CN110243986B

CN110243986B - 一种活血消瘿片hplc指纹图谱及其制备方法

Info

Publication number: CN110243986B
Application number: CN201910496435.2A
Authority: CN
Inventors: 叶利春; 石召华; 肖静霞; 梁云; 柳畅; 胡俊杰; 曾晓玲; 郑娇娇
Original assignee: Wuhan Aimin Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Wuhan Aimin Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2019-06-10
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2039-06-10
Also published as: CN110243986A

Abstract

本发明公开了一种活血消瘿片HPLC指纹图谱，制备该指纹图谱的方法包括以下步骤：将供试品溶液、混合对照品溶液、单味药材样品溶液、缺样阴性样品溶液分别上高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为240‑260nm，所述高效液相色谱仪的固定相为C₁₈键合硅胶色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.05‑0.2％三氟乙酸水溶液，采用梯度洗脱。该图谱中含有15个共有指纹峰，利用该指纹图谱能对活血消瘿片中的8种指标成分和5种中药材成分进行归属定位和含量测定，从而实现了对活血消瘿片化学成分的综合检测，能更加全面地反映和控制中药内在质量。

Description

一种活血消瘿片HPLC指纹图谱及其制备方法

技术领域

本发明属于中药检测领域，涉及一种活血消瘿片指纹图谱的检测方法及其应用。

背景技术

CN104173922A公开了一种中药，它由桃仁、莪术、柴胡、猫爪草、王不留行、蜣螂虫、土鳖虫、蜈蚣八味中药材制成，该中药以活血化瘀、消瘿散结为主，佐以清热解毒、疏肝解郁，对治疗瘿病有很好的效果，商品名为活血消瘿片。

目前对活血消瘿片的质量控制主要是通过对一两种指标成分的含量测定和薄层鉴别来实现，然而，中药的疗效是通过多成分、多靶点综合作用产生的，现有的中药质量控制存在很大的局限性，不能全面表征药物的质量，导致中药掺假、伪劣现象频发，不仅无法保证疗效，还严重威胁患者的用药安全。因此，有必要建立活血消瘿片更全面的质量检测方法。

指纹图谱是一种可量化、可视化的中药检测方法，主要用于鉴别真伪和评价中药质量的均一性和稳定性。与指标成分含量测定的质量分析方法相比，指纹图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量，在中药复方有效成分尚未完全阐明的现状下，可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制，是目前中药及其制剂质量控制的最有效手段。中药指纹图谱的检测方法有色谱法、光谱法、波谱法等。色谱法主要包括薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱等，其中高效液相色谱法(HPLC)具有高效、快速、灵敏、重现性好的特点，现已成为中药指纹图谱研究的主流方法，但是目前还没有将该方法用于活血消瘿片质量控制的报导。

发明内容

本发明的目的是针对活血消瘿片质量检测中存在的缺陷，提供一种活血消瘿片标准指纹图谱及其制备方法，从而实现活血消瘿片的指纹图谱检测，使检测结果能更全面地反映中药质量。

一种活血消瘿片HPLC指纹图谱，所述活血消瘿片由桃仁、莪术、柴胡、猫爪草、王不留行、蜣螂虫、土鳖虫、蜈蚣八味中药材制成，该指纹图谱包含15个共有指纹峰，以7号峰为定位峰，保留时间为1.000，其它14个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰0.35-0.40、2号峰0.45-0.52、3号峰0.60-0.68、4号峰0.75-0.80、5号峰0.82-0.85、6号峰0.85-0.90、8号峰0.99-1.09、9号峰1.10-1.20、10号峰1.43-1.50、11号峰1.51-1.56、12号峰1.57-1.60、13号峰1.61-1.65、14号峰1.66-1.69、15号峰1.78-1.85；

其中，4号峰为刺桐碱的共有指纹峰，6号峰为苦杏仁苷的共有指纹峰，7号峰为王不留行黄酮苷的共有指纹峰，11号峰为柴胡皂苷B2的共有指纹峰，12号峰为柴胡皂苷B1的共有指纹峰，13号峰为双去甲氧基姜黄素的共有指纹峰，14号峰为去甲氧基姜黄素的共有指纹峰，15号峰为吉马酮的共有指纹峰；

