CN115541756A - 车前科中药药材或制剂的指纹图谱的构建方法、检测方法和鉴别方法 - Google Patents
车前科中药药材或制剂的指纹图谱的构建方法、检测方法和鉴别方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及中药检测技术领域，特别是涉及车前科中药药材或制剂的指纹图谱的构建方法、检测方法和鉴别方法。所述指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：取车前科中药药材或车前科中药制剂，加提取溶剂进行提取处理，收集提取液，制备供试品溶液；取所述供试品溶液进行超高效液相色谱测定。本发明所构建的指纹图谱可以对车前草药材、车前草制剂、车前子药材、车前子制剂进行检测，判断各自的质量，还可以区分车前草制剂和车前子制剂，从内在质量上实现二者的专属性鉴别，弥补原材料外观及显微特征缺失而造成鉴别不准确的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及中药检测技术领域，特别涉及车前科中药药材或制剂的指纹图谱的构建方法、检测方法和鉴别方法，具体涉及车前草中药药材、车前子中药药材、车前草中药制剂或车前子中药制剂的指纹图谱的构建方法、车前草中药药材、车前子中药药材、车前草中药制剂或车前子中药制剂的检测方法以及车前草中药制剂和车前子中药制剂的鉴别方法。
背景技术
2020版中国药典收载了车前草和车前子两味中药，均来源于车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressa Willd植株，两者的性味归经一致，功效上均可清热利尿通淋和祛痰。但二者也存在一定差异，车前草的药用部位为干燥全草，而车前子则为干燥成熟种子；功效上车前子长于渗湿止泻，兼可明目，车前草则长于凉血解毒。中国药典2020年版车前草含量测定项下的检测指标为大车前苷，车前子的含量测定检测指标为京尼平苷酸和毛蕊花糖苷，而现代研究表明，以上三种成分在车前子和车前草中均存在，仅依据这三种成分难以全面反映车前草和车前子的整体质量。
中药药材一般指净药材以及对净药材进一步切制、炮炙而成的中药饮片。中药制剂一般以中药药材为原料，经过提取工艺制成。
中药配方颗粒是一种中药制剂，具有冲服、剂量调解方便，规格标准统一，且具有与相应传统饮片主治功效一致等特点。车前草和车前子配方颗粒分别是以水为溶媒提取车前草饮片和车前子饮片，并经浓缩、干燥、制粒成型等生产工艺所制成的。由于中药制剂失去了净药材和饮片所具有的鉴别特征，已无法从药材原有的形状、色泽、质地、断面、气味等性状进行检查与鉴别。
发明内容
基于此，本发明一方面提供一种车前科中药药材或制剂的指纹图谱的构建方法。其技术方案如下：
一种车前科中药药材或制剂的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
取车前科中药药材或车前科中药制剂，加提取溶剂进行提取处理，收集提取液，制备供试品溶液，所述车前科中药药材为车前草中药药材或车前子中药药材；所述车前科中药制剂为车前草中药配方颗粒、车前子中药配方颗粒、车前草中药提取物或车前子中药提取物；
取所述供试品溶液进行超高效液相色谱测定；
所述超高效液相色谱的色谱条件包括：
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括乙腈，所述流动相B包括磷酸水溶液，梯度洗脱；
所述梯度洗脱包括以下程序：
0min～1min，所述流动相A的体积分数保持7％，所述流动相B的体积分数保持93％；
1min～5min，所述流动相A的体积分数由7％升高至12％，所述流动相B的体积分数由93％降低至88％；
5min～13min，所述流动相A的体积分数由12％升高至15％，所述流动相B的体积分数由88％降低至85％；
13min～20min，所述流动相A的体积分数保持15％，所述流动相B的体积分数保持85％；
20min～33min，所述流动相A的体积分数由15％升高至25％，所述流动相B的体积分数由85％降低至75％；
33min～35min，所述流动相A的体积分数由25％升高至62％，所述流动相B的体积分数由75％降低至38％；
35min～40min，所述流动相A的体积分数由62％升高至65％，所述流动相B的体积分数由38％降低至35％；
40min～43min，所述流动相A的体积分数由65％升高至80％，所述流动相B的体积分数由35％降低至20％；
43min～44min，所述流动相A的体积分数由80％降低至7％，所述流动相B的体积分数由20％升高至93％；
44min～55min，所述流动相A的体积分数保持7％，所述流动相B的体积分数保持93％。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：0min～8.5min，检测波长为240nm～250nm；8.5min～40min，检测波长为325nm～335nm；40min～55min，检测波长为240nm～250nm。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：柱温为28℃～32℃。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：流速为0.25mL/min～0.35mL/min。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：进样量为1μL～2μL。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：所述磷酸水溶液中磷酸的体积分数为0.05％～0.2％。
在其中一些实施例中，对所述车前科中药药材进行提取处理的方法为加热回流。
在其中一些实施例中，对所述车前科中药制剂进行提取处理的方法为超声提取。
在其中一些实施例中，每1g所述车前草中药药材对应加入30mL～70mL的所述提取溶剂。
在其中一些实施例中，每1g所述车前子中药药材对应加入20mL～30mL的所述提取溶剂。
在其中一些实施例中，每0.2g所述车前科中药制剂对应加入20mL～30mL的所述提取溶剂。
在其中一些实施例中，所述提取溶剂为甲醇水溶液。
在其中一些实施例中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40％～80％。
