CN115420816A - 一种滋阴凉血的中药组合物的含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药质量检测领域，具体提供了一种滋阴凉血的中药组合物的含量测定方法，所述的含量测定方法选自如下A‑C中的至少一项：A、芍药苷的含量测定；B、黄芩苷的含量测定；C、盐酸小檗碱的含量测定；具体见说明书，三个含量测试方法均具有检测时间短、分离度高、专属性强、线性关系满足要求，以及精密度、准确度和稳定性高等的优势，不仅能够快速、简便的获知该产品的质量情况的，更可以有效的对产品的质量性能进行监控，适用于该中药组合物不同的制剂类型的质量控制。

Description

一种滋阴凉血的中药组合物的含量测定方法
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种滋阴凉血的中药组合物的含量测定方法。
背景技术
保阴煎是调经要方之一，是《景岳全书》中的一个方子，该方组成有生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草，主要用于阴虚血热而致血不循经之证。方中生地清热凉血，养阴生津；熟地黄、白芍养血敛阴；黄芩、黄柏清热凉血；山药、续断补脾肾，填精血，全方共奏凉血养血之功。临床应用以五心烦热、带下淋浊、经来量多、舌红脉数为辨证要点。
现行的法定标准《中国药典》（简称）未收录保阴煎，马文凤等高效液相与高分辨率的质谱联合使用实现了对保阴煎中没食子酸、芍药苷和红花黄色素等物质进行鉴别，但是一方面该方法对设备要求大，且操作复杂，需要配备专门的质谱设备操作人员，而若仅采用其公开的高效液相法又无法实现黄芩苷等众多对照品的有效分离，且峰形差，基线不稳定，无法实现保阴煎及其他制剂的含量测定。
因此，建立一种能够方便、准确地检测保阴煎对应的中药组合物及其制剂中有效成分的含量测定方法，对于其质量检测和质量控制具有重要意义。
发明内容
为此，本发明提出一种建立保阴煎对应的中药组合物及其制剂的含量测定方法，进而建立保阴煎对应的中药组合物及其制剂的质量检测方法。
具体的，本发明提供了一种中药组合物及其制剂的含量测定方法；所述中药组合物包括生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草，所述的含量测定方法选自如下A-C中的至少一项：
A、芍药苷的含量测定
(1)供试品溶液和芍药苷对照品溶液的制备；
(2)采用高效液相色谱法检测供试品溶液和芍药苷对照品溶液，填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和含磷酸的水溶液为流动相，按照如下程序进行梯度洗脱：0→35min→50min→65min，流动相中乙腈的体积百分数为13％→13％→60％→13％；
B、黄芩苷的含量测定
(1)供试品溶液和黄芩苷对照品溶液的制备；
(2)采用高效液相色谱法检测供试品溶液和黄芩苷对照品溶液，填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶，以体积比为45:55-50:50的甲醇和含磷酸的水溶液为流动相；
C、盐酸小檗碱的含量测定
(1)供试品溶液和盐酸小檗碱对照品溶液的制备
(2)采用高效液相色谱法检测供试品溶液和盐酸小檗碱对照品溶液，填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶，以体积比为40-50:50-60的乙腈与水相为流动相，水相为含十二烷基磺酸钠和磷酸的水溶液。
在芍药苷的含量测定、黄芩苷的含量测定以及盐酸小檗碱的含量测定中，步骤(1)包括：
1)取供试品，加溶剂提取，得到提取液；
2)将提取液固液分离，取液体，即为供试品溶液。
根据本发明任一项所述的构建方法，还满足如下A-D中的任意一项或者多项：
A、步骤1)中，溶剂选自甲醇、乙醇、甲醇水溶液或者乙醇水溶液；
B、步骤1)中供试品的质量与溶剂的体积之比为0.1-0.3:20-50；配比关系为g/mL；
C、步骤1)中，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为15min-1h；
D、步骤2)中，所述固液分离为离心或者过滤。
