CN110286186B - 一种检测新癀片指纹图谱的方法及新癀片标准指纹图谱和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测新癀片指纹图谱的方法及新癀片标准指纹图谱和应用。根据本发明的检测新癀片指纹图谱的方法用配备有蒸发光散射检测器(ELSD)的高效液相色谱仪进行检测，在所选择的色谱条件下所得色谱图的峰数量较多，灵敏高，基线平稳、噪音小，响应敏锐，响应值大，分离度好。此外，空白溶剂对供试品溶液的测试不存在干扰，专属性良好。方法的精密度、稳定性和重现性良好。采用本发明的检测新癀片指纹图谱的方法得到了建立新癀片标准指纹图谱的方法和新癀片标准指纹图谱，其可以用于进行新癀片的质量控制。

Description

一种检测新癀片指纹图谱的方法及新癀片标准指纹图谱和 应用

技术领域

本发明属于中药分析领域，涉及一种检测新癀片指纹图谱的方法、包含该方法的建立标准指纹图谱的方法、新癀片标准指纹图谱和应用。

背景技术

新癀片由肿节风、三七、人工牛黄、猪胆粉、肖梵天花、珍珠层粉、牛角浓缩粉、红曲和吲哚美辛等组成，功效为清热解毒、活血化瘀、消肿止痛，主要用于热毒瘀血所致的咽喉肿痛、牙痛、痹痛、肋痛、黄疸、无名肿毒等。现收载于《中国药典》2015年版中，采用高效液相色谱法测定异嗪皮啶和吲哚美辛含量。

近年，随着监管部门对药品质控提出更高要求，要求生产厂家严格控制产品批间稳定性，因此采用有效的质量控制方法尤为重要。

中药指纹图谱技术因可全面标示中药主要化学成分的特性及其比例的特点，越来越多用于中药的质量控制。色谱法是分析化学领域中发展较快，应用较广泛的分析方法之一，也是中指纹图谱最基本的技术。常用的色谱法有薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法，其中高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)具有应用范围广、分析速度快、灵敏度高等优点，是目前研究中药指纹图谱应用最广泛的方法。蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector，ELSD)是一种通用型质量检测器，可弥补在HPLC中应用最广的紫外检测器对检测物质必须具有吸收紫外光的生色团的要求。ELSD作为一种浓度型检测器，在无紫外或紫外末端吸收的未知化合物的纯度检测过程中，显示出极大的优越性。

新癀片的主要成分中，三七的主要化学成分是人参皂苷、三七皂苷、黄酮、挥发油、多糖、氨基酸等化合物，肿节风的主要化学成分是倍半萜、香豆素、黄酮、皂苷等成分，人工牛黄的主要化学成分是胆汁色素类、胆汁酸类、氨基酸和蛋白质类、微量元素类，猪胆中主要含有胆汁酸类、胆色素类、氨基酸与蛋白类、脂类及无机物等成分，地桃花中主要含有氨基酸和蛋白质、糖类、皂苷、鞣质、酚类、有机酸类、黄酮类等成分，珍珠层粉主要由95％左右的碳酸钙和5％左右的蛋白质组成，水牛角浓缩粉主要成分包括蛋白质类、多肽类、氨基酸类、核苷类、氨基己糖等，红曲中主要的功效成分Monacolin K、γ-氨基丁酸、多不饱和脂肪酸、黄酮类、卵磷脂等。由此可见新癀片化学成分多，胆酸类、皂苷类、蛋白质等成分占主要部分，对其进行标准指纹图谱的研究非常困难。因此，目前还没有关于检测新癀片指纹图谱的方法，建立新癀片标准指纹图谱的方法以及采用其进行质量控制的研究。

发明内容

为了更全面有效控制新癀片的质量，本发明人经仔细研究采用HPLC-ELSD法并对提取溶剂、提取时间、色谱条件、色谱柱、气体压力和漂移管温度等条件进行研究，得到了一种检测新癀片指纹图谱的方法，并由此得到了建立新癀片标准指纹图谱的方法和新癀片标准指纹图谱，其可以用于进行新癀片的质量控制，由此完成了本发明。

本发明一方面提供了一种检测新癀片指纹图谱的方法，所述方法用配备有蒸发光散射检测器(ELSD)的高效液相色谱仪进行检测，色谱条件如下：

色谱柱：

STAR LP RP-18 endcapped(5μm,250×4.6mm)；

流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，

梯度洗脱：0-29min，21％-35％A；29-68min，35％-54％A；68-83min，54％-62％A；83-88min，62％-100％A；88-120min，100％A；