在其中一些实施例中，所述加热回流的温度为70℃～90℃，加热回流的时间为40min～150min。
当对车前草中药药材进行加热回流时，加热回流的时间为40min～80min；当对车前子中药药材进行加热回流时，加热回流的时间为90min～150min。
在其中一些实施例中，所述超声提取的时间为20min～40min。
本发明第二方面提供一种车前科中药药材或制剂的检测方法。其技术方案如下：
一种车前科中药药材或制剂的检测方法，包括以下步骤：
取待测车前科中药药材或待测车前科中药制剂，加提取溶剂进行提取处理，收集提取液，制备待测样品溶液，所述待测车前科中药药材为待测车前草中药药材或待测车前子中药药材，所述待测车前科中药制剂为待测车前草中药配方颗粒、待测车前子中药配方颗粒、待测车前草中药提取物或待测车前子中药提取物；
按照上述的色谱条件对所述待测样品溶液进行超高效液相色谱测定，将所得色谱图与上述的车前科中药药材或车前科中药制剂的指纹图谱对应，判断所述待测车前科中药药材或待测车前科中药制剂是否合格。
在其中一些实施例中，对所述待测车前科中药药材进行提取处理的方法为加热回流。
在其中一些实施例中，对所述待测车前科中药制剂进行提取处理的方法为超声提取。
在其中一些实施例中，每1g所述待测车前草中药药材对应加入30mL～70mL的所述提取溶剂。
在其中一些实施例中，每1g所述待测车前子中药药材对应加入20mL～30mL的所述提取溶剂。
在其中一些实施例中，每0.2g所述待测车前科中药制剂对应加入20mL～30mL的所述提取溶剂。
在其中一些实施例中，所述提取溶剂为甲醇水溶液。
在其中一些实施例中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40％～80％。
在其中一些实施例中，所述加热回流的温度为70℃～90℃，加热回流的时间为40min～150min。
当对待测车前草中药药材进行加热回流时，加热回流的时间为40min～80min；当对待测车前子中药药材进行加热回流时，加热回流的时间为90min～150min。
所述超声提取的时间为20min～40min。
本发明第三方面提供一种车前草中药制剂和车前子中药制剂的鉴别方法。其技术方案如下：
一种车前草中药制剂和车前子中药制剂的鉴别方法，包括以下步骤：
取待测车前科中药制剂，加提取溶剂进行提取处理，收集提取液，制备待测样品溶液；
按照上述的色谱条件对所述待测样品溶液进行超高效液相色谱测定，将所得色谱图与上述的车前科中药制剂的指纹图谱对应，确定所述待测车前科中药制剂的种类。
在其中一些实施例中，对所述待测车前科中药制剂进行提取处理的方法为超声提取。
在其中一些实施例中，每0.2g所述待测车前科中药制剂对应加入20mL～30mL的所述提取溶剂。
在其中一些实施例中，所述待测车前科中药制剂为待测车前草中药配方颗粒、待测车前子中药配方颗粒、待测车前草中药提取物或待测车前子中药提取物。
在其中一些实施例中，所述提取溶剂为甲醇水溶液。
在其中一些实施例中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40％～80％。
在其中一些实施例中，所述超声提取的时间为20min～40min。
与传统方案相比，本发明具有以下有益效果：
中药指纹图谱是中药整体性的化学表征，在中药质量评价方面应用广泛。但传统的关于车前草或车前子的指纹图谱的研究尚不完善。
本发明根据车前草和车前子所含的差异成分，合理控制超高效液相色谱的流动相条件，构建的中药指纹图谱中共有峰标定和指认数量较多，实现了车前草和车前子的全成分的图谱分析，且还明确了车前草和车前子的共有成分和差异性成分。根据本发明构建的指纹图谱，可以对车前草药材、车前草制剂、车前子药材、车前子制剂进行检测，判断各自的质量，还可以区分车前草制剂和车前子制剂，从内在质量上实现二者的专属性鉴别，弥补原材料外观及显微特征缺失而造成鉴别不准确的缺陷，方法高效便捷，结果客观。本发明为研究车前草和车前子的药理药效提供参考，同时也为二者的质量综合评价的研究提供科学的实验依据。同时，本发明的构建方法专属性高、方法稳定，精密可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为14批车前草药材的色谱叠加图；
图2为12批车前子药材的色谱叠加图；
图3为8批车前草配方颗粒的色谱叠加图和车前草配方颗粒对照指纹图谱R；
图4为8批车前子配方颗粒的色谱叠加图和车前子配方颗粒对照指纹图谱R；
图5为混合对照品溶液的色谱图，其中峰3为京尼平苷酸、峰15为大车前苷、峰17为木犀草苷、峰19为毛蕊花糖苷、峰20为车前草苷D、峰21为异毛蕊花糖苷；
图6为车前草药材(A)、车前子药材(B)对照指纹图谱及车前子药材对照指纹图谱局部放大图(C)；
图7为车前草待测药材的色谱图和车前草药材对照指纹图谱的对比图；
图8为车前子待测药材的色谱图和车前子药材对照指纹图谱的对比图；
图9为车前草待测配方颗粒的色谱图和车前草配方颗粒对照指纹图谱的对比图；
图10为车前子待测配方颗粒的色谱图和车前子配方颗粒对照指纹图谱的对比图；
图11为待测车前科配方颗粒1的色谱图、车前草配方颗粒对照指纹图谱和车前子配方颗粒对照指纹图谱的对比图；
图12为待测车前科配方颗粒2的色谱图、车前草配方颗粒对照指纹图谱和车前子配方颗粒对照指纹图谱的对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
1仪器与材料
1.1仪器
Waters ACQUITY型超高效液相色谱系统(美国Waters公司)；Thermo Vanquish型超高效液相色谱系统；Thermo ICAPQ型电感耦合等离子体质谱仪(美国赛默飞公司)；ME204E型分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HWS28型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)。
1.2材料
京尼平苷酸(批号：11828-201805，纯度98.1％，中国食品药品检定研究院)；大车前苷(批号：111914-202105，纯度96.0％，中国食品药品检定研究院)；木犀草苷(批号：111720-202111，纯度96.6％，中国食品药品检定研究院)；毛蕊花糖苷(批号：111530-201914，纯度95.2％，中国食品药品检定研究院)；异毛蕊花糖苷(批号：19092702，纯度98.58％，成都普菲德生物技术有限公司)；车前草苷D(批号：CFS202101，纯度98.0％，ChemFaces公司)；甲醇(分析纯，天津富宇精细化工有限公司)，甲醇、乙腈(色谱纯，默克股份有限公司)，磷酸(色谱纯，佛山西陇化学有限公司)，水为超纯水(取自实验室Milli-Q超纯水系统)。