进一步地，A、芍药苷的含量测定中，步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为 220-240nm，流速为0.2-0.5ml/min，柱温25-40℃，进样量为2-20μl；和/或，所述含磷酸的水溶液中磷酸的体积百分浓度为0.05-0.2％；和/或，色谱柱选自Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm色谱柱、Diamonsil C18 5μm，250×1.6mm色谱柱或者Agela C18 5μm，250×1.6mm色谱柱。
进一步地，B、黄芩苷的含量测定中，步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为 270-290nm，流速为0.2-0.5ml/min，柱温25-40℃，进样量为2-20μl；和/或，所述含磷酸的水溶液中磷酸的体积百分浓度为0.05-0.2％；和/或，色谱柱选自Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm色谱柱、Diamonsil C18 5μm，250×1.6mm色谱柱或者Agela C18 5μm，250×1.6mm色谱柱。
进一步地，C、盐酸小檗碱的含量测定中，步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为260-270nm，流速为0.2-0.5ml/min，柱温25-40℃，进样量为2-20μl；和/或，所述水相中磷酸的体积百分浓度为0.05-0.3％；和/或，所述水相中十二烷基磺酸钠的质量体积百分浓度为0.05-0.2％；和/或，色谱柱选自Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm色谱柱、Diamonsil C18 5μm，250×1.6mm色谱柱或者Agela C18 5μm，250×1.6mm色谱柱。
进一步地，C、盐酸小檗碱的含量测定中，柱温为25-30℃，和/或，C、盐酸小檗碱的含量测定中，流动相采用体积比为45:55的乙腈与含0.05-0.2％十二烷基磺酸钠和0.05-0.3％的磷酸的水溶液；和/或， B、黄芩苷的含量测定中，柱温为25-30℃，和/或，B、黄芩苷的含量测定中，供试品溶液的提取溶剂选自30％-80％的乙醇水溶液；和/或，A、芍药苷的含量测定中，供试品溶液的提取溶剂选自30％-80％的乙醇水溶液；和/或，A、芍药苷的含量测定中，色谱柱为Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm色谱柱。
进一步地，在芍药苷的含量测定、黄芩苷的含量测定以及盐酸小檗碱的含量测定中步骤(1)包括：取供试品0.1-0.3g，加入30％-80％的乙醇水溶液10-40mL，超声处理15min-1h，加入30％-80％的乙醇水溶液定容至25-50mL，滤过，取续滤液，即得。
进一步地，芍药苷对照品溶液的制备包括，取芍药苷对照品，加溶剂制成每1ml含芍药苷8-120μg 的溶液。
进一步地，黄芩苷对照品溶液的制备包括，取黄芩苷对照品，加溶剂制成每1ml含黄芩苷10-140μg 的溶液。
进一步地，盐酸小檗碱对照品溶液的制备包括，取盐酸小檗碱对照品，加溶剂制成每1ml含盐酸小檗碱5-80μg的溶液。
其中，所述溶剂可以为甲醇，也可以为体积百分数不小于30％的甲醇水溶液或者乙醇水溶液，也可以是流动相。
所述中药组合物及其制剂选自中药组合物和中药组合物的制剂中的至少一种。
例如，所述中药组合物可以通过如下方法制成，按照选定的重量份数称取生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草，混合后按常规提取方法提取或者分别按常规提取方法提取后混合，即得。所述常规提取方法包括煎煮提取、浸渍提取、渗漉提取、回流提取、超声提取和水蒸气蒸馏提取中的一种或几种；提取溶剂选自水或体积百分数为5-98％的醇溶液；提取次数至少为1次；提取时间至少为10min；提取溶剂的体积与原料药重量的比值≥2L/kg。
其中，中药组合物的制剂是由中药组合物提取后得到的提取液(例如煎煮后得到的汤剂)按照药学上常规工艺，加入或者不加药学上常规辅料制成的中药制剂。优选地，所述中药组合物的制剂可以但不局限于干粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、软膏剂、溶液剂等。
更优选地，本发明提供的中药组合物及其制剂含量测定方法可以同时适用于中药组合物、中药组合物的标准汤剂冻干粉和中药组合物的颗粒剂，即所述中药组合物及其制剂选自中药组合物、中药组合物的标准汤剂冻干粉(也称保阴煎物质基准样品粉末)和中药组合物的颗粒剂中的至少一种。
