CN112782331B - 一种藕节与藕节炭的特征图谱构建方法及鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种藕节与藕节炭的特征图谱构建方法及鉴别方法，通过分别构建藕节及藕节炭的标准特征图谱，根据其标准特征图谱中5‑羟甲基糠醛（5‑HMP）等对应特征峰的区别，可以将其应用于藕节及藕节炭的专属鉴别，具有快速、准确的特点。
Description
技术领域
本发明是一种藕节与藕节炭的特征图谱构建方法及鉴别方法，具体涉及一种藕节与藕节炭饮片、藕节炭对照提取物、藕节炭配方颗粒的特征图谱的构建及其鉴别方法，属于中药检测技术领域。
背景技术
藕节为睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的干燥根茎节部经去杂，洗净，干燥而制成，具有止血、消淤的作用，用于治疗吐血、咯血、尿血、衄血、崩漏等症。藕节炭为藕节经炒炭法炒至表面黑褐色或焦黑色，内部黄褐色或棕褐色的炮制品，具有收敛止血，化瘀的功效，可用于吐血、咯血、忸血、尿血、崩漏等症。
在藕节及藕节炭的临床应用中，有生用或炒炭用，并认为生用凉血止血，兼能化瘀。炒炭增强收敛之性，故止血作用增强。因此，基于其临床效果的区别，为促进藕节及藕节炭在中药制剂中的开发和应用，势必需要建立对藕节及藕节炭的质量标准的参考依据。
刘善新等在“藕节的TLC鉴别和浸出物含量测定”和“藕节炭的TLC鉴别和浸出物含量测定”中分别对藕节、藕节炭药材的鉴别方法及浸出物进行了研究，采用薄层色谱法(TLC)分别对藕节、藕节炭药材进行鉴别研究，用65％乙醇测其浸出物，其薄层鉴别斑点明显，因此，以3-表白桦脂酸、β-谷甾醇为对照可以分别鉴别藕节、藕节炭药材，但不同地区市售藕节、藕节炭65％乙醇浸出物差异较大。
除薄层色谱法外，刘善新等在“藕节、藕节炭HPLC指纹图谱研究”中还建立了藕节、藕节炭HPLC指纹图谱共有模式，以3-表白桦脂酸为对照，采用Lichrospher C18柱4.6mm×150mm，5μm色谱柱，乙腈-0.2％磷酸为流动相梯度脱洗，柱温30℃，流速1ml/min，检测波长203nm，分析时间70min。检测结果显示，藕节、藕节炭分别获得5个、4个共有指纹峰，同时标定了3-表白桦脂酸的位置。该方法操作简便，精密度、稳定度、重现性良好，为藕节、藕节炭的质量控制提供了新的参考。
基于上述情况可以知道，现有针对藕节及藕节炭的专属鉴别方法尚未见报道，为此，本发明应运而生。
发明内容
为实现藕节与藕节炭的快速鉴别，本发明提供了一种藕节与藕节炭的特征图谱构建方法及鉴别方法，通过分别构建藕节及藕节炭的标准特征图谱，根据其标准特征图谱中5-羟甲基糠醛(5-HMP)等对应特征峰的区别，可以将其应用于藕节及藕节炭的专属鉴别，具有快速、准确的特点。
本发明通过下述技术方案实现：一种藕节与藕节炭的特征图谱构建方法，包括以下步骤：
A.分别取藕节和藕节炭，制备得到藕节供试品溶液和藕节炭供试品溶液；
B.分别取藕节供试品溶液和藕节炭供试品溶液，按高效液相色谱法进行测定，得到对应的标准特征图谱。
所述步骤A中，供试品溶液的制备方法包括：取藕节或藕节炭，加入70％甲醇25ml，超声处理20～30min，放冷，滤过，即得。
所述步骤B中，按高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，在流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为275nm的条件下进行测定。
所述梯度脱洗满足以下条件：
0～60min，流动相A：5％→90％，流动相B：95％→10％。
一种藕节与藕节炭的特征图谱鉴别方法，包括以下步骤：
A.采用权利要求1所述方法构建得到藕节和藕节炭的标准特征图谱；
B.制备待测样品的供试品溶液，按高效液相色谱法进行测定，得到待测样品的特征图谱；
C.将待测样品的特征图谱与藕节和藕节炭的标准特征图谱进行分析。
所述步骤B中，供试品溶液的制备方法包括：取待测样品，加入70％甲醇25ml，超声处理20～30min，放冷，滤过，即得。
所述步骤B中，按高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，在流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为275nm的条件下进行测定。
所述梯度脱洗满足以下条件：
0～60min，流动相A：5％→90％，流动相B：95％→10％。
所述待测样品包括但不限于：藕节饮片、藕节对照提取物、藕节配方颗粒、藕节炭饮片、藕节炭对照提取物或藕节炭配方颗粒。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
(1)本发明通过研究发现，因藕节中含有多糖及各种氨基酸，在炒炭的过程，会因为受高热发生美拉德反应(Millard Reaction)而产生5-羟甲基糠醛(5-HMP)，故以此为鉴别点，利用高效液相色谱法构建了藕节及藕节炭的标准特征图谱，并通过对标准特征图谱进行比对，以5-羟甲基糠醛(5-HMP)等对应特征峰为区别，实现了藕节与藕节炭及其对应提取物的快速鉴别，具有方法简单、精密度够高、稳定性高、重现性高的特点。
(2)本发明方法通过特征图谱的构建和鉴别方法，实现了藕节饮片、藕节对照提取物、藕节配方颗粒与藕节炭饮片、藕节炭对照提取物、藕节炭配方颗粒的有效鉴别，防止临床上将藕节和藕节炭饮片、配方颗粒混用，保证用药安全。
附图说明
图1为藕节及藕节炭的对照特征图谱。
图2为藕节对照提取物的特征图谱。
图3为藕节对照提取物的3D色谱图。
图4为藕节对照提取物不同波长色谱图。
图5为柱温考察色谱图(藕节)。
图6为流速考察色谱图(藕节)。
图7为延迟性实验色谱图(藕节)。
图8为提取方法考察色谱图(藕节)。
图9为提取溶剂考察色谱图(藕节)。
图10为提取时间考察色谱图(藕节)。
图11为藕节对照提取物特征图谱专属性考察色谱图。
图12为藕节对照药材特征图谱。
图13为不同仪器考察色谱图(藕节)。
图14为藕节对照提取物色谱柱耐用性考察色谱图。
图15为藕节对照提取物特征图谱(a)。
图16为藕节对照提取物特征图谱(b)。
图17为藕节炭对照提取物的特征图谱。
图18为藕节炭对照提取物的3D色谱图。
图19为藕节炭对照提取物不同波长色谱图。
图20为柱温考察色谱图(藕节炭)。
图21为流速考察色谱图(藕节炭)。
图22为延迟性实验色谱图(藕节炭)。
图23为提取方法考察色谱图(藕节炭)。
图24为提取溶剂考察色谱图(藕节炭)。
图25为提取时间考察色谱图(藕节炭)。
图26为藕节炭对照提取物特征图谱专属性考察色谱图。
图27为不同仪器考察色谱图(藕节炭)。