流速：0.4～0.8ml/min，优选0.5ml/min；

柱温：30～50℃，优选40℃；

进样量：10μl；

检测器条件：气体压力：20～40psi，优选30psi；漂移管温度：50～60℃，优选55℃；喷雾方式选自冷却至加热50％，例如10％加热、20％加热、30％加热、40％加热、50％加热等，优选加热40％；以及增益值：5-20，优选为10。

本发明中，梯度洗脱中的百分数为体积百分数，例如，21％指的是21体积％。

本发明中，检测器条件中的气体压力有时也称作喷雾器气体流量或喷雾器流量。

检测新癀片指纹图谱的方法中，用于进行检测的新癀片供试品溶液可以如下配制：将新癀片细粉和二氯甲烷-甲醇-水混合溶液加入具塞容器中，称重后进行超声处理，放冷后再称定重量，用同种溶剂补足减失的重量，滤过后得到供试品溶液。

本发明另一方面提供了一种建立新癀片标准指纹图谱的方法，所述方法包括：

(1)供试品溶液配制：

将新癀片细粉和二氯甲烷-甲醇-水混合溶液加入具塞容器中，称重后进行超声处理，放冷后再称定重量，用同种溶剂补足减失的重量，滤过后得到供试品溶液；

(2)对照品溶液的配制：

取三七总皂苷、甘氨猪去氧胆酸、胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、吲哚美辛加甲醇制成对照品溶液；

(3)HPLC检测

将上述(1)和(2)的供试品溶液和对照品溶液用根据本发明的检测新癀片指纹图谱的方法检测得到供试品指纹色谱图和对照品指纹色谱图；

(4)生成标准指纹图谱

基于供试品指纹色谱图生成标准指纹图谱，选择新癀片中主要成分且分离度较好的色谱峰作为特征峰并确定为共有峰；

(5)共有峰的鉴定及归属

对新癀片指纹图谱中的共有峰进行归属及鉴定。

在上述方法中，对于基于供试品指纹色谱图生成标准指纹图谱的方法没有特别限定，可以采用本领域中的常规方法。例如，可以通过将测定的新癀片供试品色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.130723版本)，将供试品色谱图之一设置为参照图谱，标准图谱生成方法例如为中位数法，同时采用例如多点校正法来建立新癀片标准指纹图谱。

在上述方法中，共有峰的鉴定及归属可以通过采用阴性样品对照、单味药材及对照品溶液的色谱图的比对完成。

在根据本发明的建立新癀片标准指纹图谱的方法中，对于用于建立标准指纹图谱的供试品数目没有特别限制，本领域技术人员可以容易地选择适合的供试品数目。一般而言，供试品数目可以为5个以上，或者10个以上，例如15个，上限例如是30个以下，20个以下等。

在上述新癀片供试品溶液的配制过程中，对于新癀片细粉的粒度没有特别限制，但是优选其为可以至少过中国药典中规定的三号筛的粒度，例如，新癀片细粉可以过三号筛或四号筛。所述二氯甲烷-甲醇-水混合溶液中三种成分的体积比可以为二氯甲烷:甲醇:水＝6～1:1～5:1，例如4:2:1、6:4:1、4:4:1、2:4:1等，更优选2:4:1。超声处理时间没有特别限制，只要实现充分萃取即可，例如可以为10～40分钟，优选20分钟。新癀片细粉与二氯甲烷-甲醇-水混合溶液的固液比，以重量/体积计，在1:30～100之间，优选为1:40。

在一个实施方式中，供试品溶液如下配制：取过三号筛的新癀片细粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积比2:4:1的二氯甲烷-甲醇-水混合溶液20ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用体积比2:4:1的二氯甲烷-甲醇-水混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。

在上述对照品溶液的配制过程中，对于对照品溶液的浓度没有特别限制，但是优选其中各成分的含量比与供试品溶液大体相当。在一个实施方式中，对照品溶液如下配制：取三七总皂苷、甘氨猪去氧胆酸、胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、吲哚美辛适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中含三七皂苷R175.70μg，人参皂苷Rg1 269.05μg，人参皂苷Re37.85μg，人参皂苷Rb1 283.37μg，甘氨猪去氧胆酸391.04μg，人参皂苷Rd 77.75μg，胆酸78.92μg，甘氨鹅去氧胆酸270.09μg，猪去氧胆酸60.82μg，吲哚美辛560.84μg的混合溶液。

本发明另一方面提供了一种新癀片标准指纹图谱，其包括15个共有峰，其中，以13号峰为参照，各峰的相对保留时间如下：

其中，各共有峰相对保留时间RSD值不大于1％，优选不大于0.5％。

经比对，上述13号峰为吲哚美辛，2号峰为三七皂苷R1，3号峰为人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，4号峰为人参皂苷Rb1，6号峰为甘氨猪去氧胆酸，7号峰为人参皂苷Rd，10号峰为胆酸，11号峰为甘氨鹅去氧胆酸，12号峰为胆酸；且2、3、4及7号峰来源于三七，5、6、8、9、11、12及14号来源于猪胆，10和12号峰来源于人工牛黄。