作为优选的实施方式，所述中药组合物包括生地黄6-9重量份、熟地黄6-9重量份、芍药6-9重量份、山药4-7重量份、川续断4-7重量份、黄芩4-7重量份、黄柏4-7重量份和生甘草3-4重量份。
作为更优选的实施方式，所述中药组合物包括生地黄7.5重量份、熟地黄7.5重量份、芍药7.5重量份、山药5.6重量份、川续断5.6重量份、黄芩5.6重量份、黄柏5.6重量份和生甘草3.7重量份。
本发明还提供了一种中药组合物及其制剂的质量检测方法，包括按照上述任一所述的含量测定方法测定待测样品中芍药苷和/或黄芩苷和/或盐酸小檗碱的含量的步骤；所述中药组合物包括生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的中药组合物及其制剂的含量测定方法，包括芍药苷、黄芩苷和盐酸小檗碱中的至少一项，对于芍药苷来说，本发明以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈和含磷酸的水溶液为流动相，梯度洗脱，经大量实验筛选得到特定的洗脱程序，实现了芍药苷的完全分离，对于黄芩苷和盐酸小檗碱，分别选用以体积比为45:55-50:50的甲醇和磷酸为流动相以及体积比为40-50:50-60的乙腈与水相为流动相，水相为含十二烷基磺酸钠和磷酸的水溶液，也实现了两种有效成分的完全分离，三个含量测试方法均具有检测时间短、分离度高、专属性强、线性关系满足要求，以及精密度、准确度和稳定性高等的优势，不仅能够快速、简便的获知该产品的质量情况，更可以有效的对产品的质量性能进行监控，适用于该中药组合物不同的制剂类型的质量控制。
2.本发明提供的中药组合物及其制剂的的质量检测方法，包括含量测定方法，该方法可以从快速、准确检测中药组合物和制剂中有效成分的含量，且方法操作简单，精密度高、稳定性好、重复性好、准确度高，保证特征成分质量的稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实验例1采用不同体积比的流动相测定的色谱图；图2为实验例1采用不同柱温测定的色谱图；图3为实验例1采用不同浓度的磷酸测定的色谱图；图4为实验例1采用不同色谱柱测定的色谱图图5为实验例1中不同提取溶剂测定的色谱图；图6为实验例1中采用不同提取时间测定的色谱图；图 7为实验例1中空白溶剂的色谱图；图8为实验例1中黄芩苷对照品的色谱图；图9为实验例1中供试品的色谱图；图10为实验例1中阴性对照品的色谱图；图11为实验例1中黄芩苷对照品的标准曲线；图12为实验例2中不同的梯度洗脱程序测定的色谱图；图13为实验例2采用不同柱温测定的色谱图；图14为实验例2中采用不同浓度的磷酸测定的色谱图；图15为为实验例2采用不同色谱柱测定的色谱图；图16为实验例2中空白溶剂的色谱图；图17为实验例2中阴性对照品的色谱图；图18为实验例2 中芍药苷对照品的色谱图；图19为实验例2中供试品的色谱图；图20为实验例2中芍药苷对照品的标准曲线；图21为实验例3采用不同体积比的流动相测定的色谱图；图22为实验例3采用不同柱温测定的色谱图；图23为实验例3采用不同组成的流动相测定的色谱图；图24为实验例3采用不同色谱柱测定的色谱图；图25为实验例3中空白溶剂的色谱图；图26为实验例3中盐酸小檗碱对照品的色谱图；图27为实验例3中供试品的色谱图；图28为实验例3中阴性对照品的色谱图；图29为实验例3中盐酸小檗碱对照品的标准曲线。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。本发明中，磷酸溶液的百分数(％)是指体积百分浓度，甲醇、乙醇和乙腈的百分数(％)是指体积百分浓度，十二烷基磺酸钠的百分数(％)为质量体积百分浓度。
实验例1黄芩苷的含量测定方法
1、仪器与试药：
(1)仪器：LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)，SPD-20A紫外检测器，LC-2010高效液相色谱仪(日本岛津公司)，CBM-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，SPD-10AVP紫外检测器，BT.125D 型电子分析天平购于德国赛多利斯公司，DZF-6050型真空干燥箱购于上海一恒科技有限公司，DHP-420 型电热恒温培养箱购于北京市永光明医疗仪器有限公司，KQ-250型超声波清洗机购于昆山市超声仪器有限公司。
(2)试药：黄芩苷对照品(批号：110739-201115)购于中国药品生物制品检定所，规格为供含量测定用。甲醇、乙腈(色谱级，FisherCo.Ltd)；水：娃哈哈饮用纯净水；甲醇、乙醇、磷酸：分析纯，北京化工厂。