其中，5、6号峰为桃仁的共有指纹峰，4、7、9号峰为王不留行的共有指纹峰，8、10、14、15号峰为莪术的共有指纹峰，2、3、11、12、13号峰为柴胡的共有指纹峰，1号峰为猫爪草的共有指纹峰。

优选地，所述14个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰0.378、2号峰0.498、3号峰0.649、4号峰0.777、5号峰0.843、6号峰0.851、8号峰1.068、9号峰1.177、10号峰1.485、11号峰1.544、12号峰1.581、13号峰1.625、14号峰1.663、15号峰1.820。

所述活血消瘿片HPLC指纹图谱的制备方法，包括以下步骤：

1)取多批次活血消瘿片，研细后用有机溶剂提取，制得供试品溶液；

2)取刺桐碱、苦杏仁苷、王不留行黄酮苷、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷B1、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、吉马酮对照品，加入有机溶剂溶解，配制成混合对照品溶液；

3)取王不留行、桃仁、莪术、柴胡、猫爪草、蜣螂、蜈蚣、土鳖虫8味中药材，分别用有机溶剂提取，制得单味药材样品溶液，同时制备缺少其中任何一味药材的阴性样品，将阴性样品用有机溶剂提取，制得缺样阴性样品溶液；

4)将供试品溶液、混合对照品溶液、单味药材样品溶液、缺样阴性样品溶液分别上高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为240-260nm，所述高效液相色谱仪的固定相为C₁₈键合硅胶色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.05-0.2％(体积)三氟乙酸水溶液，采用梯度洗脱，流速为0.5-2ml/min，柱温为25～35℃；

5)分别记录供试品溶液、混合对照品溶液、单味药材样品溶液、缺样阴性样品溶液的色谱图，利用混合对照品溶液的色谱图对供试品溶液色谱图中的指标成分进行归属定位；利用单味药材样品溶液和缺样阴性样品溶液的色谱图对供试品溶液色谱图中的药材进行归属定位，同时利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对供试品溶液色谱图进行处理，即得到活血消瘿片指纹图谱。

优选地，所述有机溶剂为70％(体积)的乙醇水溶液。

优选地，所述C₁₈键合硅胶色谱柱为HSS T3C₁₈色谱柱。

优选地，所述检测波长为250nm。

优选地，所述流动相B为0.1％三氟乙酸水溶液。

优选地，所述梯度洗脱程序为：

时间/min	流动相A/％	流动相B/％
			0～15	0	100
15～31	0→2	100→98
			31～50	2→11	98→89
50～55	11	89
			55～80	11→24	89→76
80～110	24→54	76→46
			110～120	54→90	46→10
120～121	90→0	10→100
			121～130	0	100

所述的活血消瘿片HPLC指纹图谱在活血消瘿片质量检测中的应用。

一种活血消瘿片质量检测方法，包括将活血消瘿片待测样品的HPLC指纹图谱与所述的活血消瘿片HPLC指纹图谱进行比对的步骤。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过对检测条件进行大量筛选和优化，首次建立了活血消瘿片HPLC标准指纹图谱，该图谱中含有15个共有指纹峰，利用该指纹图谱能对活血消瘿片中的8种指标成分和5种中药材成分进行归属定位和含量判断，从而实现了对活血消瘿片化学成分的综合分析，能更加全面地反映和控制中药内在质量。

(2)本发明建立的指纹图谱峰形好，分离度高，基线平稳，出峰时间短，方法精密度高，重复性和稳定性好。

(3)本发明建立的指纹图谱检测方法在生产过程中可有效指导投料、严格规范生产操作，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠，与其它质量控制方法如HPLC含量测定加薄层鉴别相比，本发明通过一次检测即可实现全面质量控制，具有操作方便、快捷等优点。

附图说明

图1为混合对照品溶液的液相色谱图。其中，4为刺桐碱，6为苦杏仁苷，7为王不留行黄酮苷，11为柴胡皂苷B2，12为柴胡皂苷B1，13为双去甲氧基姜黄素，14为去甲氧基姜黄素，15为吉马酮。

