CN114487243B - 一种土鳖虫水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药检测技术领域，具体公开了一种土鳖虫水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法，包括以下步骤，(1)供试品溶液的制备；(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以丙基酰胺键合硅胶为填充剂，流动相包括水溶液和乙腈，梯度洗脱程序包括：0→10‑15min→17‑25min，流动相中乙腈的体积百分数为：90‑92％→90％→65‑88％。以丙基酰胺键合硅胶为填充剂，流动相包括水和乙腈，通过优选梯度洗脱程序，最终仅使用2个洗脱程序即可得到5个共有特征峰，并实现了包括尿嘧啶和次黄嘌呤在内的共有特征峰的分离，洗脱程序简单，得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离度高。

Description

一种土鳖虫水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种土鳖虫水提取物及其制剂的特征图谱及其构建方法。

背景技术

土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖Eupolyphaga sinensis Walker或冀地鳖Steleophagaplancyi(Boleny)的雌虫干燥体，为我国传统常用中药。前者分布于全国大部分地区，后者分布于河北、河南、陕西、甘肃、青海及湖南等地，野生者在夏、秋季捕捉，人工饲养者随时捕捉，捕到后用沸水烫死，晒干或烘干。土鳖虫药材最早记载于《神农本草经》，被列为中品。土鳖虫为2020年版《中国药典》收录品种，其味咸，寒；有小毒。归肝经。具有破血逐瘀，续筋接骨的功效，用于跌打损伤，筋伤骨折，血瘀经闭，产后瘀阻腹痛，癥痕痞块等症。

土鳖虫为动物药，其所含成分多为蛋白质、核酸、生物碱等，其中以蛋白质、生物碱、核酸及其衍生物为主。《中国药典》2020年版“土鳖虫”项下仅收载了性状、显微鉴别、薄层鉴别及浸出物的含量测定。

现有技术中关于土鳖虫的质量标准研究，多集中于性状、鉴别、含量测定及指纹图谱的研究上。土鳖虫药材中含有的核苷类成分主要为尿嘧啶、尿囊素、次黄嘌呤等，以前在研究该类成分时较常用薄层扫描色谱法进行含量测定。指纹图谱方面，有采用异硫氰酸苯酯柱前衍生法对土鳖虫超微粉进行梯度洗脱色谱分离，采用高效液相色谱法建立土鳖虫超微粉中游离氨基酸成分HPLC指纹图谱，结果标定24个特征共有峰，定量分析6个氨基酸成分，为土鳖虫氨基酸类成分质量控制提供依据。另有研究采用高效毛细管电泳法(HPCE)，以土鳖虫对照药材、尿嘧啶为参照物，对不同产地10个批次土鳖虫药材进行HPCE指纹图谱研究，通过与CDA中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)进行评价后，确定10个批次土鳖虫HPCE图中的6个共有特征峰，并确定土鳖虫药材的HPCE指纹图谱共有模式图。

然而由于中药配方颗粒已经不具备饮片性状鉴别的特征，上述方法不适于土鳖虫配方颗粒等由土鳖虫水提取物制得的制剂的质量检测，特征峰少，分离效果差，采用高效液相色谱法对土鳖虫水提取及其制剂进行特征图谱的定性检测目前还是一个空白，如何提高土鳖虫水提取及其制剂的检测标准，全面地控制成品质量是本发明需要解决的技术问题。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种土鳖虫水提取物及其制剂特征图谱及其建立方法，该方法根据水提取物及其制剂的特点，加强专属性鉴别和多成分、整体性进行质量控制，建立了该品种的特征图谱，进行全面质量控制。

具体的，本发明公开了一种土鳖虫水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法，包括以下步骤，

(1)供试品溶液的制备；

(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以丙基酰胺键合硅胶为填充剂，流动相包括水溶液和乙腈，梯度洗脱程序包括：0→10-15min→17-25min，流动相中乙腈的体积百分数为：90-92％→90％→65-88％。

