CN110967422A - 一种益气补血片中黄芪甲苷含量测定方法 - Google Patents

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赵磊
昝珂
王路宏
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Abstract

本发明涉及一种益气补血片中黄芪甲苷含量测定方法。制备方法，步骤1对照品溶液的配制，步骤2含量测定供试品溶液的制备，步骤3色谱条件，步骤4测定。本发明建立的样品前处理方法简化操作步骤，采用高效液相色谱法，流动相为乙腈‑水，采用十八烷级硅胶色谱柱，蒸发光散射检测器。所述方法与现有技术相比，方法简单、准确、重现性和稳定性好，检测成本低，检测结果分析快速，可更有效地控制该药的黄芪甲苷含量。

Description

一种益气补血片中黄芪甲苷含量测定方法
技术领域
本发明涉及益气补血片质量标准检测方法，具体涉及一种益气补血片中黄芪甲苷的液相色谱分析方法。
背景技术
益气补血片处方是由黄芪、人参、当归、大枣、制何首乌、陈皮等组成，具有益气补血，健脾滋肾。用于原发性血小板减少性紫癜属气血两虚证候者，症见皮下散在出血点，或兼见齿衄、鼻衄、神疲乏力，头晕目眩，心悸气短，食少纳呆，面色苍白，舌淡，脉细无力等。黄芪具有补气升阳，固表止汗，生津养血。用于气虚乏力，表虚自汗，气虚水肿，内热消渴，血虚萎黄等作用，黄芪中的主要成分黄芪甲苷能增强机体免疫力、提高机体的抗病能力。而黄芪为益气补血片的君药。因此，检测黄芪甲苷的含量能有效的控制益气补血片的质量。
益气补血片收载于《国家药品标准新药转正标准第四十二册》第36页，该标准的含量测定方法为取本品20片，除去糖衣，研细，称取约2g，精密称定，置索氏提取器中，加氯仿50ml，回流提取2小时，弃去氯仿液，残渣挥干溶剂，加甲醇60ml，回流提取至无色。提取液回收甲醇至干，残渣加水20ml，微热使溶解，以水饱和的正丁醇提取5次，每次30ml，合并正丁醇提取溶液，用氨试液提取3次，每次50ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml，加热使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去40％乙醇洗脱液，继以70％乙醇洗脱60ml，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录ⅥB)试验，精密吸取供试品溶液6μl，对照品溶液2μl与4μl，分别交叉点于同一高效硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13:6:2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录ⅥB薄层扫描法)进行扫描，波长：λs＝530nm，λR＝700nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。
由于中成药处方组成不同，化学成分复杂，导致测定方法不同，而黄芪甲苷分离测定均操作较复杂。而益气活血片质量标准中的测定过程操作繁琐，分离黄芪甲苷经过多次提取，过柱色谱，采用薄层展开，进行双薄层扫描测定。操作过程复杂，测定误差会加大，且双薄层扫描测定，稳定性及重现性差。
发明内容
本发明的目的是要提供一种益气补血片中黄芪甲苷含量测定方法，该方法简单、准确、重现性和稳定性好，检测成本低，检测结果分析快速。
本发明的技术方案：
(1)对照品溶液的配制
取5.30mg的黄芪甲苷对照品，精密称重，置10ml容量瓶中，加甲醇溶液，稀释至刻度，得对照品溶液，备用。
(2)含量测定供试品溶液制备
取本品20片，除去糖衣，研细，精密称取2.0094g，置索氏提取器中，加入甲醇100-150ml，加热回流提取3小时，提取液采用旋转蒸发仪旋干，残渣加水30ml，超声5分钟使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次40ml，正丁醇液采用旋转蒸发仪旋干，残渣中精密加入甲醇10ml振摇使溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)色谱条件
流动相为乙腈-水(35:65)；流速1.0ml/min；色谱柱：sepax BR-C18，4.6×250mm 5μm；检测器：蒸发光散射检测器；柱温：30℃；进样量：10μl。
(4)测定：精密吸取对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录20min的色谱图，以标准曲线法对数方程计算，即得。
本发明的有益效果：
本发明建立的样品前处理方法简化操作步骤，采用高效液相色谱法，流动相为乙腈-水，采用十八烷级硅胶色谱柱，蒸发光散射检测器。所述方法与现有技术相比，方法简单、准确、重现性和稳定性好，检测成本低，检测结果分析快速，可更有效地控制该药的黄芪甲苷含量。
附图说明
图1黄芪甲苷对照品液相色谱图。
图2益气补血片样品液相色谱图。
图3益气补血片阴性样品液相色谱图。
图4黄芪甲苷标准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
仪器与试药
仪器：安捷伦1260高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器；色谱柱：sepax BR-C18，4.6×250mm 5μm；电子天平BT125D型万分之一分析天平。