在实施方式中，上述新癀片标准指纹图谱采用根据本发明的建立新癀片标准指纹图谱的方法得到。

在实施方式中，根据本发明的新癀片标准指纹图谱大体上如图18所示。

本发明再一方面提供了一种检测新癀片产品质量的方法，其包括：

(1)使用根据本发明的检测新癀片指纹图谱的方法得到新癀片产品的指纹图谱；

(2)将所得新癀片产品的指纹图谱与标准指纹图谱进行对比，若相似度大于0.9，则说明该新癀片产品质量合格。

在实施方式中，上述将所得新癀片产品的指纹图谱与标准指纹图谱进行对比可以通过将新癀片产品的指纹图谱和新癀片标准指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行比较，计算样品图谱与标准图谱之间的相似度。

如实验结果所证实的，根据本发明的检测新癀片指纹图谱的方法，所得到的色谱图中，峰数量较多，灵敏高，基线平稳、噪音小，响应敏锐，响应值大，分离度好。此外，空白溶剂对供试品溶液的测试不存在干扰，专属性良好。方法的精密度、稳定性和重现性良好。

附图说明

图1是显示采用不同提取溶剂萃取新癀片粉末所得供试品溶液的液相色谱图，其中，1、水；2、甲醇；3、70％甲醇水溶液；4、乙醇；5、乙腈；6、DMSO；7、正丁醇；8、二氯甲烷-甲醇(2:1，V:V)，9、二氯甲烷-甲醇-水(4:2:1，V:V:V)。

图2是显示采用不同提取溶剂体积比例萃取新癀片粉末所得供试品溶液的液相色谱图，其中，1、二氯甲烷-甲醇-水6:4:1；2、二氯甲烷-甲醇-水4:4:1；3、二氯甲烷-甲醇-水2:4:1。

图3是显示ELSD检测器的不同气体流量(或称气体压力)下对同一供试品溶液测定的液相色谱图，其中，1、50psi，2、40psi，3、30psi，4、20psi。

图4是显示ELSD检测器的不同漂移管温度下对同一供试品溶液测定的液相色谱图，其中，1、45℃，2、50℃，3、55℃，4、60℃。

图5是显示ELSD检测器的不同喷雾器温度下对同一供试品溶液测定的液相色谱图，其中，1、冷却，2、40％加热，3、50％加热，4、60％加热，5、70％加热，6、80％加热。

图6是显示ELSD检测器的不同增益因子下对同一供试品溶液测定的液相色谱图，其中，1、10，2、20，3、30，4、40。

图7是显示采用不同流动相对同一供试品溶液测定的液相色谱图，其中，1、0.1％甲酸水溶液-乙腈；2、水-乙腈；3、水-甲醇；4、0.1％甲酸水溶液-甲醇；5、0.1％甲酸水溶液-甲醇；6、0.1％醋酸水溶液-甲醇；7、0.1％醋酸水溶液-乙腈。

图8是显示采用不同流动相对同一供试品溶液测定的液相色谱图，其中，1、0.1％甲酸水溶液-乙腈；2、0.1％甲酸水溶液-甲醇；3、0.1％醋酸水溶液-甲醇。

图9是显示在不同柱温下对同一供试品溶液测定的液相色谱图，其中，1、40℃，2、35℃，3、30℃，4、25℃，5、室温。

图10是显示采用不同超声时间处理新癀片粉末时所得供试品溶液的液相色谱图，其中，1、40min，2、30min，3、20min，4、10min。

图11是显示采用不同提取溶剂量处理新癀片粉末时所得供试品溶液的液相色谱图，其中，1、1:100；2、1:80；3、1:60；4、1:40。

图12是显示采用不同梯度洗脱系统对同一供试品溶液测定的液相色谱图。

图13是显示专属性试验结果的图，其中，A空白溶剂，B样品。

图14是显示精密度试验结果的图。

图15是显示稳定性试验结果的图。

图16是显示重现性试验结果的图。

图17是新癀片15批的HPLC指纹图谱。

图18是新癀片的HPLC标准指纹图谱。

图19是新癀片及混合对照品的HPLC色谱图，其中，A新癀片样品，B混合对照品。

图20是显示在不同流速下对同一供试品溶液测定的液相色谱图，其中，1、1.0ml/min，2、0.8ml/min，3、0.5ml/min。

具体实施方式

1、仪器与试药

ME1002E电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、KQ-600DE数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)、Waterse2695高效液相色谱仪(沃特世有限公司)，Waters 2424蒸发光散射检测器(沃特世有限公司)。