图28为藕节炭对照提取物色谱柱耐用性考察色谱图。
图29为藕节炭对照提取物特征图谱(a)。
图30为藕节炭对照提取物特征图谱(b)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：藕节与藕节炭的标准特征图谱的构建。
制备藕节饮片供试品溶液：取藕节饮片3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
制备藕节炭饮片供试品溶液：取藕节炭饮片3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
精密吸取藕节饮片供试品溶液和藕节炭饮片供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱，在流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为275nm的条件下进行测定，得到藕节饮片与藕节炭饮片的对应标准特征图谱。
表1
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～60 | 5→90 | 95→10 |
实施例2：特征图谱中区别特征峰的鉴别研究
1.实验仪器
Agilent 1260型高效液相色谱仪。
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron。
2.试剂与试药
甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
5-羟甲基糠醛(中国食品药品检定研究院，批号：111626-201711，纯度99.4％)。
藕节饮片：(批号：OJT181101、OJT181102、OJT181103、OJT181104、OJT181105、OJT181106、OJT181107、OJT181108、OJT181109、OJT181110、OJT181111、OJT181112、OJT181113、OJT181114、OJT181115、OJT181116、OJT181117、OJT181118)。
藕节炭饮片：(批号：OJT181201、OJT181202、OJT181203、OJT181204、OJT181205、OJT181206、OJT181207、OJT181208、OJT181209、OJT181210、OJT181211、OJT181212、OJT181213、OJT181214、OJT181215、OJT181216、OJT181217、OJT181218)。
藕节对照提取物(批号：OJBT181101、OJBT181102、OJBT181103、OJBT181104、OJBT181105、OJBT181106、OJBT181107、OJBT181108、OJBT181109、OJBT181110、OJBT181111、OJBT181112、OJBT181113、OJBT181114、OJBT181115、OJBT181116、OJBT181117、OJBT181118)。
藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181201、OJTBT181202、OJTBT181203、OJTBT181204、OJTBT181205、OJTBT181206、OJTBT181207、OJTBT181208、OJTBT181209、OJTBT181210、OJTBT181211、OJTBT181212、OJTBT181213、OJTBT181214、OJTBT181215、OJTBT181216、OJTBT181217、OJTBT181218)。
藕节配方颗粒(批号：SY1812001、SY1812002、SY1812003)。
藕节炭配方颗粒(批号：SY1903001、SY1903002、SY1903003)。
3.对照品及供试品溶液的制备
对照品溶液：取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得。
藕节饮片供试品溶液：取藕节饮片3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
藕节炭饮片供试品溶液：取藕节炭饮片3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
藕节对照提取物供试品溶液：取藕节对照提取物0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
藕节炭对照提取物供试品溶液：取藕节炭对照提取物0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
藕节配方颗粒供试品溶液：取藕节配方颗粒1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
藕节炭配方颗粒供试品溶液：取藕节炭配方颗粒1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
4.高效液相色谱法测定
精密吸取上述供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱，在流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为275nm的条件下进行测定。
5.实验结果
采用拟定方法分别对18批藕节饮片、18批藕节炭饮片、8批藕节对照提取物、18批藕节炭对照提取物、3批藕节配方颗粒、3批藕节炭配方颗粒样品进行特征图谱测定，记录图谱，并分别用相似度软件合成其对照特征图谱，结果见下图1。
结果表明：藕节饮片在经过炒炭炮制成藕节炭饮片后，成分发生变化，多出峰1(5-羟甲基糠醛)、峰2。同时藕节炭对照提取物、配方颗粒特征图谱中均比藕节对照提取物和藕节配方颗粒多出这2个特征峰。
进一步研究发现，因藕节中含有多糖及各种氨基酸，在炒炭的过程，会因为受高热发生美拉德反应(Millard Reaction)而产生5-羟甲基糠醛(5-HMP)等，故以此为鉴别点，可用于区分藕节与藕节炭饮片、对照提取物以及配方颗粒。
综上所述，该方法能有效的对藕节与藕节炭饮片、对照提取物以及配方颗粒进行鉴别，防止临床上将藕节和藕节炭饮片、配方颗粒混用，保证用药安全。
实施例3：藕节与藕节炭的特征图谱鉴别方法
步骤1，采用实施例1所述方法构建得到藕节和藕节炭的标准特征图谱。
步骤2，制备待测样品的供试品溶液，按拟定方法进行测定，得到待测样品的特征图谱。