其中水溶液选自水或者含酸水溶液，例如0.05-0.2vt％的磷酸水溶液或者0.05-0.2vt％的醋酸水溶液。

在某些优选的实施方式中，梯度洗脱程序包括：0→10min→17min，流动相中乙腈的体积百分数为：92％→90％→88％。

本发明中，土鳖虫水提取物及其制剂指可以是土鳖虫水提取物，也可以是由土鳖虫水提取物制成的制剂，例如粉剂、颗粒剂、片剂等。

在某些优选的实施方式中，步骤(2)中，检测波长为250-260nm，流速为0.68-0.72mL/min，柱温为28-32℃。

在某些优选的实施方式中，梯度洗脱程序还包括：17-25min→20-30min，流动相中乙腈的体积百分数为：65-88％→50-90％；优选地，梯度洗脱程序还包括20-30min→30-35min→40-45min，流动相中乙腈的体积百分数为：50-90％→50-92％→92％；更优选地，梯度洗脱程序还包括40-45min→50min，流动相中乙腈的体积百分数为：92％→92％。

在某些优选的实施方式中，梯度洗脱程序还包括：17min→20min→30min→40min→50min，流动相中乙腈的体积百分数为：88％→50％→50％→92％→92％。

在某些优选的实施方式中，步骤(1)包括，称取土鳖虫供试品，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液；

在某些优选的实施方式中，所述步骤(1)还满足如下A-E中的任意一项或者多项：

A、土鳖虫配方颗粒的质量与溶剂的体积之比为0.1-0.5：10-40；质量与体积的关系为g/mL。

B、提取方式为回流提取或者超声提取；

C、提取时间为≥0.3h，优选为20-40min；

D、所述固液分离选自离心或者过滤；

E、溶剂选自甲醇、水和乙醇中的至少一种；优选为体积百分数不大于50％的甲醇水溶液。

在某些优选的实施方式中，所述的构建方法还包括采用尿嘧啶对照品和/或次黄嘌呤对照品加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照本发明任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤；和/或，采用土鳖虫对照药材为参照物按照本发明任一所述的构建方法中的步骤(1)制备对照品参照物溶液，按照本发明任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品参照物溶液得到对照品参照物图谱的步骤。

优选的，每1mL对照品溶液中含5-30μg尿嘧啶和/或含5-30μg次黄嘌呤；和/或，对照品溶液制备中所采用的溶剂选自水或者体积分数不大于50％的甲醇水溶液。

某些优选的实施方式中，还包括土鳖虫配方颗粒的对照特征图谱的构建，对多批土鳖虫配方颗粒供试品检测得到的特征图谱，利用中药色谱特征图谱相似度评价系统生成土鳖虫配方颗粒的对照特征图谱。至少采用2批土鳖虫配方颗粒，例如采用4个批次、7个批次、15个批次、17个批次的土鳖虫配方颗粒。

某些优选的实施方式中，利用中药色谱特征图谱相似度评价软件生成土鳖虫配方颗粒的对照特征图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。

采用土鳖虫水提取物和/或其制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的土鳖虫水提取物及其制剂的特征图谱。

本发明还提供了一种土鳖虫水提取物及其制剂的对照特征图谱，其具有5个共有特征峰，以次黄嘌呤峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.51(峰1)、0.54(峰2)、0.82(峰3)、0.91(峰4)和1.00(峰5)。

本发明中，土鳖虫水提取物及其制剂的对照特征图谱还可以使用单批次或者多批次土鳖虫水提取物和/或其制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的土鳖虫水提取物和/或其制剂的特征图谱；可选的，土鳖虫水提取物及其制剂的对照特征图谱还可以使用多批次土鳖虫水提取物和/或其制剂供试品按照本发明任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成特征图谱。

本发明还提供了一种土鳖虫配方颗粒的质量检测方法，包括将待测土鳖虫产品的特征图谱与土鳖虫水提取物及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测土鳖虫产品的特征图谱为使用待测土鳖虫产品按照上述任一所述的构建方法得到，所述土鳖虫水提取物及其制剂对照特征图谱为上述所述的土鳖虫水提取物及其制剂对照特征图谱。