14批车前草药材经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为车前科植物车前(Plantago asiatica L.)的干燥全草，12批车前子药材经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为车前科植物车前(Plantago asiatica L.)的干燥成熟种子，来源信息见表1。8批车前草配方颗粒和8批车前子配方颗粒样品均为广东一方制药有限公司生产制备，制备方法如下：
取车前草饮片4500g，加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏(干浸膏出膏率为14％～22％)，加入辅料适量，干燥(或干燥，粉碎)，再加入辅料适量，混匀，制粒，制成1000g，即得车前草配方颗粒。
取车前子饮片5000g，加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏(干浸膏出膏率为8.5％～13％)，加辅料适量，干燥(或干燥，粉碎)，再加辅料适量，混匀，制粒，制成1000g，即得车前子配方颗粒。
表1
| 编号 | 产地 | 编号 | 产地 |
| CQC 01 | 江苏省淮安市 | CQZ 01 | 江西省吉安市 |
| CQC 02 | 江苏省淮安市 | CQZ 02 | 江西省九江市 |
| CQC 03 | 江苏省淮安市 | CQZ 03 | 江西省九江市 |
| CQC 04 | 江西省宜春市 | CQZ 04 | 江西省樟树市 |
| CQC 05 | 四川省德阳市 | CQZ 05 | 江西省樟树市 |
| CQC 06 | 四川省德阳市 | CQZ 06 | 江西省九江市 |
| CQC 07 | 安徽省宣城市 | CQZ 07 | 江西省樟树市 |
| CQC 08 | 安徽省宣城市 | CQZ 08 | 江西省樟树市 |
| CQC 09 | 四川省德阳市 | CQZ 09 | 江西省樟树市 |
| CQC 10 | 江西省宜春市 | CQZ 10 | 江西省吉安市 |
| CQC 11 | 四川省德阳市 | CQZ 11 | 江西省吉安市 |
| CQC 12 | 江西省宜春市 | CQZ 12 | 江西省樟树市 |
| CQC 13 | 江苏省淮安市 | ||
| CQC 14 | 江西省宜春市 |
2.方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.1％的磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱(0～1min，7％A；1～5min，7％～12％A；5～13min，12％～15％A；13～20min，15％A；20～33min，15％～25％A；33～35min，25％～62％A；35～40min，62％～65％A；40～43min，65％～80％A；43～44min，80％～7％A；44～55min，7％A)；程序检测波长：245nm(0～8.5min)、330nm(8.5～40min)、245nm(40～55min)；流速0.3mL/min；柱温30℃；进样量1μL。
2.2供试品溶液制备
取车前草药材粉末(过二号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为60％的甲醇水溶液50mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，称定重量，用体积分数为60％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得车前草药材供试品溶液。
取车前子药材粉末(过二号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为60％的甲醇水溶液25mL，称定重量，加热回流2小时，放冷，称定重量，用体积分数为60％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得车前子药材供试品溶液。
取车前草配方颗粒0.2g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为60％的甲醇水溶液25mL，称定重量，超声30min，称定重量，用体积分数为60％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得车前草配方颗粒供试品溶液。
取车前子配方颗粒0.2g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为60％的甲醇水溶液25mL，称定重量，超声30min，称定重量，用体积分数为60％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得车前子配方颗粒供试品溶液。
2.3对照品溶液制备
精密称取京尼平苷酸、大车前苷、木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、车前草苷D对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为193.16、48.91、47.53、144.94、47.71、64.97μg/mL的混合对照品溶液。
2.4测定法
分别精密吸取“2.3”项下的混合对照品溶液与“2.2”项下的供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，按照“2.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图，即得混合对照品溶液的色谱图、14批车前草药材的色谱图、12批车前子药材的色谱图、8批车前草配方颗粒的色谱图和8批车前子配方颗粒的色谱图。
2.5精密度试验