步骤3，将待测样品的特征图谱与藕节和藕节炭的标准特征图谱进行分析，判断是否存5-羟甲基糠醛(5-HMP)等对应的特征峰，并以此为鉴别点，用于鉴别待测样品是否为藕节或藕节炭。
在一个具体的实施例中，待测样品可以是藕节、藕节对照提取物、藕节配方颗粒、藕节炭、藕节炭对照提取物或藕节炭配方颗粒等。
实施例4：藕节特征图谱方法的研究
1.实验仪器与材料
高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters e2695型高效液相色谱仪、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron、Diamonsil 5μm C18(2)250×4.6mm、XBridge C18 5μm 4.6×250mm、Kromasil 100-5-C184.6×250mm。
2.试剂及试药
甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
藕节对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121580-201302)；
藕节对照提取物(批号：OJBT181101、OJBT181102、OJBT181103、OJBT181104、OJBT181105、OJBT181106、OJBT181107、OJBT181108、OJBT181109、OJBT181110、OJBT181111、OJBT181112、OJBT181113、OJBT181114、OJBT181115、OJBT181116、OJBT181117、OJBT181118)。
3.色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱，在流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为275nm的条件下进行测定。
4.参照物溶液的制备
取藕节对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.供试品溶液的制备
取藕节对照提取物(批号OJBT181105)约0.5g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.测定
精密吸取参照物溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按拟定方法进行测定，即得藕节特征图谱。结果见图2。
7.系统适用性实验
7.1波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液3D图以及在250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm波长下的色谱图。结果见图3和图4。
结果表明，在检测波长为275nm波长下各色谱峰峰形和对称性更好，整个色谱图信息量较大，故检测波长确定为275nm。
7.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃时进行考察。结果见图5。
结果表明，在柱温为35℃时，各色谱峰能较好分离，确定柱温为35℃进行后续考察。
7.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。结果见图6。
结果表明，在三种流速条件下，各色谱峰都能较好分离，确定流速为1.0ml/min进行后续考察。
7.4延迟性实验
在以上拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至110min。结果见图7。
结果表明，在色谱图采集到60分钟时，已将色谱峰采集完全。故将色谱图采集时间确定为60分钟。
综上所述，藕节对照提取物特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按规定进行梯度洗脱(见表1)；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为275nm。
8.供试品溶液的制备考察
8.1提取方法考察
取藕节对照提取物(批号OJBT181105)约0.5g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，密塞，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图8。
结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果无显著差异。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
8.2提取溶剂考察
取藕节对照提取物(批号OJBT181105)约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为甲醇、70％甲醇、水时进行考察，溶剂加入量为25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图9。
结果表明，当提取溶剂为70％甲醇时，色谱峰信息量较大。故选择提取溶剂为70％甲醇。
8.3提取时间考察
取藕节对照提取物(批号OJBT181105)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图10。
结果表明，在提取时间为20分钟，即可充分提取。故供试品提取时间确定为20分钟。
综上所述，藕节对照提取物特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取藕节对照提取物约0.5g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
9.方法学考察
9.1专属性考察
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备藕节对照提取物供试品溶液。
对照药材溶液的制备：取藕节对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺藕节对照提取物的阴性对照溶液。
结果见图11、12。结果表明，对照提取物中的9个特征峰在藕节对照药材图谱中能够一一对应。在以下方法学考察中，将峰4设为S峰，对样品中的9个峰进行考察。
9.2仪器精密度试验
精密称取藕节对照提取物(批号：OJBT181105)1份，按拟定实验方法进行制备，连续进样6次，每次10μl。结果见下表2和表3。
表2精密度考察-特征峰保留时间
表3精密度考察-特征峰峰面积