其中，本发明中待测土鳖虫产品可以是土鳖虫水提取物，也可以是由土鳖虫水提取物制成的制剂，例如粉剂、颗粒剂、片剂等。

采用相似度评价待测土鳖虫配方颗粒产品的质量，当待测土鳖虫配方颗粒产品的特征图谱与土鳖虫配方颗粒的对照特征图谱的相似度如果不低于0.90-1.00(例如0.95)，则为质量合格；如果低于0.90-1.00(例如0.89)，则为不合格；具体地，所述相似度通过中药色谱特征图谱相似度评价软件得到。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明所述的土鳖虫配方颗粒的特征图谱的构建方法，以丙基酰胺键合硅胶为填充剂，流动相包括水和乙腈，通过优选梯度洗脱程序，最终仅使用2个洗脱程序即可得到5个共有特征峰，并实现了包括尿嘧啶和次黄嘌呤在内的共有特征峰的分离，洗脱程序简单，得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离度高，而且可以准确定位尿嘧啶和次黄嘌呤的峰位置，充分的反映土鳖虫配方颗粒的整体性和特征性，为土鳖虫配方颗粒的质量检测和控制提供依据。

2.本发明所述的土鳖虫配方颗粒的特征图谱的构建方法，通过优化色谱条件、检测波长、提取溶剂、提取时间等提取条件进行考察，确定了最佳提取工艺，使得峰面积更高，能够更加全面的对土鳖虫配方颗粒进行质量监控。

3.本发明所述的土鳖虫配方颗粒的质量检测方法，通过待测土鳖虫配方颗粒产品的特征图谱与土鳖虫配方颗粒的对照特征图谱进行比较，以及通过对土鳖虫配方颗粒中腺苷的含量进行测定，可以全面、清楚、有效的对土鳖虫配方颗粒进行质量检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为方法一条件下的第一次进样的色谱图；

图2为方法一条件下的第二次进样的色谱图；

图3为方法一条件下的第三次进样的色谱图；

图4为方法二条件下的色谱图；

图5为方法三条件下的色谱图；

图6为方法四条件下的色谱图；

图7为方法五条件下的色谱图；

图8为方法六条件下的色谱图；

图9为方法七条件下的色谱图；

图10为方法八条件下的色谱图；

图11为方法九条件下的色谱图；

图12为延迟性试验色谱图；

图13为土鳖虫配方颗粒与对照品对比色谱图，其中曲线1的样品为尿嘧啶对照品溶液；曲线2的样品为次黄嘌呤对照品溶液；曲线3的样品为土鳖虫供试品溶液；

图14批土鳖虫配方颗粒特征图谱与参照物特征图谱的对比；

图15为土鳖虫配方颗粒对照特征图谱。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实验例1构建方法的考察

1、仪器、试剂及试药

仪器：岛津LC-20AD高效液相色谱仪：PDA检测器，Labsolutions色谱工作站；赛默飞Thermo U3000，Chromeleon7色谱工作站；XP26(梅特勒-托利多)，BSA124S电子天平(赛多利斯科技仪器(北京)有限公司)，BT25S电子天平(赛多利斯科技仪器(北京)有限公司)，KQ-500DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

色谱柱：Venusil HILIC(4.6×150mm，5μm)，Waters Atlantis HILIC Silica(4.6*150mm，5μm)。

试药：土鳖虫配方颗粒可以采用本领域常规方法制备，例如本发明中按照如下步骤制备：取土鳖虫饮片200kg，沸腾(100℃)提取一次，加水量为饮片量12倍(每毫克饮片加水12毫升)，提取2小时，150目滤布趁热过滤，滤液80℃减压浓缩，至相对密度为1.05～1.15(60℃)，进行喷雾干燥，进风温度设定为175℃±5，粉碎，干法制粒，包装规格为2g/袋、100g/瓶包装、250g/瓶包装，密封储存。