取“2.2”项下车前草药材供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以大车前苷参照物峰相应的峰为S峰，计算得：各峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.04％～0.56％，相对峰面积RSD范围为0.24％～4.95％，表明仪器精密度良好。
取“2.2”项下车前子药材供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以毛蕊花糖苷参照物峰相应的峰为S峰，计算得：各峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.02％～0.23％，相对峰面积RSD范围为0.19％～3.64％，表明仪器精密度良好。
取“2.2”项下车前草配方颗粒供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以大车前苷参照物峰相应的峰为S峰，计算得：各峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.02％～0.66％，相对峰面积RSD范围为0.18％～4.73％，表明仪器精密度良好。
取“2.2”项下车前子配方颗粒供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以毛蕊花糖苷参照物峰相应的峰为S峰，计算得：各峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.04％～0.31％，相对峰面积RSD范围为0.17％～3.96％，表明仪器精密度良好。
2.6重复性试验
取车前草药材粉末(过二号筛)，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得：各峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.05％～1.01％，相对峰面积RSD范围为0.13％～4.29％，表明该方法重复性良好。
取车前子药材粉末(过二号筛)，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得：各峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.03％～0.36％，相对峰面积RSD范围为0.13％～4.26％，表明该方法重复性良好。
取车前草配方颗粒，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得：各峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.03％～1.10％，相对峰面积RSD范围为0.11％～4.17％，表明该方法重复性良好。
取车前子配方颗粒，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得：各峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.04％～0.42％，相对峰面积RSD范围为0.15％～4.34％，表明该方法重复性良好。
2.7稳定性试验
取“2.2”项下车前草药材供试品溶液，分别在制备后0，2，4，8，12，18，24h进样测定，计算得：各峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.11％～1.01％，相对峰面积RSD范围为0.11％～4.18％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
取“2.2”项下车前子药材供试品溶液，分别在制备后0，2，4，8，12，18h进样测定，计算得：各峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.01％～0.27％，相对峰面积RSD范围为0.16％～3.94％，表明供试品溶液在18h内稳定性良好。
取“2.2”项下车前草配方颗粒供试品溶液，分别在制备后0，2，4，8，12，18，24h进样测定，计算得：各峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.08％～1.05％，相对峰面积RSD范围为0.14％～4.25％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
取“2.2”项下车前子配方颗粒供试品溶液，分别在制备后0，2，4，8，12，18h进样测定，计算得：各峰与S峰的相对保留时间RSD范围为0.01％～0.32％，相对峰面积RSD范围为0.13％～3.89％，表明供试品溶液在18h内稳定性良好。
2.8参照峰和共有峰的选择
14批车前草药材的色谱叠加图如图1所示，比较14批车前草药材所得色谱图，按共有峰出现率100％计，确定了22个共有峰，见图1。
12批车前子药材的色谱叠加图如图2所示，比较12批车前子药材所得色谱图，按共有峰出现率100％计，确定了25个共有峰，见图2。
8批车前草配方颗粒的色谱叠加图如图3所示，比较8批车前草配方颗粒所得色谱图，按共有峰出现率100％计，确定了18个共有峰，见图3。
8批车前子配方颗粒的色谱叠加图如图4所示，比较8批车前子配方颗粒所得色谱图，按共有峰出现率100％计，确定了14个共有峰，见图4。
2.9色谱峰指认
采用京尼平苷酸、大车前苷、木犀草苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、车前草苷D等对照品进行定位，参见图5，为混合对照品溶液的色谱图，结果表明：峰3为京尼平苷酸、峰15为大车前苷、峰17为木犀草苷、峰19为毛蕊花糖苷、峰20为车前草苷D和峰21为异毛蕊花糖苷。
2.10色谱峰结果
14批车前草药材、12批车前子药材、8批车前草配方颗粒、8批车前子配方颗粒指纹图谱数据见表2～表9。其中，表2为14批车前草药材各峰保留时间；表3为14批车前草药材各峰峰面积值；表4为12批车前子药材各峰保留时间；表5为12批车前子药材各峰峰面积值；表6为8批车前草配方颗粒各峰保留时间；表7为8批车前草配方颗粒各峰峰面积值；表8为8批车前子配方颗粒各峰保留时间；表9为8批车前子配方颗粒各峰峰面积值。
表2
表3
表4
表5
表6
表7
表8
表9
2.11对照指纹图谱的建立和相似度评价