结果表明，仪器精密度考察中，各特征峰保留时间的RSD在0.04～0.10％，各特征峰峰面积的RSD在0.07～0.76％。该仪器精密度良好。
9.3重复性考察
精密称取藕节对照提取物(批号：OJBT181105)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。结果见表4和表5。
表4重复性考察—特征峰相对保留时间比值
图5重复性考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD为0.00～0.08％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.26～1.31％。该方法重复性良好。
9.4中间精密度考察
9.4.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取藕节对照提取物(批号：OJBT181107)一份，制备供试品溶液，分别在安捷伦1260、Waters e2695、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm5-Micron)。结果见图13。
结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，对照提取物中的9个特征峰在藕节对照药材图谱中均能够一一对应。
9.4.2不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取藕节对照提取物(批号：OJBT181105)各两份，制备供试品，进行测定。结果见表6和表7。
表6不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间比值
表7不同人员与时间考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.00～0.10％；各特征峰相对峰面积的RSD在0.34～1.31％。
9.5耐用性考察
9.5.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical 4.6×250mm 5-Micron、Diamonsil 5μm C18(2)250×4.6mm、XBridge C18 5μm4.6×250mm、Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm时进行考察。结果见图14。
结果表明，用上述4种色谱柱对样品进行检测时，对照提取物中的特征峰在藕节对照药材图谱中均能够一一对应，但峰1、峰2、峰3分离度较差，且峰2和峰3由于样品批次间差异，对照药材峰面积过小。
9.5.2稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，3h，6h，12h，18h，24h时测定。结果见表8和表9。
表8稳定性考察-特征峰保留时间
表9稳定性考察-特征峰峰面积
结果表明，各特征峰保留时间的RSD在0.05～0.12％，各特征峰峰面积的RSD在0.15～1.14％。该方法供试品在24小时内稳定性良好。
综上所述，峰2、峰3在对照药材色谱中峰面积过小，且色谱柱考察时峰1、峰2、峰3分离度较差，将分析色谱柱推荐为ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron，将上述除峰2、峰3以外的7个特征峰纳入后续考察。
9.6特征峰的确定及对照图谱的建立
采用拟定的方法对藕节对照提取物18批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。结果见图15，图16以及下表10和表11。(图15中，由下至上依次为：OJBT181101、OJBT181102、OJBT181103、OJBT181104、OJBT181105、OJBT181106、OJBT181107、OJBT181108、OJBT181109；图16中，由下至上依次为：OJBT181110、OJBT181111、OJBT181112、OJBT181113、OJBT181114、OJBT181115、OJBT181116、OJBT181117、OJBT181118)
表10 18批藕节对照提取物相对保留时间
表11 18批藕节对照提取物相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，18批次藕节对照提取物特征峰相对峰面积的RSD差异较大，因此不列入质量标准正文，18批次藕节对照提取物7个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。但因为7个特征峰暂没有指认，检测时无法确定S峰位置。最终规定：供试品特征图谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对18批次藕节对照提取物特征图谱进行合成，建立藕节对照提取物特征图谱的对照特征图谱(参见图2)。
实施例5：藕节炭特征图谱方法的研究
1.实验仪器与材料
高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters e2695型高效液相色谱仪、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron、Diamonsil 5μm C18(2)250×4.6mm、XBridge C18 5μm 4.6×250mm、Kromasil 100-5-C184.6×250mm。
2.试剂及试药
甲醇、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
5-羟甲基糠醛(中国食品药品检定研究院，批号：111626-201711，纯度99.4％)；
藕节炭对照药材(批号：OJT181208)；
藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181201、OJTBT181202、OJTBT181203、OJTBT181204、OJTBT181205、OJTBT181206、OJTBT181207、OJTBT181208、OJTBT181209、OJTBT181210、OJTBT181211、OJTBT181212、OJTBT181213、OJTBT181214、OJTBT181215、OJTBT181216、OJTBT181217、OJTBT181218)。