土鳖虫(地鳖)对照药材(批号：121533-201704，中国食品药品检定研究院)次黄嘌呤(批号：140661-201706，纯度99.4％，中国食品药品检定研究院)

尿嘧啶(批号：100469-201302，纯度99.6％，中国食品药品检定研究院)

试剂：乙腈(默克股份两合公司，JA078530)为色谱纯；水为蒸馏水(屈臣氏)；其它试剂均为分析纯。

2、供试品溶液的制备

取土鳖虫配方颗粒适量，研细，取约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得土鳖虫供试品溶液。

另取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加30％甲醇制成每1ml含10μg的对照品溶液，作为对照品溶液。

3、色谱条件的优化

(1)波长选择

根据建立的特征图谱方法，对土鳖虫供试品溶液进行3D全扫图，结果显示254nm左右的峰较丰富，且峰形较好,优于其他波长，因此选用254nm作为检测波长。

(2)流动相梯度优化

方法一：采用高效液相色谱法对本实验例第2项下制得的土鳖虫供试品溶液进行检测，用Agilent ZORBAX SB-aq(4.6*250mm，5μm)，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.6ml；检测波长为254nm；柱温为30℃，进样2μl；进样三次，结果如图1-3所示，土鳖虫颗粒图谱的重现性较差，容易包峰。

表1方法一下的梯度程序

时间/min	流动相A：乙腈(vt％)	流动相B：0.1％磷酸(vt％)
			0-27	1→11	99→89

方法二：采用高效液相色谱法对本实验例第2项下制得的土鳖虫供试品溶液进行检测，用Waters HSS T 3(4.6*250mm，5μm)，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.6ml；检测波长为254nm；柱温为30℃，进样2μl，结果如图4所示，土鳖虫颗粒图谱次黄嘌呤对应的峰分不开。

表2方法二下的梯度程序

时间/min	流动相A：甲醇(vt％)	流动相B：0.1％磷酸(vt％)
			0-27	1→11	99→89

方法三：采用高效液相色谱法对本实验例第2项下制得的土鳖虫供试品溶液进行检测，用Waters HSS T 3(4.6*250mm，5μm)，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.6ml；检测波长为254nm；柱温为30℃，进样2μl，结果如图5所示，土鳖虫颗粒图谱次黄嘌呤对应的峰未分开。

表3方法三下的梯度程序

方法四：采用高效液相色谱法对本实验例第2项下制得的土鳖虫供试品溶液进行检测，用Venusil HILIC(4.6*150mm，5μm)，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.8ml；检测波长为254nm；柱温为30℃，进样2μl，结果如图6所示土鳖虫颗粒中次黄嘌呤对应的色谱峰峰形很差。

表4方法四下的梯度程序

方法五：采用高效液相色谱法对本实验例第2项下制得的土鳖虫供试品溶液进行检测，用Venusil HILIC(4.6*150mm，5μm)，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.8ml；检测波长为254nm；柱温为30℃，进样2μl，结果如图7所示，土鳖虫颗粒中次黄嘌呤对应的色谱峰峰与旁边的小峰未完全分离。

表5方法五下的梯度程序

时间/min	流动相A：水(vt％)	流动相B：乙腈(vt％)
			0-10	5→8	95→92
10-25	8→35	92→65
			25-30	35→5	65→95

方法六：采用高效液相色谱法对本实验例第2项下制得的土鳖虫供试品溶液进行检测，用Venusil HILIC(4.6*150mm，5μm)，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.8ml；检测波长为254nm；柱温为30℃，进样2μl，结果如图8所示，土鳖虫颗粒中次黄嘌呤对应的色谱峰峰与旁边的小峰仍未分开。

表6方法六下的梯度程序

时间/min	流动相A：水(vt％)	流动相B：乙腈(vt％)
			0-10	5	95
10-25	5→35	95→65
			25-30	35→5	65→95