将14批车前草药材、12批车前子药材、8批车前草配方颗粒、8批车前子配方颗粒的色谱图各自导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，分别以CQC 01、CQZ 01、CQCK1、CQZ K1号为参照，采用中位数法生成各自的叠加图谱(见图1、2、3、4)和对照指纹图谱(见图3中R、图4中R和图6中A、B和C)。
分别以生成的对照指纹图谱为参照，其他批次的相似度评价结果见表10和表11所示，结果表明：相似度均在0.9以上。
表10
| 编号 | 车前草相似度 | 编号 | 车前子相似度 |
| CQC 01 | 0.996 | CQZ 01 | 0.993 |
| CQC 02 | 0.997 | CQZ 02 | 0.989 |
| CQC 03 | 0.997 | CQZ 03 | 0.999 |
| CQC 04 | 0.999 | CQZ 04 | 0.997 |
| CQC 05 | 0.961 | CQZ 05 | 1.000 |
| CQC 06 | 0.978 | CQZ 06 | 0.997 |
| CQC 07 | 0.992 | CQZ 07 | 0.999 |
| CQC 08 | 0.976 | CQZ 08 | 1.000 |
| CQC 09 | 0.998 | CQZ 09 | 0.999 |
| CQC 10 | 0.997 | CQZ 10 | 0.997 |
| CQC 11 | 1.000 | CQZ 11 | 0.974 |
| CQC 12 | 0.999 | CQZ 12 | 0.998 |
| CQC 13 | 0.997 | ||
| CQC 14 | 0.999 |
表11
| 编号 | 车前草相似度 | 编号 | 车前子相似度 |
| CQC K1 | 0.964 | CQZ K1 | 0.999 |
| CQC K2 | 0.958 | CQZ K2 | 0.999 |
| CQC K3 | 0.978 | CQZ K3 | 0.998 |
| CQC K4 | 0.979 | CQZ K4 | 1.000 |
| CQC K5 | 0.981 | CQZ K5 | 0.999 |
| CQC K6 | 0.981 | CQZ K6 | 0.997 |
| CQC K7 | 0.981 | CQZ K7 | 0.998 |
| CQC K8 | 0.981 | CQZ K8 | 0.999 |
将8批车前草配方颗粒色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，以上文生成的车前子配方颗粒对照指纹图谱为参照，相似度评价结果见表12所示，结果表明：相似度均在0.25以下。将8批车前子配方颗粒色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，以上文生成的车前草配方颗粒对照指纹图谱为参照，相似度评价结果见表12所示，结果表明：相似度均在0.2以下，说明建立的车前草和车前子配方颗粒指纹图谱有明显差异，可用于二者的鉴别。
表12
3指纹图谱结果分析
3.1车前草和车前子药材结果分析
3.1.1车前草和车前子药材的峰面积独立样品t检验
将14批车前草药材、12批车前子药材的峰面积经数据处理后分别导入SPSS 25.0进行独立样本t检验，经正态性检验后，计算得到显著性的结果。所得结果如表13所示(单位：mAU*min)。除峰1、峰8和峰12外，其余各峰面积均有统计学差异(P＜0.05)。车前草中峰2、峰7、峰9、峰10、峰11、峰15(大车前苷)、峰16、峰20(车前草苷D)、峰26、峰28、峰29、峰31均大于车前子(P＜0.05)，而峰3(京尼平苷酸)、峰4、峰13、峰14、峰17(木犀草苷)、峰19(毛蕊花糖苷)、峰22、峰25、峰30均小于车前子。其中，峰4、峰13、峰14、峰17(木犀草苷)、峰22、峰25仅在部分批次车前草中检出，峰2、峰10、峰11、峰26、峰31仅在部分批次车前子中检出。此外，峰5、峰21(异毛蕊花糖苷)、峰24、峰27在车前草中均未检出，主要存在于车前子中；峰18、峰23在车前子中均未检出，主要存在于车前草中。说明上述6个特征峰分别为车前子和车前草药材的专属性成分。
表13
| 成分编号 | 车前草 | 车前子 |
| 峰1 | 0.300±0.185 | 0.230±0.102 |
| 峰2 | 0.353±0.134** | 0.033±0.037** |
| 峰3 | 0.616±0.468** | 31.755±7.427** |
| 峰4 | 0.004±0.009** | 0.114±0.063** |
| 峰5 | 0.000±0.000** | 0.234±0.042** |
| 峰6 | 0.102±0.013* | 0.118±0.019* |
| 峰7 | 0.413±0.174** | 0.033±0.004** |
| 峰8 | 0.119±0.045 | 0.133±0.040 |
| 峰9 | 0.126±0.043** | 0.045±0.010** |
| 峰10 | 0.487±0.063** | 0.010±0.006** |
| 峰11 | 0.553±0.070** | 0.005±0.009** |
| 峰12 | 0.072±0.011* | 0.093±0.027* |
| 峰13 | 0.007±0.012** | 0.109±0.035** |
| 峰14 | 0.007±0.009** | 0.097±0.017** |
| 峰15 | 9.982±2.727** | 0.757±0.092** |
| 峰16 | 3.904±1.749** | 0.158±0.027** |
| 峰17 | 0.009±0.011** | 0.126±0.022** |
| 峰18 | 0.478±0.138** | 0.000±0.000** |
| 峰19 | 0.252±0.092** | 42.277±2.267** |
| 峰20 | 0.571±0.105** | 0.331±0.038** |
| 峰21 | 0.000±0.000** | 4.750±0.522** |
| 峰22 | 0.048±0.032** | 0.617±0.054** |
| 峰23 | 0.695±0.300** | 0.000±0.000** |
| 峰24 | 0.000±0.000** | 0.114±0.029** |