三七总皂苷(批号110870-201603，含量以三七皂苷R₁7.4％，人参皂苷Rg₁ 26.3％，人参皂苷Re 3.7％，人参皂苷Rb₁ 27.7％，人参皂苷Rd 7.6％计，中国食品药品检定研究院)，胆酸(批号100078-201415，中国食品药品检定研究院)，猪去氧胆酸(批号100087-201411，中国食品药品检定研究院)，吲哚美辛(批号100258-200904，中国食品药品检定研究院)，甘氨猪去氧胆酸(批号070061-201710，上海奈启生物科技)，甘氨鹅去氧胆酸(批号23981，MedChemexpress)。

2、液相条件

色谱柱：

STAR LP RP-18 endcapped(5μm,250×4.6mm)；流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)，梯度洗脱：0-29min，21％-35％A，29-68min。35％-54％A，68-83min，54％-62％A，83-88min，62％-100％A，88-120min，100％A；流速：0.5ml/min；柱温：40℃；进样量：10μl；检测器：2424型ELSD；气体压力：30psi；漂移管温度：55℃；喷雾方式：加热，40％；增益值：10。

以下实验中，除了所选择的条件和具体列出的条件之外，其他液相条件与这里相同。

3、溶液配制

供试品溶液配制：

取新癀片粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入二氯甲烷-甲醇-水(2:4:1)混合溶液20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用二氯甲烷-甲醇-水(2:4:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液进样分析。

对照品溶液的配制：

取三七总皂苷、甘氨猪去氧胆酸、胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、吲哚美辛适量，精密称定吗，加甲醇制成每1ml中含三七皂苷R₁75.70μg，人参皂苷Rg₁ 269.05μg，人参皂苷Re 37.85μg，人参皂苷Rb₁ 283.37μg，甘氨猪去氧胆酸391.04μg，人参皂苷Rd 77.75μg，胆酸78.92μg，甘氨鹅去氧胆酸270.09μg，猪去氧胆酸60.82μg，吲哚美辛560.84μg的混合溶液。

以下实验中，除了所选择的条件和具体列出的条件之外，其他溶液配制条件与这里相同。

4、提取溶剂考察

供试品溶液配制：

取新癀片粉末(批号161211，过四号筛)0.5g，精密称定，共9份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入水、甲醇、70％甲醇、乙醇、乙腈、二甲基亚砜、水饱和二氯甲烷-甲醇(2：1，V/V)、二氯甲烷-甲醇-水(4:2:1，V/V/V)、水饱和正丁醇等9份不同溶剂25ml，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，得供试品溶液。

分别精密吸取上述供试品溶液各10μl注入液相色谱仪进行测定，具体液相条件：色谱柱：

STAR LP RP-18 endcapped(5μm,250×4.6mm)；流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱：0-150min，5％-100％A，150-160min,100％A，流速：1.0ml/min；柱温：25℃；进样量：10μl；检测器：2424型ELSD；气体压力：40psi；漂移管温度：55℃；喷雾方式：加热，60％；增益值：10。

结果见图1。结果表明，以二氯甲烷-甲醇-水混合溶液作为提取溶剂时，新癀片的峰较多，且峰面积较大。

此外，除了溶剂分别为二氯甲烷-甲醇-水(V/V/V)比例为6:4:1、4:4:1、2:4:1之外，以与上述方法相同的过程制备供试品溶液并用液相色谱仪进行测定，结果见图2。

结果表明当溶剂为二氯甲烷-甲醇-水(2:4:1，V/V/V)时，峰数量较多，且峰响应较大。故选用二氯甲烷-甲醇-水(2:4:1，V/V/V)混合溶剂作为提取溶剂。

接下来对检测器参数进行考察。Waters 2424型ELSD检测器的参数主要有喷雾器气体流量(或称气体压力)、漂移管温度、喷雾器温度(喷雾方式)、增益。

5、喷雾器气体流量考察

供试品溶液制备：

取新癀片粉末约0.5g(批号161211，过四号筛)，精密称定，0.4981g，置具塞锥形瓶中，精密加入二氯甲烷-甲醇-水(2:4:1)混合溶液20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用二氯甲烷-甲醇-水(2:4:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，得到供试品溶液。

除了喷雾器气体流量分别为20、30、40、50psi以外，在同一液相条件下对上述供试品溶液用液相色谱仪进行测定，以考察喷雾器气体流量对色谱峰的影响。具体液相条件：色谱柱：