由结果可以看出，该色谱条件下，个别特征峰分离度不好，可进一步对梯度进行调整。

方法七：采用高效液相色谱法对本实验例第2项下制得的土鳖虫供试品溶液进行检测，用Venusil HILIC(4.6*150mm，5μm)，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.7ml；检测波长为254nm；柱温为30℃，进样2μl，结果如图9所示，土鳖虫颗粒中次黄嘌呤对应的色谱峰基本达到分离，但是前面5分钟左右尿嘧啶对应的色谱峰分离度稍低，分离度为1.25。

表7方法七下的梯度程序

时间/min	流动相A：水(vt％)	流动相B：乙腈(vt％)
			0-10	8→10	92→90
10-20	10→14	90→86
			20-30	14→35	86→65
30-35	35→8	65→92
			35-45	8	92

方法八：采用高效液相色谱法对本实验例第2项下制得的土鳖虫供试品溶液进行检测，用Venusil HILIC(4.6*150mm，5μm)，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.7ml；检测波长为254nm；柱温为30℃，进样2μl，结果如图10所示。

表8方法八下的梯度程序

时间/min	流动相A：水(vt％)	流动相B：乙腈(vt％)
			0-15	10	90
15-25	10→35	90→65
			25-30	35→10	65→90

由结果可以看出，该色谱条件下，各色谱峰分离度基本满足分析要求，根据前期方法开发过程中发现图谱重现性差的问题，分析原因可能与样品中物质较多，因此在每一针样品分析结束后加一段时间的冲柱子，以保证样品分析的重现性。

方法九：采用高效液相色谱法对本实验例第2项下制得的土鳖虫供试品溶液进行检测，用Venusil HILIC(4.6*150mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.7ml；检测波长为254nm；柱温为30℃，进样2μl，结果如图11所示。

表9方法九下的梯度程序

可以看出，此方法峰形与分离度均较好，所示图谱，信息量较大，峰形良好，且分离度较好(5个特征峰的分离度均大于1.5)，故确定该方法为特征图谱构建方法。

(3)延迟性试验

取土鳖虫颗粒供试品溶液，按方法九的色谱条件进样，记录2倍流动相洗脱时间结果见图12。

小结：在17分钟之后存在明显的滞后峰，因此后面增加了色谱柱洗脱的时间，实验结果表明，此方法重现性好，表明该色谱方法符合分析要求。

(5)系统适用性实验

在上述方法九的条件下，以次黄嘌呤为参照，进行系统适用性试验，结果见表10。

表10系统适用性试验结果

小结：次黄嘌呤峰理论板数、保留时间及系统适用性均符合分析要求。

4、供试品溶液的制备

(1)提取溶剂选择

取土鳖虫颗粒(批号：20030752)，研细，取约0.2g各5份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入10vt％甲醇、30vt％甲醇、50vt％甲醇、70vt％甲醇、甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，分别以相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2μl，注入高效液相色谱仪，按方法九的色谱条件测定，测定各峰峰面积。

表11各提取溶剂结果

小结：由上述结果可以看出，除峰4、峰5外，其余不同浓度甲醇所得的3个特征峰峰面积差别不大，结合含量测定结果及谱图的峰形情况，选择30％甲醇作为供试品的提取溶剂。

(2)提取时间选择

取土鳖虫颗粒(批号：20030752)，研细，取约0.3g各3份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入30％甲醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟、30分钟、40分钟，取出，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2μl，注入高效液相色谱仪，按方法九的色谱条件测定，结果见表12。

表12各提取时间结果

小结：由上述结果可以看出，不同提取时间所得特征图谱的峰面积差别不大，结合含量测定结果，考虑到不同批次供试品的差异性，选择30分钟作为供试品制备提取时间。

(3)供试品溶液制备方法的确定

根据上述研究结果，确定的供试品溶液制备方法为：取本品适量，研细，约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5、特征峰的指认