| 峰25 | 0.016±0.011** | 0.109±0.023** |
| 峰26 | 0.111±0.040** | 0.010±0.007** |
| 峰27 | 0.000±0.000** | 0.057±0.006** |
| 峰28 | 0.240±0.154** | 0.028±0.012** |
| 峰29 | 0.243±0.226** | 0.040±0.017** |
| 峰30 | 0.424±0.230** | 1.380±0.545** |
| 峰31 | 0.257±0.125** | 0.023±0.026** |
| 峰32 | 0.476±0.191 | 0.417±0.290 |
注：车前草与车前子间的显著性“*”，其中“*”表示显著性P<0.05，“**”表示显著性P<0.001。
3.2车前草和车前子配方颗粒结果分析与鉴别
3.2.1车前草和车前子配方颗粒的峰面积独立样品t检验
将8批车前草、8批车前子配方颗粒的峰面积经数据处理后分别导入SPSS 25.0进行独立样本t检验，经正态性检验后，计算得到显著性的结果。所得结果如表14所示。除峰1、峰9、峰19和峰29外，其余各峰面积均存在显著性差异。峰2、峰7、峰8、峰10、峰11、峰12、峰15(大车前苷)、峰16、峰18、峰20(车前草苷D)、峰23、峰26、峰28、峰32在车前草配方颗粒中均显著高于车前子配方颗粒，而峰3(京尼平苷酸)、峰4、峰5、峰13、峰14、峰17(木犀草苷)、峰19(毛蕊花糖苷)、峰21(异毛蕊花糖苷)、峰22则在车前子配方颗粒中显著高于车前草配方颗粒。其中，峰4、峰8、峰13、峰21(异毛蕊花糖苷)、峰22仅在部分批次车前草配方颗粒中检出，峰15、峰28、峰28仅在部分批次车前子配方颗粒中检出。此外，峰14在车前草配方颗粒中基本测不出，主要存在于车前子配方颗粒中；峰2、峰10、峰11、峰12、峰18、峰23、峰26、峰32在中车前子配方颗粒基本测不出，主要存在于车前草配方颗粒中。说明上述9个特征峰分别为车前子和车前草配方颗粒的专属性成分，是车前子和车前草配方颗粒之间最显著的质量差异标志成分，可用于已失去车前子或车前草药材性状的配方颗粒的专属性鉴别，进一步地，上述9个特征峰还可扩展到作为车前子其他形式制剂和车前草其他形式制剂的专属性成分，用于已失去车前子或车前草药材性状的其他制剂的专属性鉴别。
表14
| 成分编号 | 车前草 | 车前子 |
| 峰1 | 1.073±0.543 | 0.695±0.143 |
| 峰2 | 1.293±0.327** | 0.000±0.000** |
| 峰3 | 2.242±0.565** | 87.238±25.898** |
| 峰4 | 0.007±0.021** | 0.435±0.155** |
| 峰5 | 0.497±0.179** | 0.833±0.153** |
| 峰7 | 2.131±0.806** | 0.490±0.086** |
| 峰8 | 0.873±0.371* | 0.462±0.136* |
| 峰9 | 1.627±0.245 | 1.339±0.466 |
| 峰10 | 1.127±0.050** | 0.000±0.000** |
| 峰11 | 0.966±0.126** | 0.000±0.000** |
| 峰12 | 3.832±2.620** | 0.000±0.000** |
| 峰13 | 0.103±0.125** | 0.428±0.107** |
| 峰14 | 0.000±0.000** | 0.328±0.088** |
| 峰15 | 10.843±2.075** | 0.196±0.343** |
| 峰16 | 4.691±2.936** | 0.439±0.123** |
| 峰18 | 2.358±0.464** | 0.000±0.000** |
| 峰19 | 7.935±1.845 | 9.704±1.901 |
| 峰20 | 16.119±4.654** | 1.044±0.202** |
| 峰21 | 3.481±2.296** | 42.059±8.100** |
| 峰22 | 0.075±0.104** | 0.789±0.126** |
| 峰23 | 0.884±0.548** | 0.000±0.000** |
| 峰26 | 0.599±0.060** | 0.000±0.000** |
| 峰28 | 0.978±0.149** | 0.026±0.029** |
| 峰29 | 0.436±0.136 | 0.165±0.370 |
| 峰32 | 0.122±0.034** | 0.000±0.000** |
注：车前草与车前子间的显著性“*”，其中“*”表示显著性P<0.05，“**”表示显著性P<0.001。
3.2.2鉴别标准
根据上述分析结果，车前草配方颗粒和车前子配方颗粒的鉴别标准可以是：
若待测车前科配方颗粒的色谱图出现与上述构建的车前草配方颗粒的指纹图谱保留时间一致的18个特征峰，尤其是出现峰2、峰10、峰11、峰12、峰18、峰23、峰26和峰32。则待测车前科配方颗粒为车前草配方颗粒。
若待测车前科配方颗粒的色谱图出现与上述构建的车前子配方颗粒的指纹图谱保留时间一致的14个特征峰，尤其是出现峰14，则待测车前科配方颗粒为车前子配方颗粒。
进一步地，车前草其他形式制剂和车前子其他形式制剂也可通过上述鉴别标准进行鉴别，其中，其他形式制剂可以是提取物等。
4.车前科药材的检测
4.1车前科待测药材的待测样品溶液的制备
取车前草待测药材的粉末(过二号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为60％的甲醇水溶液50mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，称定重量，用体积分数为60％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得车前草待测药材的待测样品溶液。
取车前子待测药材的粉末(过二号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为60％的甲醇水溶液25mL，称定重量，加热回流2小时，放冷，称定重量，用体积分数为60％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得车前子待测药材的待测样品溶液。