试药：黄芪甲苷对照品(含量为96.9％；批号110781-201717，中国食品药品检定研究院)；益气补血片(采用不同厂家市售益气补血片，规定样品为A、B、C三批)；按照处方成分，除去黄芪药材自制阴性样品。
实施案例
(1)对照品溶液的配制
取5.30mg的黄芪甲苷对照品，精密称重，置10ml容量瓶中，加甲醇溶液，稀释至刻度，得对照品溶液，备用。
(2)含量测定供试品溶液制备
取本品20片，除去糖衣，研细，精密称取2.0094g，置索氏提取器中，加入甲醇100-150ml，加热回流提取3小时，提取液采用旋转蒸发仪旋干，残渣加水30ml，超声5分钟使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次40ml，正丁醇液采用旋转蒸发仪旋干，残渣中精密加入甲醇10ml振摇使溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)色谱条件
流动相为乙腈-水(35:65)；流速1.0ml/min；色谱柱：sepax BR-C18，4.6×250mm 5μm；检测器：蒸发光散射检测器；柱温：30℃；进样量：10μl
(4)测定：精密吸取对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录20min的色谱图，以标准曲线法对数方程计算，即得。
方法学考查
线性关系：分别精密吸取浓度为513.57μg/ml的黄芪甲苷对照品溶液2μl、5μl、10μl、15μl、20μl。注入液相色谱仪，按照步骤(4)色谱条件进行测定，以lg峰面积为纵坐标，lg体积为横坐标，作线性方程。得线性方程结果见表1。
表1线性关系方程
成分 回归方程 相关系数 线性范围(μg)
黄芪甲苷 y＝1.5472x+2.1482 0.9990 1.02～10.27
上述结果表明，黄芪甲苷在1.02～10.27μg范围内具有良好的线性关系。见附图4。
精密度试验：精密吸取黄芪甲苷对照品溶液进样量为5μl，连续进样6次，测定其峰面积，RSD分别为0.76％(n＝6)，结果见表2。结果表明仪器精密度良好。
表2精密度试验结果
Figure BDA0002282929830000041
稳定性试验：取同一供试品溶液，按照上述色谱条件分别做0、3、6、9和15h的色谱图，测定其稳定性，黄芪甲苷的峰面积的RSD为1.06％，由实验数据说明样品溶液在15h内基本稳定，该方法稳定性良好，结果见表3。
表3稳定性试验结果
Figure BDA0002282929830000042
重复性试验：取同一批号的供试品溶液6份，并依照上述色谱条件测定，结果黄芪甲苷的RSD为1.6％。表明方法重复性良好，结果见表4。
表4重复性试验结果
Figure BDA0002282929830000043
Figure BDA0002282929830000051
回收率试验：精密吸取已知含量的供试品6份，每份约2g(批号为A，取样量按约含黄芪甲苷0.636mg/g)，分别依次精密加入浓度为0.51mg/ml黄芪甲苷甲醇溶液2.5ml，按供试品制备方法制备，测定方法同供试品测定方法操作，计算其加标回收率,结果见表5。
表5回收率试验结果
Figure BDA0002282929830000052
上述结果表明，6份黄芪甲苷的总回收率为96.99％，RSD值为2.0％，该方法准确率高。
样品含量测定：按上述色谱条件测定三批供试品溶液，并同时按照原标准含量测定方法进行测定，结果测定样品中含黄芪甲苷值，见表6。
表6三批样品含量测定结果
序号 改进方法的黄芪甲苷(mg/片) 原方法的黄芪甲苷(mg/片)
A 0.157 0.152
B 0.101 0.098
C 0.134 0.130
通过数据结果说明，改进的方法测定结果与原方法结果接近，说明修改方法可行，操作简单。

Claims (1)

1.一种益气补血片中黄芪甲苷含量测定方法，其特征在于：制备方法如下:
(1)对照品溶液的配制
取5.30mg的黄芪甲苷对照品，精密称重，置10ml容量瓶中，加甲醇溶液，稀释至刻度，得对照品溶液，备用；
(2)含量测定供试品溶液制备
取本品20片，除去糖衣，研细，精密称取2.0094g，置索氏提取器中，加入甲醇100-150ml，加热回流提取3小时，提取液采用旋转蒸发仪旋干，残渣加水30ml，超声5分钟使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次30ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，每次40ml，正丁醇液采用旋转蒸发仪旋干，残渣中精密加入甲醇10ml振摇使溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)色谱条件
流动相为乙腈-水(35:65)；流速1.0ml/min；色谱柱：sepax BR-C18，4.6×250mm 5μm；检测器：蒸发光散射检测器；柱温：30℃；进样量：10μl；
(4)测定：精密吸取对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录20min的色谱图，以标准曲线法对数方程计算，即得。
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