图2显示为本发明中的15批次活血消瘿片样品的指纹图谱。

图3为活血消瘿片的标准指纹图谱。

图4是三种不同检测波长的液相色谱图。

图5是三种不同流动相的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。

以下实施例使用的试剂和仪器如下：

1、试剂

苦杏仁苷对照品(批号110820-201607，纯度>90.70％)、王不留行黄酮苷对照品(批号111853-201303，纯度>92.60％)、去甲氧基姜黄素对照品(批号112003-201501，纯度>98.50％)、双去甲氧基姜黄素对照品(批号112004-201501，纯度>95.00％)购自中国食品药品检定研究院；刺桐碱对照品(批号：18042532，纯度>98.00％)、柴胡皂苷B1对照品(批号18042831，纯度>98.00％)、柴胡皂苷B2对照品(批号18042531，纯度>98.00％)、购自同田生物；吉马酮(批号MUST-15051913，纯度>99.52％)购自成都曼思特生物科技有限公司。甲醇(批号20180108，国药集团化学试剂有限公司)为分析纯，乙腈(Lot18065089，TEDIA)为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。方中各味药材均购自湖北强康中药饮片有限公司。

活血消瘿片，参照CN104173922A中的方法制备，由武汉爱民制药股份有限公司自制，共15批次活血消瘿片，批号见下表1。

表1活血消瘿片批号

2、仪器

Waters高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；Agilent高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；超声波提取器HX-22L(武汉恒信世纪科技有限公司)；BS224S电子天平(万分之一，Sartorius)；XSE205DU电子天平(十万分之一，梅特勒-利托多)；TD 5A-WS型台式低速离心机(上海维尔康湘鹰离心机)。

实施例1

1、样品前处理

供试品溶液的制备：活血消瘿片(0.6g/片)，取10片，研磨成细粉，精密称取约2.000g，置于100ml容量瓶中，精密加入体积浓度为70％的乙醇水溶液50ml，称定重量，密塞封闭后用超声波仪超声提取30min，再次称重，用70％乙醇补足减失的重量，在3000r/min下离心20min，取上清液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，即得供试品溶液。

混合对照品溶液的制备：分别精密称取刺桐碱、苦杏仁苷、王不留行黄酮苷、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷B1、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和吉马酮对照品，置于容量瓶中进行逐级稀释，即先加入70％的乙醇水溶液溶解并在容量瓶中定容摇匀，得到对照品储备溶液，对照品储备溶液中各成分的浓度均为0.5mg/mL，再将对照品储备溶液加入70％的乙醇水溶液稀释并定容，配成所需混合对照品溶液，混合对照品溶液中各成分的浓度均为100μg/mL。

单味药材样品溶液的制备：取王不留行、桃仁、莪术、柴胡、猫爪草、蜣螂、蜈蚣、土鳖虫8味中药材，分别按供试品溶液的制备方法用70％乙醇进行提取，制得单味药材样品溶液。

缺样阴性样品溶液的制备：先按活血消瘿片的制备方法分别制备缺少王不留行、桃仁、莪术、柴胡、猫爪草、蜣螂、蜈蚣、土鳖虫8味中药材中任何一味药材的阴性样品，然后分别将阴性样品按供试品溶液的制备方法用70％乙醇进行提取，制得缺样阴性样品溶液。

2、色谱条件

所述高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为Waters

HSS T3色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％三氟乙酸水溶液，分析时间：130min；梯度洗脱。扫描波长为250nm。

如表2所示，所述梯度洗脱的具体程序为：

表2梯度洗脱程序

时间/min	流动相A/％(体积)	流动相B/％(体积)
			0～15	0	100
15～31	0→2	100→98
			31～50	2→11	98→89
50～55	11	89
			55～80	11→24	89→76
80～110	24→54	76→46
			110～120	54→90	46→10
120～121	90→0	10→100
			121～130	0	100

3、测定

对15批次活血消瘿片进行HPLC检测，获得供试品溶液的色谱图(图2)，将得到的供试品溶液色谱图数据导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件中，进行相似度比较，确定15个共有指纹峰，以7号峰为定位峰(S峰，保留时间为1.000)，其它14个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰0.378、2号峰0.498、3号峰0.649、4号峰0.777、5号峰0.843、6号峰0.851、8号峰1.068、9号峰1.177、10号峰1.485、11号峰1.544、12号峰1.581、13号峰1.625、14号峰1.663、15号峰1.820。

4、指纹峰的归属定位

利用混合对照品溶液的色谱图(图1)对供试品溶液色谱图中的指标成分进行特征峰相对保留时间的归属定位，得到4号峰为刺桐碱指纹峰，6号峰为苦杏仁苷指纹峰，7号峰为王不留行黄酮苷指纹峰，11号峰为柴胡皂苷B2指纹峰，12号峰为柴胡皂苷B1指纹峰，13号峰为双去甲氧基姜黄素指纹峰，14号峰为去甲氧基姜黄素指纹峰，15号峰为吉马酮指纹峰。