4.2测定法
精密吸取“4.1”项下的车前草待测药材的待测样品溶液和车前子待测药材的待测样品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，按照“2.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图，如图7、图8所示。
将车前草待测药材的色谱图和车前子待测药材的色谱图与上述构建的车前草药材对照指纹图谱、车前子药材对照指纹图谱(图6)对比。可知，车前草待测药材的色谱图出现与上述构建的车前草药材对照指纹图谱相同的22个峰，与对照指纹图谱的相似度为0.994；车前子待测药材的色谱图出现与上述构建的车前子药材对照指纹图谱相同的25个峰，与对照指纹图谱的相似度为0.988，可以初步认为：车前草待测药材和车前子待测药材均品质稳定，符合指纹图谱的质量要求。
5.车前科配方颗粒的检测
5.1车前科待测配方颗粒的待测样品溶液的制备
分别取车前草待测配方颗粒和车前子待测配方颗粒各0.2g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为60％的甲醇水溶液25mL，称定重量，超声30min，称定重量，用体积分数为60％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得车前草待测配方颗粒的待测样品溶液和车前子待测配方颗粒的待测样品溶液。
5.2测定法
精密吸取“5.1”项下的车前草待测配方颗粒的待测样品溶液和车前子待测配方颗粒待测样品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，按照“2.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图，如图9、图10所示。
将车前草待测配方颗粒和车前子待测配方颗粒的色谱图与上述构建的车前草配方颗粒对照指纹图谱(图3)、车前子配方颗粒对照指纹图谱(图4)对比。可知，车前草待测配方颗粒的色谱图出现与上述构建的车前草配方颗粒对照指纹图谱相同的18个峰，与对照指纹图谱的相似度为0.909；车前子待测配方颗粒的色谱图出现与上述构建的车前子配方颗粒对照指纹图谱相同的14个峰，与对照指纹图谱的相似度为0.998，可以初步认为：车前草待测配方颗粒和车前子待测配方颗粒品质稳定，符合指纹图谱的质量要求。
6.车前科配方颗粒的鉴别
6.1待测车前科配方颗粒的待测样品溶液的制备
分别取待测车前科配方颗粒1和待测车前科配方颗粒2各0.2g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为60％的甲醇水溶液25mL，称定重量，超声30min，称定重量，用体积分数为60％的甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得待测车前科配方颗粒1的待测样品溶液和待测车前科配方颗粒2的待测样品溶液。
6.2测定法
精密吸取“6.1”项下的待测车前科配方颗粒1的待测样品溶液和待测车前科配方颗粒2的待测样品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，按照“2.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图，如图11、图12所示。
将待测车前科配方颗粒1和待测车前科配方颗粒2的色谱图与上述构建的车前草配方颗粒对照指纹图谱(图3)、车前子配方颗粒对照指纹图谱(图4)对比。可知：1)待测车前科配方颗粒1的色谱图检出与车前草配方颗粒对照指纹图谱相同的18个峰，且与车前草配方颗粒对照指纹图谱的相似度为0.924；未检测出车前子配方颗粒特有的峰5、峰21(异毛蕊花糖苷)、峰24、峰27，且与车前子配方颗粒对照指纹图谱的相似度为0.198，可以初步判定待测车前科配方颗粒1为车前草配方颗粒且未混有车前子配方颗粒。2)待测车前科配方颗粒2的色谱图检出与车前子配方颗粒对照指纹图谱相同的14个峰，与车前子配方颗粒对照指纹图谱的相似度为0.998；未检测出车前草配方颗粒特有的峰18、峰23，且与车前草配方颗粒对照指纹图谱的相似度为0.185，可以初步判定待测车前科配方颗粒2为车前子配方颗粒且未混有车前草配方颗粒。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种车前科中药药材或制剂的指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
取车前科中药药材或车前科中药制剂，加提取溶剂进行提取处理，收集提取液，制备供试品溶液，所述车前科中药药材为车前草中药药材或车前子中药药材；所述车前科中药制剂为车前草中药配方颗粒、车前子中药配方颗粒、车前草中药提取物或车前子中药提取物；
取所述供试品溶液进行超高效液相色谱测定；
所述超高效液相色谱的色谱条件包括：
流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A包括乙腈，所述流动相B包括磷酸水溶液，梯度洗脱；
所述梯度洗脱包括以下程序：
0min～1min，所述流动相A的体积分数保持7％，所述流动相B的体积分数保持93％；
1min～5min，所述流动相A的体积分数由7％升高至12％，所述流动相B的体积分数由93％降低至88％；
5min～13min，所述流动相A的体积分数由12％升高至15％，所述流动相B的体积分数由88％降低至85％；
13min～20min，所述流动相A的体积分数保持15％，所述流动相B的体积分数保持85％；
20min～33min，所述流动相A的体积分数由15％升高至25％，所述流动相B的体积分数由85％降低至75％；
33min～35min，所述流动相A的体积分数由25％升高至62％，所述流动相B的体积分数由75％降低至38％；
35min～40min，所述流动相A的体积分数由62％升高至65％，所述流动相B的体积分数由38％降低至35％；
40min～43min，所述流动相A的体积分数由65％升高至80％，所述流动相B的体积分数由35％降低至20％；
43min～44min，所述流动相A的体积分数由80％降低至7％，所述流动相B的体积分数由20％升高至93％；
44min～55min，所述流动相A的体积分数保持7％，所述流动相B的体积分数保持93％。