保阴煎物质基准样品，处方：生地黄7.5g、熟地黄7.5g、芍药7.5g、山药5.6g、川续断5.6g、黄芩 5.6g、黄柏5.6g、生甘草3.7g；制法：以上八味，加水600ml，煎煮至约400ml，滤过，冷冻干燥，粉碎，即得。
稀乙醇：药典术语，即取乙醇529ml，加水稀释至1000ml，即得。
2、中药组合物及其制剂含量测定方法
对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含66.3μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取保阴煎物质基准样品粉末约0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，加入稀乙醇 35ml，超声处理(功率240W，频率40kHz)30分钟，使完全分散，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
高效液相色谱法测试：取对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱法测试，以十八烷基键合硅胶为填充剂(色谱柱Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm)；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，流动相A与B的体积比为45：55，检测波长为280nm，流速为每分钟1ml；柱温为30℃；进样量10μl。
3、色谱条件的选择
3.1流动相的选择
取保阴煎物质基准样品粉末约0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，加入稀乙醇35ml，超声处理(功率 240W，频率40kHz 30分钟，使完全分散，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。经多次试验选择以甲醇和0.1％磷酸水溶液作为流动相，初步设计下表三个流动相的洗脱程序，分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，在表1所示的流动相下检测，其余均与本实验例第2项的色谱条件相同，记录色谱图，结果见图1。
表1不同流动相比例考察黄芩苷实验结果
Figure BDA0003761557360000061
结果表明：甲醇-0.1％磷酸溶液(45：55)和(50:50)三组样品分离度均大于1.5，分离效果较好，其中，甲醇-0.1％磷酸溶液(45：55)出峰时间更短，检测时间短，效果最佳。
3.2柱温的选择
分别精密吸取3.1项下的供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，选择不同的柱温记录色谱图，①柱温 1：室温25℃；②柱温2：30℃；③柱温3：40℃，其余均与本实验例第2项的色谱条件相同，结果如图 2所示。
由记录的色谱图可知：柱温箱对黄芩苷峰均无显著性影响，均分离效果较好，峰的个数较稳定，为与其他对照品保持一致，故定为室温25-30℃色谱柱柱温。
3.3磷酸浓度的考察
分别精密吸取3.1项下的供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，选择不同浓度的磷酸为流动相B记录色谱图，①0.05％磷酸；②0.1％磷酸；③0.2％磷酸；其余均与本实验例第2项的色谱条件相同，结果如图3所示。
由记录的色谱图可知，采用含0.05％-0.2％的磷酸水溶液为流动相B对黄芩苷的分离效果均较好，所得图谱的峰面积的响应值较高，峰的个数较稳定。
3.4色谱柱的考察
分别精密吸取3.1项下的供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，选择不同的色谱柱记录色谱图，①色谱柱1：Diamonsil C18 5μm，250×1.6mm；②色谱柱2：Agela C18 5μm，250×1.6mm；③色谱柱3： Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm；其余均与本实验例第2项的色谱条件相同，结果如图4所示。
由记录的色谱图可知：三种色谱柱下，黄芩苷的分离效果均较好，尤其是Agilene色谱柱。
4、供试品溶液的制备
(1)提取溶剂的考察