STAR LP RP-18 endcapped(5μm,250×4.6mm)；流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)，梯度洗脱：0-150min，5％-100％A，150-160min,100％A，流速：1.0ml/min；柱温：25℃；进样量：10μl；检测器：2424型ELSD；漂移管温度：55℃；喷雾方式：加热，60％；增益值：10。

结果见图3。结果表明流量越小，响应越敏锐，但基线压力响应增加，最佳喷雾器流量为30psi。

6、漂移管温度考察

供试品溶液的制备与上述5中相同。

除了喷雾器气体流量为30psi，漂移管温度分别为45、50、55、60℃以外，按照5.喷雾器气体流量中所述用液相色谱仪进行测定，结果见图4。

结果表明，当漂移管温度为45℃时并不能保证溶剂的完全蒸发，图谱基线诡异。随着温度升高，基线噪音减小，但当温度达到60℃时，保留时间100分钟后出现的色谱峰响应明显降低。因此，确定最佳的漂移管温度为55℃。

7、喷雾器温度考察

供试品溶液的制备与上述5中相同。

除了喷雾器气体流量为30psi，漂移管温度为55℃，喷雾方式分别为冷却、加热40％、加热50％、加热60％、加热70％、加热80％以外，按照5.喷雾器气体流量中所述用液相色谱仪进行测定，结果见表1和图5。

表1喷雾方式考察

结果表明，当喷雾器温度越高，基线噪音越大，但响应越高，当喷雾方式为加热40％时，基线噪音小，响应值大。因此选择最佳的喷雾方式为加热40％。

8、增益优化

供试品溶液的制备与上述5中相同。

增益值表示增益因子，使得实际光散射信号成正比的增加，并以此对检测器灵敏度进行全面控制。

除了喷雾器气体流量为30psi，漂移管温度为55℃，喷雾方式为加热40％以外，分别在增益信号为10、20、30、40的条件下按照5.喷雾器气体流量中所述用液相色谱仪进行测定，结果见图6。

结果显示，4种增益条件下基线噪音(Mv)分别为5.684、10.545、16.145、20.008。考虑到噪音和色谱峰信号同时放大，为了确保峰灵敏高及基线噪音小，选择最佳的增益值为10。

接下来对色谱条件进行考察。

9、流动相考察

供试品溶液的制备与上述5中相同。

除了分别以0.1％甲酸水溶液-乙腈、水-乙腈、水-甲醇、0.1％甲酸水溶液-甲醇、0.1％甲酸水溶液-乙腈、0.1％醋酸水溶液-甲醇、0.1％醋酸水溶液-乙腈作为流动相系统并采用下面所给出的梯度以外，在同一液相条件下对上述供试品溶液进行液相色谱仪测定，结果如图7。具体液相条件：色谱柱：

STAR LP RP-18 endcapped(5μm,250×4.6mm)；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；进样量：10μl；检测器：2424型ELSD；漂移管温度：55℃；喷雾方式：加热40％；喷雾器流量：30psi；增益值：10。

图7中的流动相系统为：1、0.1％甲酸水溶液-乙腈；2、水-乙腈；3、水-甲醇；4、0.1％甲酸水溶液-甲醇；5、0.1％甲酸水溶液-甲醇6、0.1％醋酸水溶液-甲醇；7、0.1％醋酸水溶液-乙腈；

梯度分别为：

对于流动相系统1-4和7：0-90min，有机相(甲醇或乙腈)5％-62％；90-110min，有机相(甲醇或乙腈)62％-100％；

对于流动相系统5-6：0-70min，有机相(甲醇或乙腈)40％-100％；70-85min，有机相(甲醇或乙腈)100％。

从图7中可以看出0.1％甲酸水溶液-甲醇、0.1％甲酸水溶液-乙腈、0.1％醋酸水溶液-甲醇这三种流动相系统下色谱峰的响应值相对较大，分离度好。进一步对这三种流动相系统进行试验比较，结果见图8。

图8中的流动相系统为：1、0.1％甲酸水溶液-乙腈；2、0.1％甲酸水溶液-甲醇；3、0.1％醋酸水溶液-甲醇；

梯度分别为：

对于流动相系统1，0-90min，乙腈5％-62％；90-110min，乙腈62％-100％；

对于流动相系统2，0-70min，甲醇40％-100％；70-85min，甲醇100％；

对于流动相系统3，0-90min，甲醇40％-100％；90-100min，甲醇100％。

从图8中可以看出，0.1％甲酸水溶液-乙腈作为流动相的色谱图，基线平稳、噪音小、色谱峰的分离度和对称性、响应值比较好，色谱峰数目较多。因此，选择0.1％甲酸水溶液-乙腈作为流动相系统。

