，置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得次黄嘌呤对照品溶液；
步骤4、黄嘌呤对照品溶液的制备：精密称取黄嘌呤对照品10.08mg，置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得黄嘌呤对照品溶液；
步骤5、尿苷对照品溶液的制备：精密称取尿苷对照品5.02mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得尿苷对照品溶液；
步骤6、肌苷对照品溶液的制备：精密称取肌苷对照品5.09mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得肌苷对照品溶液；
步骤7、鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品5.04mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得鸟苷对照品溶液；
步骤8、混合对照品溶液制备：分别精密吸取尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷对照品溶液各1ml，至10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得混合对照品溶液；
步骤9、供试品溶液的制备：称取混匀蛴螬药材细粉(过五号筛)0.5021g，置具塞锥形瓶中，精密加入超纯水50mL，混匀，50℃超声处理30min，放冷，离心机14000rpm，离心5min，0.45μm微孔滤膜滤过即得；
步骤10、高效液相色谱测定：
色谱条件：Waters HSS T3(4.6×250mm，5μm)为色谱柱；检测波长为260nm；流速为1.0mL·min-1；柱温为30℃；进样量为5μL；以乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱；
步骤11、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱，测定，记录40min的色谱图，即得。
本发明的优点和有益效果为：本发明所述方法采用尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷进行含量控制，多组分测定方法可兼具有指纹图谱定性鉴别意义。其测定方法简单、专属性强、分离效果好，精密度、重现性高，稳定性良好，能够有效的为蛴螬药材的质量评价提供科学依据。
附图说明
图1尿嘧啶线性回归方程；
图2胞苷线性回归方程；
图3次黄嘌呤线性回归方程；
图4黄嘌呤线性回归方程；
图5尿苷线性回归方程；
图6肌苷线性回归方程；
图7鸟苷线性回归方程；
图8混合对照品高效液相色谱图；
图9编号为1供试品高效液相色谱图；
其中，图8、图9中1为尿嘧啶、2为胞苷、3为次黄嘌呤、4为黄嘌呤、5为尿苷、6为肌苷、7为鸟苷。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
实施例1
1、仪器与试药
1.1仪器：Ultimate 3000型液相色谱仪(Thermo公司)，二极管阵列检测器(Thermo公司)；eppendorf5424型离心机(德国艾本德股份公司)，MSE125S型十万分之一电子天平(Sartorius公司)，KQ-500DV型超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)，Milli-Q去离子水发生器(密理博公司)。
1.2试药与试剂：尿嘧啶(批号：100469-201302)、次黄嘌呤(批号：140661-200903)、黄嘌呤(批号：140662-200802)、尿苷(批号：110887-200202)、肌苷(批号：140669-201305；含量为99.1％)、鸟苷(批号：111977-201501；含量为93.6％)，均购自中国食品药品检定研究院；胞苷(批号：101511354，西格玛奥德里奇有限公司)；乙腈为色谱纯；水为超纯水；蛴螬样品(编号为1～10，经鉴定为正品)。
1.3方法与结果：
步骤1、尿嘧啶对照品溶液的制备：精密称取尿嘧啶对照品6.01mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得尿嘧啶对照品溶液；
步骤2、胞苷对照品溶液的制备：精密称取胞苷对照品5.03mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得胞苷对照品溶液；
步骤3、次黄嘌呤对照品溶液的制备：精密称取次黄嘌呤对照品10.05mg，置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得次黄嘌呤对照品溶液；
步骤4、黄嘌呤对照品溶液的制备：精密称取黄嘌呤对照品10.08mg，置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得黄嘌呤对照品溶液；
步骤5、尿苷对照品溶液的制备：精密称取尿苷对照品5.02mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得尿苷对照品溶液；
步骤6、肌苷对照品溶液的制备：精密称取肌苷对照品5.09mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得肌苷对照品溶液；
步骤7、鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品5.04mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得鸟苷对照品溶液；
步骤8、混合对照品溶液制备：分别精密吸取尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷对照品溶液各1ml，至10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得混合对照品溶液；
步骤9、供试品溶液的制备：称取混匀蛴螬药材细粉(过五号筛)0.5021g，置具塞锥形瓶中，精密加入超纯水50mL，混匀，50℃超声处理30min，放冷，离心机14000rpm，离心5min，0.45μm微孔滤膜滤过即得；
步骤10、高效液相色谱测定：