3.色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，按上表1中的规定进行梯度洗脱，在流速为每分钟1.0ml，柱温为35℃，检测波长为275nm下进行测定。
4.参照物溶液的制备
取藕节炭药材1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
5.供试品溶液的制备
取藕节炭对照提取物(批号OJTBT181201)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.测定
精密吸取参照物溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按拟定方法进行测定。以参照物溶液的特征图谱为参照图谱，从供试品溶液的特征图谱中选择共有峰，构建藕节炭对照提取物的特征图谱，见图17。
供试品特征图谱中应呈现4个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的4个特征峰保留时间相对应，与5-羟甲基糠醛参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：1.362(峰2)、3.113(峰3)、4.303(峰4)。
7.系统适用性实验
7.1波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液3D图以及在250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm波长下的色谱图。结果见图18和图19。
结果表明，在检测波长为275nm波长下各色谱峰峰形和对称性更好，整个色谱图信息量较大，故检测波长确定为275nm。
7.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃时进行考察。结果见图20。
结果表明，在柱温为35℃时，各色谱峰能较好分离，确定柱温为35℃进行后续考察。
7.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。结果见图21。
结果表明，在三种流速条件下，各色谱峰都能较好分离，确定流速为1.0ml/min进行后续考察。
7.4延迟性实验
在以上拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至110min。结果见图22。
结果表明，在色谱图采集到60分钟时，已将色谱峰采集完全。故将色谱图采集时间确定为60分钟。
综上所述，藕节炭对照提取物特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按规定进行梯度洗脱(见表10)；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为275nm。
8.供试品溶液的制备考察
8.1提取方法考察
取藕节炭对照提取物(批号OJTBT181201)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图23。
结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果无显著差异。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
8.2提取溶剂考察
取藕节炭对照提取物(批号OJTBT181201)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为甲醇、70％甲醇、水时进行考察，溶剂加入量为25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图24。
结果表明，当提取溶剂为70％甲醇时，色谱峰信息量较大。故选择提取溶剂为70％甲醇。
8.3提取时间考察
取藕节炭对照提取物(批号OJTBT181201)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果见图25。
结果表明，在提取时间为20分钟，即可充分提取。故供试品提取时间确定为20分钟。
综上所述，藕节炭对照提取物特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取藕节炭对照提取物约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
9.方法学考察
9.1专属性考察
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备藕节炭对照提取物供试品溶液。
藕节对照药材溶液的制备：取藕节对照药材1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
藕节炭对照药材溶液的制备：取藕节炭对照药材1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺藕节炭对照提取物的阴性对照溶液。
结果见图26。结果表明，藕节炭对照提取物色谱中的峰1为5-羟甲基糠醛，藕节炭对照提取物色谱中的4个特征峰在藕节炭对照药材色谱中能够一一对应，藕节炭对照提取物中的峰3、峰4能与藕节对照药材色谱对应。在以下方法学考察中，将峰1设为S峰，对样品中的4个峰进行考察。
9.2仪器精密度试验
精密称取藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181201)1份，按拟定实验方法进行制备，连续进样6次，每次10μl。结果见下表12和表13。
表12精密度考察-特征峰保留时间
表13精密度考察-特征峰峰面积
结果表明，仪器精密度考察中，各特征峰保留时间的RSD在0.02～0.009％，各特征峰峰面积的RSD在0.15～0.16％。该仪器精密度良好。
9.3重复性考察
精密称取藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181201)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。结果见表14和表15。
表14重复性考察—特征峰相对保留时间比值
图15重复性考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD为0.00～0.04％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.20～0.58％。该方法重复性良好。
9.4中间精密度考察