10、柱温考察

供试品溶液的制备与上述5中相同。

除了选择0.1％甲酸水溶液-乙腈作为流动相系统，梯度为0-90min，乙腈5％-62％；90-110min，乙腈62％-100％，以及分别在室温、25、30、35、40℃柱温下以外，按照9.流动相考察中所述用液相色谱仪进行测定，结果见图9。

结果表明当柱温为40℃时，色谱峰响应值高，分离度好，基线平稳。因此选择最佳色谱峰为40℃。

11、流速考察

供试品溶液的制备与上述5中相同。

除了选择0.1％甲酸水溶液-乙腈作为流动相系统，梯度为0-90min，乙腈5％-62％；90-110min，乙腈62％-100％，40℃柱温以及分别在1.0、0.8、0.5ml/min流速下以外，按照9.流动相考察中所述用液相色谱仪进行测定。

结果见图20。结果表明在0.5ml/min下，色谱峰响应较高，分离度较好。

12、超声时间考察

供试品溶液制备：

取新癀片粉(过三号筛)4份，精密称定，重量分别为0.5173g，0.5134g，0.5191g，0.5168g，均加入二氯甲烷-甲醇-水(2:4:1，V:V:V)混合溶液25ml，分别超声处理10、20、30、40min，取出，冷却，再称定重量，用二氯甲烷-甲醇-水(2:4:1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，得到供试品溶液。

对上述供试品溶液用液相色谱仪进行测定，除了流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱系统为0-71min，20-62％A；71-80min，62-100％A；80-100min，100％A以外，其他液相条件与上述2中相同，结果见图10。取4个主要色谱峰(保留时间：峰1，18.504min；峰2，20.493min；峰3，66.497min；峰4，67.661min)的峰面积进行评定，结果见表2。

表2超声时间考察结果

由表2中可以看出超声时间在10-40分钟之间对于峰面积影响不大，并且图10的谱图中色谱峰的数量都是17个，因此选择超声时间为20分钟。

13、溶剂量考察

供试品溶液制备：

取新癀片粉(过三号筛)4份，精密称定，重量分别为0.5405g，0.4965g，0.5090g，0.5175g，即固液比为1：40，1：60，1：80，1：90，分别加入二氯甲烷-甲醇-水(2:4:1)混合溶液20、30、40、50ml，超声处理20min，取出，冷却，再称定重量，用二氯甲烷-甲醇-水(2:4:1)混合溶液补足减失的重量，混匀，滤过，得到供试品溶液。

对上述供试品溶液用液相色谱仪进行测定，除了流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱系统为0-71min，20-62％A；71-80min，62-100％A；80-100min，100％A以外，其他液相条件与上述2中相同，结果见图11。取4个主要色谱峰(保留时间：峰1，16.543min；峰2，19.026min；峰3，73.546min；峰4，75.070min)的峰面积进行评定，结果见表3。

表3提取溶剂量考察

由图11可以看出提取时固液比在1:40～1:100间得到色谱峰的数量不变。从表3中可以看出提取时固液比在1:40～1:100范围内不同出峰时间的峰面积大小相似。同时考虑进样量响应值大小，选择最佳的固液比为1:40。

14、梯度系统的调整

按照上述3中的供试品溶液配制方法制备供试品溶液。

除了分别采用下面的梯度系统以外，按照上面2中的液相条件对上述供试品溶液用液相色谱仪进行测定：

梯度系统1：0-70min，28-62％A；70-80min，62-100％A；80-100min，100％A；

梯度系统2：0-15min，17-35％A；15-65min，35-54％A；65-70min，54-62％A；70-75min，62-100％A；75-100min，100％A；

梯度系统3：0-25min，17-35％A；25-45min，35-54％A；45-60min，54-62％A；60-65min，62-100％A；65-85min，100％A；

梯度系统4：0-20min，17-35％A；20-50min，35-54％A；50-60min，54-62％A；60-70min，62-100％A；70-90min，100％A；

梯度系统5：0-29min，21-35％A；29-68min，35-54％A；68-83min，54-62％A；83-88min，62-100％A；88-120min，100％A。

结果见图12。结果表明，最佳的梯度系统为梯度系统5：0-29min，21-35％A；29-68min，35-54％A；68-83min，54-62％A；83-88min，62-100％A；88-120min，100％A。

15方法学考察

按照上述3中的供试品溶液配制方法制备供试品溶液。

液相条件：

色谱柱：

STAR LP RP-18 endcapped(5μm,250×4.6mm)；流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱：0-29min，21％-35％A，29-68min。35％-54％A，68-83min，54％-62％A，83-88min，62％-100％A，88-120min，100％A；流速：0.5ml/min；柱温：40℃；进样量：10μl；检测器：2424型ELSD；气体压力：30psi；漂移管温度：55℃；喷雾方式：加热40％，增益值：10。