另取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加30％甲醇制成每1ml含10μg的对照品溶液，另取尿嘧啶对照品适量，精密称定，加30％甲醇制成每1ml含10μg的对照品溶液，作为对照品溶液。按照本实验例第4项确定的供试品溶液制备方法制得土鳖虫颗粒供试品溶液，将尿嘧啶对照品溶液、次黄嘌呤对照品溶液及土鳖虫颗粒供试品溶液，按上述方法九的色谱条件进行检测比对，结果如图13。

小结：土鳖虫配方颗粒供试品色谱图中2号峰、5号峰分别与尿嘧啶、次黄嘌呤对照品色谱峰图谱保留时间一致，可确认2号峰为尿嘧啶、5号峰为次黄嘌呤。

6、特征峰的确定及对照图谱的建立

(1)构建方法

参照物溶液的制备：取土鳖虫(地鳖)对照药材1.0g，置具塞锥形瓶中，加50％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加30％甲醇制成每1ml含10μg的对照品溶液，作为对照品参照物溶液。

取15批土鳖虫配方颗粒分别按照下述方法制备供试品溶液，取土鳖虫配方颗粒适量，研细，取约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对上述参照物溶液和15批土鳖虫配方颗粒供试品溶液进行高效液相色谱法检测：色谱柱采用Venusil HILIC(4.6*150mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.7ml；检测波长为254nm；柱温为30℃，各溶液进样量均为2μl。

表13梯度程序

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～10	92→90	8→10
10～17	90→88	10→12
			17～20	88→50	12→50
20～30	50	50
			30～40	50→92	50→8
40～50	92	8

结果如图14所示，其中R(5)为对照药材参照物溶液的特征图谱，S1(5)-S15(5)为15批土鳖虫配方颗粒供试品溶液的特征图谱。

(2)根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了5个重复性较好的峰作为特征峰。最终规定：供试品特征图谱中应呈现5个特征峰，与次黄嘌呤参照物峰相应的峰为S峰，计算特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.51(峰1)、0.54(峰2)、0.82(峰3)、0.91(峰4)。

表14 15批土鳖虫配方颗粒相对保留时间

(3)采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对15批样品进行合成，建立了土鳖虫配方颗粒特征图谱的对照图谱，见图15所示。

(4)相似度计算

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)计算15批土鳖虫颗粒的相似度，结果见表15。

表15相似度结果

编号	样品	相似度
			1	土鳖虫颗粒-01	0.997
2	土鳖虫颗粒-02	0.998
			3	土鳖虫颗粒-03	0.998
4	土鳖虫颗粒-04	0.998
			5	土鳖虫颗粒-05	0.997
6	土鳖虫颗粒-06	0.998
			7	土鳖虫颗粒-07	0.998
8	土鳖虫颗粒-08	0.997
			9	土鳖虫颗粒-09	0.998
10	土鳖虫颗粒-10	0.998
			11	土鳖虫颗粒-11	0.997
12	土鳖虫颗粒-12	0.998
			13	土鳖虫颗粒-13	0.998
14	土鳖虫颗粒-14	0.997
			15	土鳖虫颗粒-15	0.998

各批次土鳖虫颗粒的相似度均大于0.99。

实验例2方法学验证

1、重复性

取土鳖虫配方颗粒(批号：20030752)6份，按实施例1的方法测定，获得其特征图谱，以5号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。结果如下所示。

表16特征图谱重复性考察保留时间及相对保留时间表

表17特征图谱重复性考察峰面积及相对峰面积

小结：根据重复性考察结果，各特征峰的相对保留时间RSD为0％～0.8％，相对峰面积的RSD在0％～1.8％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。

2、中间精密度

采用Thermo U3000，取土鳖虫配方颗粒(批号：20030752)6份，按实施例1的方法测定，获得其特征图谱，以5号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。结果如下所示。