9.4.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181201)一份，制备供试品溶液，分别在安捷伦1260、Waters e2695、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron)。结果见下表16、表17及图27。
表16仪器考察—特征峰相对保留时间比值
表17仪器考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD为0.54～3.40％，各特征峰相对峰面积的RSD在1.83～4.43％。
9.4.2不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取藕节炭对照提取物(批号：OJTBT181201)各两份，制备供试品，进行测定。结果见表18和表19。
表18不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间比值
表19不同人员与时间考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.03～0.06％；各特征峰相对峰面积的RSD在0.27～0.64％。
9.5耐用性考察
9.5.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18Analytical 4.6×250mm 5-Micron、Diamonsil 5μm C18(2)250×4.6mm、XBridge C18 5μm4.6×250mm、Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm时进行考察。结果见下表20、表21及图28。
表20色谱柱考察—特征峰相对保留时间比值
表21色谱柱考察—特征峰相对峰面积比值
结果表明，用上述4种色谱柱对样品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD为0.66～6.05％，各特征峰相对峰面积的RSD在7.46～13.74％。
9.5.2稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，3h，6h，12h，18h，24h时测定。结果见表22和表23。
表22稳定性考察-特征峰保留时间
表23稳定性考察-特征峰峰面积
结果表明，各特征峰保留时间的RSD在0.03～006％，各特征峰峰面积的RSD在0.14～0.25％。该方法供试品在24小时内稳定性良好。
综上所述峰3、峰4在色谱柱耐用性考察中相对保留时间的RSD较高，将色谱柱定为ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6×250mm 5-Micron，同时，考虑到仪器耐用性，将各特征峰相对保留时间的范围规定为±10％。将上述4个特征峰纳入后续考察。
9.6特征峰的确定及对照图谱的建立
采用拟定的方法对藕节炭对照提取物18批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。结果见图29，图30以及下表24和表25。(图29中，由下至上依次为：OJTBT181201、OJTBT181202、OJTBT181203、OJTBT181204、OJTBT181205、OJTBT181206、OJTBT181207、OJTBT181208、OJTBT181209；图30中，由下至上依次为：OJTBT181210、OJTBT181211、OJTBT181212、OJTBT181213、OJTBT181214、OJTBT181215、OJTBT181216、OJTBT181217、OJTBT181218)
表24 18批藕节炭对照提取物相对保留时间
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表25 18批藕节炭对照提取物相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了4个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，18批次藕节炭对照提取物特征峰相对峰面积的RSD差异较大，因此不列入质量标准正文，18批次藕节炭对照提取物4个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。最终规定：供试品色谱中应呈现4个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的4个特征峰保留时间相对应，与5-羟甲基糠醛参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：1.362(峰2)、3.113(峰3)、4.303(峰4)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对18批次藕节炭对照提取物特征图谱进行合成，建立藕节炭对照提取物特征图谱的对照特征图谱(参见图17)。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种基于藕节与藕节炭的特征图谱鉴别方法，其特征在于：
A. 分别取藕节和藕节炭，加入70%甲醇25ml，超声处理20～30min，放冷，滤过，制备得到藕节供试品溶液和藕节炭供试品溶液；
B.取5-羟甲基糠醛，加甲醇制成每1ml含30μg的溶液，得对照品溶液；
C.分别取藕节供试品溶液、藕节炭供试品溶液和对照品溶液，按高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度脱洗的条件为：0～60min，流动相A：5%→90%，流动相B：95%→10%，在流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长为275nm的条件下进行测定，得到对应的标准特征图谱；
D.取待测样品，加入70%甲醇25ml，超声处理20～30min，放冷，滤过，制备得到待测样品的供试品溶液；
E.取待测样品的供试品溶液，按步骤C的高效液相色谱法，得到待测样品的特征图谱；
F.将待测样品的特征图谱与藕节和藕节炭的标准特征图谱进行分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测样品包括：藕节饮片、藕节对照提取物、藕节配方颗粒、藕节炭饮片、藕节炭对照提取物或藕节炭配方颗粒。
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