将测得的单味药材样品溶液的指纹图谱、8种缺样阴性样品混合溶液的指纹图谱与活血消瘿片的指纹图谱进行特征峰相对保留时间的归属定位，各味药材共有指纹峰归属具体结果见表3，各峰的相对保留时间及峰面积见表4。

表3活血消瘿片中各单味药材的共有指纹峰归属

表4各共有峰保留时间及峰面积

编号	保留时间/min	相对保留时间	峰面积/mAu×s	相对峰面积
					1	25.348	0.378	2341	0.721
2	33.444	0.498	551	0.170
					3	43.580	0.649	304	0.094
4	52.154	0.777	428	0.132
					5	56.623	0.843	189	0.058
6	57.123	0.851	255	0.621
					7	67.134	1.000	3248	1.000
8	71.668	1.068	608	0.187
					9	78.985	1.177	584	0.180
10	99.665	1.485	314	0.097
					11	103.686	1.544	671	0.206
12	106.123	1.581	410	0.126
					13	109.098	1.625	439	0.135
14	111.624	1.663	64	0.020
					15	122.167	1.820	37	0.011

5.标准指纹图谱的建立

将得到的15批次供试品指纹图谱数据导入国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2009版软件中，进行相似度比较，以相似度≥0.90为标准，以平均数法生成标准图谱见图3。

6.方法学考察

(1)精密度

取编号S1(批号：170810)的活血消瘿片样品1份，按上述检测方法进行检测，连续进样6次，考察指纹图谱中各主要色谱峰保留时间及其峰面积的一致性，其中规定的共有峰的相对保留时间RSD≤0.3％，相对峰面积RSD≤3.0％。结果表明，仪器精密度良好。

(2)重复性

取编号S1(批号：170810)的活血消瘿片样品6份，按上述检测方法进行检测，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，其中规定的共有峰相对保留时间的RSD≤0.2％，相对峰面积的RSD≤3.0％。表明本发明中方法的重复性良好，准确度较高。

(3)稳定性

取编号S1(批号：170810)的活血消瘿片样品1份，按上述检测方法，制备供试品溶液后分别放置0h、4h、8h、12h、16h、24h进行检测，计算得出各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果各共有峰相对保留时间的RSD≤0.3％，相对峰面积的RSD％≤3.0％。表明本发明中样品在24h内检测稳定性良好。

实施例2色谱条件的优化

1、波长的选择

波长：230nm、250nm、280nm

选用不同的检测波长，按表5的梯度程序进行洗脱，表5的梯度洗脱程序是在表2洗脱程序确定之前采用的。三种波长的指纹图谱见图4。

表5

时间/min	流动相A/％(体积)	流动相B/％(体积)
			0～15	0	100
15～20	11	89
			20～35	11→24	89→76
35～40	24→54	76→46
			40～50	54→90	46→10
50～61	90→0	10→100
			61～70	0	100

可以看出，与230nm、280nm相比，250nm检测波长的色谱峰的出峰个数明显增多，以及峰高明显增强，尤其是在60-70min，280nm条件下的峰个数明显少于250nm，230nm条件下色谱峰高明显小于250nm波长。

2.流动相的选择

色谱条件(1)：水：甲醇

色谱条件(2)：0.1％磷酸水溶液：乙腈

色谱条件(3)：0.1％三氟乙酸水溶液：乙腈

其它色谱条件与实施例1相同。

结果：结果见图5，在色谱条件(1)体系下，在75min及99min左右的色谱峰的分离比在色谱条件(2)、(3)下，分离的峰的个数及峰形差。再筛选不同的酸体系，色谱条件(3)与色谱条件(2)比较，色谱条件(2)在99min时，10号共有峰与附近其他峰未完全分离，影响指纹图谱共有峰识别与相似度计算，因此选用色谱条件(3)条件下，各共有峰分离度良好，满足其指纹图谱的识别与相似度计算。

实施例3样品的检测

重新制备三批的样品，分别以上述条件检测其指纹图谱，其每批次与生成的标准图谱的相似度比较结果见表6，表明方法的重现性良好，各批次与对照标准图谱相似度大于0.9，适合用于活血消瘿片的特征指纹图谱的检测。