15.1、专属性实验

分别取空白溶剂(即乙腈-0.1％甲酸水溶液)和新癀片供试品溶液，按上述液相条件，分别进样，记录色谱图。结果见图13。

结果表明，空白溶剂对供试品溶液的测试不存在干扰，专属性良好。

15.2、精密度试验

取同一份新癀片的供试品溶液，按上述液相条件，连续进样6次，记录色谱图，结果见图14(其中，精密度实验1-5在图14中分别指示为S1-S5)。以13号峰为参照，计算15个主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表4和表5。

表4精密度试验结果(相对保留时间)

表5精密度试验结果(相对峰面积)

由表4和5可以看出，15个主要色谱峰的相对保留时间的RSD在0.0093-0.1931％之间，相对峰面积的RSD在1.1490-4.8100％之间，RSD均小于5％。上述实验结果表明，仪器的精密度良好。

15.3、稳定性试验

取同一份新癀片的供试品溶液，按上述色谱条件，分别在0、4、8、16、24、36、48h进样，记录色谱图，结果见图15(其中，0、4、8、16、24、36、48h的实验在图15中分别指示为S1-S7)。以13号峰为参照，计算15个主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表6和表7。

表6稳定性试验结果(相对保留时间)

表7稳定性试验结果(相对峰面积)

由表6和7可以看出，15个主要色谱峰的相对保留时间的RSD在0.0149-0.2419％之间，相对峰面积的RSD在1.6786-7.1492％之间，RSD均小于7.1492％。表明供试品在48h内基本稳定。

15.4、重复性试验

取同一批新癀片粉，精密称取6份，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件，分别进样分析，记录色谱图，结果见图16(其中，重现性实验1-6在图16中分别指示为S1-S6)。以13号峰为参照，计算15个主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表8和表9。

表8重现性试验结果(相对保留时间)

表9重现性试验结果(相对峰面积)

由表8和9可以看出，15个主要色谱峰的相对保留时间的RSD在0.0073-0.0549％之间，相对峰面积的RSD在0.9303-4.8940％之间，RSD均小于5.0％。上述实验结果表明，实验的重现性良好。

16指纹图谱的建立

16.1共有峰的标定

对15个批次(批号：151001，150909，161118，161201，161202，161203，161204，161206，161207，161208，161209，161210，161211，161213，161214)的新癀片按上述3中的供试品溶液制备方法分别制备供试品溶液。

应用15中所述色谱条件进行测定。将测定的15批新癀片供试品色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.130723版本)，将批号为161118供试品色谱图设置为参照图谱，标准图谱生成方法为中位数法，同时采用采用多点校正法建立新癀片标准指纹图谱，根据新癀片的指纹图谱分析情况，选择新癀片中主要成分且分离度较好的色谱峰作为特征峰，确定15个共有峰，结果见图17和18。

16.2参照峰选择色谱图中13号峰(吲哚美辛)，分离度好，响应值较适宜且稳定，因此选择此峰作为参照峰(S)。

以13号峰为参照，计算15批新癀片色谱图中共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果见表10和表11。

表10共有峰在15批新癀片HPLC指纹图谱中的相对峰面积分析

表10(续)

表11共有峰在15批新癀片HPLC指纹图谱中的相对保留时间分析

表11(续)

结果显示，各共有峰相对保留时间RSD值均小于0.21％，说明各共有峰保留时间较均一稳定。相对峰面积RSD％值范围为6.36％-79.3％，跨度较大，表明不同批次新癀片的化学成分含量存在一定差异。

16.3相似度评价

将上述15批新癀片供试品色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.130723版本)，生成标准指纹图谱，计算各供试品图谱与标准图谱之间的相似度，结果见表12。

表12相似度评价结果

表12(续)

各供试品图谱与标准图谱之间的相似度分别为0.999、0.998、0.998、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、1.000、1.000、0.998、0.984、0.990，均大于0.9，说明这15批新癀片质量较为稳定均一。

17、主要色谱峰的鉴定及归属

采用阴性样品对照、单味药材及对照品的比对，对新癀片指纹图谱中主要色谱峰进行归属及鉴定，结果见图19，其中A新癀片样品图，B混合对照品图。

通过比较发现13号峰为吲哚美辛，2号峰为三七皂苷R1，3号峰为人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，4号峰为人参皂苷Rb1，6号峰为甘氨猪去氧胆酸，7号峰为人参皂苷Rd，10号峰为胆酸，11号峰为甘氨鹅去氧胆酸，12号峰为胆酸；且发现2、3、4及7号峰来源于三七，5、6、8、9、11、12及14号来源于猪胆，10和12号峰来源于人工牛黄。