表18特征图谱中间精密度考察保留时间及相对保留时间表

表19特征图谱中间精密度考察峰面积及相对峰面积表

小结：采用Thermo U3000获得的特征图谱中，各特征峰的相对保留时间RSD在0～0.2％范围内，相对峰面积的RSD在0～2.3％范围内。不同仪器间相对保留时间RSD范围是0～1.3％，相对峰面积RSD％范围是0～3.8％，表明该方法对不同品牌仪器具有一定的耐用性。

3、耐用性

(1)稳定性

取土鳖虫配方颗粒(批号：20030752)，按实施例1的方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按实施例1方法进行测定，获得其特征图谱，以5号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。结果如下所示。

表20稳定性相对保留时间表

表21稳定性相对峰面积表

小结：稳定性实验结果可知，供试品溶液中化学成分在24小时稳定性，各特征峰的相对保留时间的RSD在0～1.1％内，相对峰面积的RSD在0～2.0％范围内，表明分析方法稳定可靠。

(2)不同柱温的考察

取土鳖虫配方颗粒适量，按实施例1供试品溶液的制备方法制备供试液，按实施例1建立色谱条件测定。本实验考察了柱温28℃、30℃及32℃，考察色谱方法对于不同柱温的耐用性。

表22不同柱温下相对保留时间表

小结：由以上数据可以看出，以30℃获得的特征图谱的相对保留时间为参照，其它两个温度获得的特征图谱的5个峰的相对保留时间与其相对保留时间相差±10％，该方法对柱温有较好的耐受性。

(3)不同流速的考察

取土鳖虫配方颗粒适量，按实施例1供试品溶液的制备方法制备供试液，按实施例1建立色谱条件测定。本实验考察了流速0.68ml/min、0.70ml/min、0.72ml/min，考察色谱方法对于不同流速的耐用性。

表23不同流速下相对保留时间表

小结：由以上数据可以看出，5个峰的相对保留时间在规定值的±10％之内，不同流速下各色谱峰分离度较好，可以说明，流速对该方法影响较小。

实施例1

本实施例提供了一种土鳖虫配方颗粒特征图谱的构建方法，包括如下步骤：

供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加30％甲醇制成每1ml含10μg的对照品溶液，作为对照品参照物溶液。

对上述土鳖虫配方颗粒供试品溶液和对照品溶液各2μl注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，记录色谱图，色谱条件如下：色谱柱采用Venusil HILIC(4.6*150mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.7ml；检测波长为254nm；柱温为30℃。

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～10	92→90	8→10
10～17	90→88	10→12
			17～20	88→50	12→50
20～30	50	50
			30～40	50→92	50→8
40～50	92	8

结果显示，土鳖虫配方颗粒供试品色谱中呈现5个特征峰，与次黄嘌呤参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.51(峰1)、0.54(峰2)、0.82(峰3)、0.91(峰4)。

实施例2

本实施例提供了一种土鳖虫配方颗粒特征图谱的构建方法，包括如下步骤：

供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml含5μg的对照品溶液，作为对照品参照物溶液。

对照药材参照物溶液的制备：取土鳖虫(地鳖)对照药材1.0g，置具塞锥形瓶中，加50％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。

对上述土鳖虫配方颗粒供试品溶液、对照品溶液和对照药材参照物溶液各2μl注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，记录色谱图，色谱条件如下：色谱柱采用VenusilHILIC(4.6*150mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.7ml；检测波长为250nm；柱温为30℃。

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～10	92→90	8→10
10～17	90→88	10→12
			17～20	88→50	12→50
20～30	50	50
			30～40	50→92	50→8
40～50	92	8

结果显示，土鳖虫配方颗粒供试品色谱中呈现5个特征峰，并与对照药材参照物色谱峰中的5个特征峰保留时间相对应，与次黄嘌呤参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.51(峰1)、0.54(峰2)、0.82(峰3)、0.91(峰4)。

实施例3

本实施例提供了一种土鳖虫配方颗粒的质量检测方法，包括如下步骤：

供试品溶液的制备：取将待测土鳖虫配方颗粒产品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇40ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)40分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取次黄嘌呤对照品适量，精密称定，加20％甲醇制成每1ml含30μg的对照品溶液，作为对照品参照物溶液。