2.根据权利要求1所述的车前科中药药材或制剂的指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括以下条件中的至少一个：
0min～8.5min，检测波长为240nm～250nm；8.5min～40min，检测波长为325nm～335nm；40min～55min，检测波长为240nm～250nm；
柱温为28℃～32℃；
流速为0.25mL/min～0.35mL/min；
进样量为1μL～2μL；
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
所述磷酸水溶液中磷酸的体积分数为0.05％～0.2％。
3.根据权利要求1或2所述的车前科中药药材或制剂的指纹图谱的构建方法，其特征在于，还包括以下特征中的至少一项：
对所述车前科中药药材进行提取处理的方法为加热回流；
对所述车前科中药制剂进行提取处理的方法为超声提取；
每1g所述车前草中药药材对应加入30mL～70mL的所述提取溶剂；
每1g所述车前子中药药材对应加入20mL～30mL的所述提取溶剂；
每0.2g所述车前科中药制剂对应加入20mL～30mL的所述提取溶剂；
所述提取溶剂为甲醇水溶液。
4.根据权利要求3所述的车前科中药药材或制剂的指纹图谱的构建方法，其特征在于，还包括以下特征中的至少一项：
所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40％～80％；
所述加热回流的温度为70℃～90℃，加热回流的时间为40min～150min；
所述超声提取的时间为20min～40min。
5.一种车前科中药药材或制剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
取待测车前科中药药材或待测车前科中药制剂，加提取溶剂进行提取处理，收集提取液，制备待测样品溶液，所述待测车前科中药药材为待测车前草中药药材或待测车前子中药药材，所述待测车前科中药制剂为待测车前草中药配方颗粒、待测车前子中药配方颗粒、待测车前草中药提取物或待测车前子中药提取物；
按照权利要求1～4任一项所述的色谱条件对所述待测样品溶液进行超高效液相色谱测定，将所得色谱图与权利要求1～4任一项所述的车前科中药药材或车前科中药制剂的指纹图谱对应，判断所述待测车前科中药药材或待测车前科中药制剂是否合格。
6.根据权利要求5所述的车前科中药药材或制剂的检测方法，其特征在于，还包括以下特征中的至少一项：
对所述待测车前科中药药材进行提取处理的方法为加热回流；
对所述待测车前科中药制剂进行提取处理的方法为超声提取；
每1g所述待测车前草中药药材对应加入30mL～70mL的所述提取溶剂；
每1g所述待测车前子中药药材对应加入20mL～30mL的所述提取溶剂；
每0.2g所述待测车前科中药制剂对应加入20mL～30mL的所述提取溶剂；
所述提取溶剂为甲醇水溶液。
7.根据权利要求5或6所述的车前科中药药材或制剂的检测方法，其特征在于，还包括以下特征中的至少一项：
所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40％～80％；
所述加热回流的温度为70℃～90℃，加热回流的时间为40min～150min；
所述超声提取的时间为20min～40min。
8.一种车前草中药制剂和车前子中药制剂的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
取待测车前科中药制剂，加提取溶剂进行提取处理，收集提取液，制备待测样品溶液；
按照权利要求1～4任一项所述的色谱条件对所述待测样品溶液进行超高效液相色谱测定，将所得色谱图与权利要求1～4任一项所述的车前科中药制剂的指纹图谱对应，确定所述待测车前科中药制剂的种类。
9.根据权利要求8所述的车前草中药制剂和车前子中药制剂的鉴别方法，其特征在于，还包括以下特征中的至少一项：
对所述待测车前科中药制剂进行提取处理的方法为超声提取；
每0.2g所述待测车前科中药制剂对应加入20mL～30mL的所述提取溶剂；
所述提取溶剂为甲醇水溶液。
10.根据权利要求8或9所述的车前草中药制剂和车前子中药制剂的鉴别方法，其特征在于，还包括以下特征中的至少一项：
所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为40％～80％；
所述超声提取的时间为20min～40min。
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| CN202211220802.4A CN115541756B (zh) | 2022-10-08 | 2022-10-08 | 车前科中药药材或制剂的指纹图谱的构建方法、检测方法和鉴别方法 |
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Cited By (1)
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| CN116893227A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-10-17 | 广东一方制药有限公司 | 车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱的构建方法、其鉴别方法 |
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| CN109444290A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-03-08 | 广东方制药有限公司 | 车前草药材uplc特征图谱的构建方法和检测方法 |
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2022
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116893227A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-10-17 | 广东一方制药有限公司 | 车前子、盐车前子和炒车前子的指纹图谱的构建方法、其鉴别方法 |
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