色谱条件：Waters HSS T3(4.6×250mm，5μm)为色谱柱；检测波长为260nm；流速为1.0mL·min-1；柱温为30℃；进样量为5μL；以乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱；
步骤11、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱，测定，记录40min的色谱图，即得。
1.4方法学考查
1.4.1线性关系：精密称定尿嘧啶3.00mg、胞苷1.94mg、次黄嘌呤10.00mg、黄嘌呤10.01mg、尿苷1.97mg、肌苷1.23mg、鸟苷1.40mg置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，混匀；配置成浓度为尿嘧啶30μg·mL-1；胞苷19.4μg·mL-1；次黄嘌呤100μg·mL-1；黄嘌呤100.1μg·mL-1；尿苷19.7μg·mL-1；肌苷12.3μg·mL-1；鸟苷14μg·mL-1的混合溶液。精密吸取混合对照品溶液0.2μL、1μL、5μL、10μL、20μL分别注入液相色谱仪，按照上述色谱条件对样品进行测定，以峰面积为纵坐标(y)，进样质量为横坐标(X)，峰面积对质量作线性回归方程，得回归方程，结果见表1及图1至图7。
表1 7种被测成分的线性范围
上述结果表明，7种被测成分在各自线性范围内呈良好的线性关系，且尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷均具有良好的线性关系。
1.4.2精密度试验：取混合对照品溶液，按照上述色谱条件连续进样6次，测定其峰面积，结果见表2；结果表明仪器精密度良好。
表2精密度试验
1.4.3稳定性试验：取同一供试品溶液(编号1)，按照上述色谱条件测定，分别于配制后的0、3、9、12、15、20h，精密吸取5μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，结果尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷和鸟苷峰面积的RSD(n＝6)分别在0.20％和1.4％之间，结果表明供试品溶液在20h内稳定。，由实验数据说明样品溶液在18h内基本稳定，该方法稳定性良好，结果见表3。
表3稳定性试验结果
1.4.4重复性试验：取样品粉末6份(编号1)，分别按照上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果测得的各份尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷和鸟苷含量的RSD别在0.20％和1.7％之间，实验结果表明重复性良好，结果见表4。
表4重复性试验结果
1.4.5回收率试验：取已知含量的供试品粉末6份(编号1)，每份约0.25g，置50ml量瓶中，精密加入与其含有量相应对照品溶液适量，加水定容至刻度，分别按照供试品制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率(n＝6)，计算其加标回收率,结果见表5。
表5回收率试验结果
1.5样品含量测定
按上述色谱条件测定十批供试品溶液，结果每克蛴螬中含尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷和鸟苷见表6。
表6样品含量测定结果
综上，本发明所建立的含量测定方法，具有精密度好、重复性、稳定性良好的特点，可全面、有效地用于控制与评价药材的质量。
Claims (1)
1.一种多组分检测控制蛴螬含量的方法，其特征在于：具体操作步骤如下：
步骤1、尿嘧啶对照品溶液的制备：精密称取尿嘧啶对照品6.01mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得尿嘧啶对照品溶液；
步骤2、胞苷对照品溶液的制备：精密称取胞苷对照品5.03mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得胞苷对照品溶液；
步骤3、次黄嘌呤对照品溶液的制备：精密称取次黄嘌呤对照品10.05mg，置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得次黄嘌呤对照品溶液；
步骤4、黄嘌呤对照品溶液的制备：精密称取黄嘌呤对照品10.08mg，置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得黄嘌呤对照品溶液；
步骤5、尿苷对照品溶液的制备：精密称取尿苷对照品5.02mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得尿苷对照品溶液；
步骤6、肌苷对照品溶液的制备：精密称取肌苷对照品5.09mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得肌苷对照品溶液；
步骤7、鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品5.04mg，置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得鸟苷对照品溶液；
步骤8、混合对照品溶液制备：分别精密吸取尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷对照品溶液各1ml，置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得混合对照品溶液；
步骤9、供试品溶液的制备：称取混匀的蛴螬药材细粉0.5021g，置具塞锥形瓶中，精密加入超纯水50mL，混匀，50℃超声处理30min，放冷，离心机14000rpm，离心5min，0.45μm微孔滤膜滤过即得；
步骤10、高效液相色谱测定：
色谱条件：Waters HSS T3为色谱柱；检测波长为260nm；流速为1.0mL·min-1；柱温为30℃；进样量为5μL；以乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱；
步骤11、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱，测定，记录40min的色谱图，即得。
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