中药指纹图谱是一种多指标的质控模式，能较全面的反映复方中的化学成分信息，为中药质量评价提供了新的思路和方法，已经成了国内外广泛接受的中药质量评价模式。本研究建立的新癀片HPLC-ELSD指纹图谱方法，方法简便稳定可靠，共标定了15个共有峰，并对其主要成分进行药材归属及鉴定，明确了9个化学成分。对15批新癀片进行相似度评价，各自的相关系数在0.984-1.000之间，表明不同批次间新癀片化学组成一致性较好，制剂工艺稳定可控。

Claims (8)

1.一种检测新癀片指纹图谱的方法，所述方法用配备有蒸发光散射检测器(ELSD)的高效液相色谱仪进行检测，色谱条件如下：

色谱柱：

STAR LP RP-18 endcapped，5μm,250×4.6mm；

流动相：乙腈A-0.1％甲酸水溶液B，

梯度洗脱：0-29min，21％-35％A；29-68min，35％-54％A；68-83min，54％-62％A；83-88min，62％-100％A；88-120min，100％A；

流速：0.4～0.8ml/min；

柱温：30～50℃；

进样量：10μl；

检测器条件：气体压力：20～40psi；漂移管温度：50～60℃；喷雾方式选自冷却至加热50％；以及增益值：5-20，

其中，用于进行检测的新癀片供试品溶液如下配制：将新癀片细粉和二氯甲烷-甲醇-水混合溶液加入具塞容器中，称重后进行超声处理，放冷后再称定重量，用同种溶剂补足减失的重量，滤过后得到供试品溶液。

2.权利要求1所述的方法，其中，在色谱条件中，流速为0.5ml/min；柱温为40℃；气体压力为30psi；漂移管温度为55℃；喷雾方式为加热40％；以及增益值为10。

3.一种建立新癀片标准指纹图谱的方法，所述方法包括：

(1)供试品溶液配制：

将新癀片细粉和二氯甲烷-甲醇-水混合溶液加入具塞容器中，称重后进行超声处理，放冷后再称定重量，用同种溶剂补足减失的重量，滤过后得到供试品溶液；

(2)对照品溶液的配制：

取三七总皂苷、甘氨猪去氧胆酸、胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、吲哚美辛加甲醇制成对照品溶液；

(3)HPLC检测

将上述(1)和(2)的供试品溶液和对照品溶液用根据权利要求1或2的方法检测得到供试品指纹色谱图和对照品指纹色谱图；

(4)生成标准指纹图谱

基于供试品指纹色谱图生成标准指纹图谱，选择新癀片中主要成分且分离度较好的色谱峰作为特征峰并确定为共有峰；

(5)共有峰的鉴定及归属

对新癀片指纹图谱中的共有峰进行归属及鉴定。

4.权利要求1或3所述的方法，其中，新癀片细粉的粒度为至少过中国药典中规定的三号筛的粒度；和/或，所述二氯甲烷-甲醇-水混合溶液中三种成分的体积比为二氯甲烷:甲醇:水＝6～1:1～5:1；和/或，新癀片细粉与二氯甲烷-甲醇-水混合溶液的固液比，以重量/体积计，在1:30～100g/ml之间。

5.权利要求4所述的方法，其中，供试品溶液如下配制：取过三号筛的新癀片细粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积比2:4:1的二氯甲烷-甲醇-水混合溶液20ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用体积比2:4:1的二氯甲烷-甲醇-水混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。

6.权利要求3所述的方法，其中，对照品溶液如下配制：取三七总皂苷、甘氨猪去氧胆酸、胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、吲哚美辛适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中含三七皂苷R175.70μg，人参皂苷Rg1 269.05μg，人参皂苷Re 37.85μg，人参皂苷Rb1 283.37μg，甘氨猪去氧胆酸391.04μg，人参皂苷Rd 77.75μg，胆酸78.92μg，甘氨鹅去氧胆酸270.09μg，猪去氧胆酸60.82μg，吲哚美辛560.84μg的混合溶液。

7.权利要求3所述的方法，其中所述新癀片标准指纹图谱包括15个共有峰，其中，以13号峰为参照，各峰的相对保留时间如下：

其中，各共有峰相对保留时间RSD值不大于1％。

8.一种检测新癀片产品质量的方法，其包括：

(1)使用根据权利要求1-6中任一项所述的方法得到新癀片产品的指纹图谱；

(2)将所得新癀片产品的指纹图谱与标准指纹图谱进行对比，若相似度大于0.9，则说明该新癀片产品质量合格。

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