表6相似度计算结果

样品	S1	190404	190406	190407	对照指纹图谱
						S1	1	0.909	0.916	0.904	0.934
190404	0.909	1	0.932	0.937	0.978
						190406	0.916	0.932	1	0.954	0.974
190407	0.904	0.937	0.954	1	0.977
						对照指纹图谱	0.934	0.978	0.974	0.977	1

Claims

1.一种活血消瘿片HPLC指纹图谱的制备方法，所述活血消瘿片由桃仁、莪术、柴胡、猫爪草、王不留行、蜣螂虫、土鳖虫、蜈蚣八味中药材制成，其特征在于包括以下步骤：

1）取多批次活血消瘿片，研细后用70％的乙醇水溶液提取，制得供试品溶液；

2）取刺桐碱、苦杏仁苷、王不留行黄酮苷、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷B1、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、吉马酮对照品，加入70％的乙醇水溶液溶解，配制成混合对照品溶液；

3）取王不留行、桃仁、莪术、柴胡、猫爪草、蜣螂、蜈蚣、土鳖虫8味中药材，分别用70％的乙醇水溶液提取，制得单味药材样品溶液，同时制备缺少其中任何一味药材的阴性样品，将阴性样品用70％的乙醇水溶液提取，制得缺样阴性样品溶液；

4）将供试品溶液、混合对照品溶液、单味药材样品溶液、缺样阴性样品溶液分别上高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为240-260nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱固定相为C₁₈键合硅胶，流动相A为乙腈，流动相B为0.05-0.2%三氟乙酸水溶液，采用梯度洗脱，流速为0.5-2ml/min，柱温为25~35℃；

5）分别记录供试品溶液、混合对照品溶液、单味药材样品溶液、缺样阴性样品溶液的色谱图，利用混合对照品溶液的色谱图对供试品溶液色谱图中的指标成分进行归属定位；利用单味药材样品溶液和缺样阴性样品溶液的色谱图对供试品溶液色谱图中的药材进行归属定位，同时利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对供试品溶液色谱图进行处理，即得到活血消瘿片指纹图谱，

所述梯度洗脱程序为：

。

2.如权利要求1所述活血消瘿片HPLC指纹图谱的制备方法，其特征在于：所述C₁₈键合硅胶色谱柱为HSS T3 C₁₈色谱柱。

3.如权利要求1所述活血消瘿片HPLC指纹图谱的制备方法，其特征在于：所述检测波长为250nm。

4.如权利要求1所述活血消瘿片HPLC指纹图谱的制备方法，其特征在于：所述流动相B为0.1%三氟乙酸水溶液。

5.活血消瘿片HPLC指纹图谱在活血消瘿片质量检测中的应用，所述活血消瘿片由桃仁、莪术、柴胡、猫爪草、王不留行、蜣螂虫、土鳖虫、蜈蚣八味中药材制成，其特征在于，所述活血消瘿片HPLC指纹图谱是按权利要求1-4任何一项所述的方法制备的，该指纹图谱包含15个共有指纹峰，以7号峰为定位峰，保留时间为1.000，其它14个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰0.35-0.40、2号峰0.45-0.52、3号峰0.60-0.68、4号峰0.75-0.80、5号峰0.82-0.85、6号峰0.85-0.90、8号峰0.99-1.09、9号峰1.10-1.20、10号峰1.43-1.50、11号峰1.51-1.56、12号峰1.57-1.60、13号峰1.61-1.65、14号峰1.66-1.69、15号峰1.78-1.85；

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：其它14个共有指纹峰的相对保留时间依次为1号峰0.378、2号峰0.498、3号峰0.649、4号峰0.777、5号峰0.843、6号峰0.851、8号峰1.068、9号峰1.177、10号峰1.485、11号峰1.544、12号峰1.581、13号峰1.625、14号峰1.663、15号峰1.820。

7.一种活血消瘿片质量检测方法，所述活血消瘿片由桃仁、莪术、柴胡、猫爪草、王不留行、蜣螂虫、土鳖虫、蜈蚣八味中药材制成，其特征在于包括将活血消瘿片待测样品的HPLC指纹图谱与活血消瘿片HPLC指纹图谱进行比对的步骤，所述活血消瘿片HPLC指纹图谱是按权利要求1-4任何一项所述的方法制备的。