对上述土鳖虫配方颗粒供试品溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，记录色谱图，色谱条件如下：色谱柱采用Venusil HILIC(4.6*150mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，用以下梯度进行洗脱，流速为每分钟0.7ml；检测波长为260nm；柱温为30℃。

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0～10	92→90	8→10
10～17	90→88	10→12
			17～20	88→50	12→50
20～30	50	50
			30～40	50→92	50→8
40～50	92	8

若待测土鳖虫配方颗粒产品的特征图谱中呈现5个特征峰，与次黄嘌呤参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.51(峰1)、0.54(峰2)、0.82(峰3)、0.91(峰4)，则判定为质量合格，如果待测土鳖虫配方颗粒产品的特征图谱中没有呈现5个特征峰，或者相对保留时间超出规定值的±10％，判定为质量不合格。

发明所做的举例，而并非是对本发明实施方法的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种土鳖虫水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，

（1）供试品溶液的制备；供试品溶液的溶剂选自甲醇、水和乙醇中的至少一种；

（2）取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以丙基酰胺键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以水为流动相B；梯度洗脱程序如下：

。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，检测波长为250-260nm，流速为0.68-0.72mL/min，柱温为28-32℃。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）包括，称取土鳖虫供试品，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）还满足如下A-E中的任意一项或者多项：

A、土鳖虫供试品的质量与溶剂的体积之比为0.1-0.5：10-40；

B、提取方式为回流提取或者超声提取；

C、提取时间为≥0.3h；

D、所述固液分离选自离心或者过滤；

E、所述溶剂为体积百分数不大于50%的甲醇水溶液。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中提取时间为20-40min。

6.根据权利要求1-5中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用尿嘧啶对照品和/或次黄嘌呤对照品加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照权利要求1-5中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤；和/或，采用土鳖虫对照药材为参照物按照权利要求1-5中任一所述的构建方法中的步骤（1）制备对照品参照物溶液，按照权利要求1-5中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品参照物溶液得到对照品参照物图谱的步骤。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，每1mL对照品溶液中含5-30µg尿嘧啶和/或含5-30µg次黄嘌呤；和/或，对照品溶液制备中所采用的溶剂选自水或者体积分数不大于50%的甲醇水溶液。

8.根据权利要求1-5中任一所述的构建方法，其特征在于，所述土鳖虫水提取物及其制剂的对照特征图谱选自如下（1）-（3）中的任意一项：

（1）其具有5个共有特征峰，以次黄嘌呤峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10%的范围之内；峰1-峰5的规定值为：0.51、0.54、0.82、0.91和1.00；

（2）使用单批次或者多批次土鳖虫水提取物和/或其制剂供试品按照权利要求1-5中任一所述的构建方法得到的土鳖虫水提取物和/或其制剂的特征图谱；

（3）使用多批次土鳖虫水提取物和/或制剂供试品按照权利要求1-5中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。

9.一种土鳖虫水提取物及其制剂的质量检测方法，其特征在于，包括将待测土鳖虫产品的特征图谱与土鳖虫水提取物及其制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测土鳖虫产品的特征图谱为使用待测土鳖虫产品按照权利要求1-7中任一所述的构建方法得到，所述土鳖虫水提取物及其制剂对照特征图谱选自如下（1）-（3）中的任意一项：

（1）其具有5个共有特征峰，以次黄嘌呤峰为参照峰，各特征峰与参照峰的相对保留时间在规定值的±10%的范围之内；峰1-峰5的规定值为：0.51、0.54、0.82、0.91和1.00；

（2）使用单批次或者多批次土鳖虫水提取物和/或其制剂供试品按照权利要求1-7中任一所述的构建方法得到的土鳖虫水提取物和/或其制剂的特征图谱；

（3）使用多批次土鳖虫水提取物和/或制剂供试品按照权利要求1-7中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。

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