取保阴煎物质基准样品粉末约0.2g，精密称定，分别置50ml量瓶中，各加入稀乙醇、70％乙醇、甲醇35ml，超声处理(功率240W，频率40kHz)30分钟，使完全分散，放冷，各加稀乙醇、70％乙醇、甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按照本实验例第2 项的色谱条件测定。实验结果见表2和图5。
表2不同提取溶剂实验结果
Figure BDA0003761557360000071
结果表明，稀乙醇超声和70％乙醇超声两种溶剂提取黄芩苷值较接近，故优选稀乙醇或者70％乙醇为提取溶剂。
(2)提取时间的考察
为将黄芩苷提取完全，同时避免能源浪费，对其提取时间进行考察，取保阴煎物质基准样品粉末约 0.2g，分别置具塞锥形瓶中，各精密加入稀乙醇称定重量，分别超声处理(功率240W，频率40kHz)20、 30、40、60分钟，使完全分散，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按照本实验例第2项的色谱条件测定。实验结果见表3和图6。
表3不同提取时间的实验结果
Figure BDA0003761557360000072
结果表明，不同的超声提取时间对黄芩苷含量无显著影响，主要峰面积差异不大。
5、方法学验证
(1)专属性
选择稀乙醇为空白溶剂。
黄芩阴性对照溶液的制备：黄芩阴性对照品的处方：生地黄7.5g、熟地黄7.5g、芍药7.5g、山药5.6g、川续断5.6g、黄柏5.6g、生甘草3.7g；制法：以上七味，加水600ml，煎煮至约400ml，滤过，冷冻干燥，粉碎，即得。取黄芩阴性对照品按照本实验例第2项“供试品溶液的制备”方法同法制成黄芩阴性对照溶液。
精密吸取空白溶剂和黄芩阴性对照溶液以及按照本实验例第2项下方法制得的黄芩苷对照品溶液和供试品溶液各10μl，按照本实验例第2项下色谱条件检测，注入高效液相色谱仪，测定并记录色谱图。
结果表明，测得黄芩苷对照品及供试品的色谱图，由仪器给出的理论塔板数计算，其理论板数按黄芩苷计算>2000。该色谱条件下，样品可得到很好的分离，黄芩阴性对照溶液在黄芩苷的相应位置上无干扰峰出现，供试品溶液与对照品溶液主峰的保留时间一致。黄芩苷对照品及空白溶剂、供试品和黄芩阴性样品的色谱图测得见图7-10。
(2)标准曲线的制备
精密吸取已知浓度的黄芩苷对照品溶液(黄芩苷0.6mg/ml)，分别加入甲醇稀释成不同浓度的对照品溶液，分别吸取10μl注入高效液相色谱仪中，按照本实验例第2项下色谱条件测定。以各自的进样量 (μg)为横坐标、峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表4、图11。
表4黄芩苷的标准曲线表
Figure BDA0003761557360000081
计算得回归方程：Y＝36695x-124336，R＝0.9998。由此确定黄芩苷的线性范围在12～132μg。
(3)准确度试验
采用加样回收测定法，取同一已知含量的保阴煎物质基准样品，加入相应量的对照品，制备加样回收率样品溶液，并按照本实验例第2项方法进行测定，结果见表5。
Figure BDA0003761557360000082
加样回收率样品溶液制备方法如下：取已知含量的保阴煎物质基准样品(黄芩苷含量为24.956mg/g) 粉末0.2g，6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入已知含量黄芩苷对照品溶液(5.0mg/ml)1.0ml，再精密加入稀乙醇49ml，称定重量，超声处理(功率240W，频率40kHz)30分钟，使完全分散，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
表5黄芩苷准确度测定结果表
Figure BDA0003761557360000083
Figure BDA0003761557360000091
结果表明：黄芩苷回收率为99.373％，RSD为1.241％。以上表明本法准确度较好，方法可行。
(4)重复性
取同一批保阴煎物质基准样品6份，按照本实验例第2项下方法平行制备供试品溶液6份，分别测定，结果显示RSD均小于3.0％，表明该方法重复性良好，见表6。
表6重复性试验结果表
Figure BDA0003761557360000092
根据上述测定结果可知，该方法重复性良好。
(5)中间精密度
取同一浓度黄芩苷对照品溶液由不同操作人员、采用不同色谱系统按照本实验例第2项方法测定，结果表明RSD小于2％，黄芩苷中间精密度良好。见表7。
表7中间精密度试验结果表
Figure BDA0003761557360000093
(6)稳定性试验
取同一本实验例第2项方法制得的供试品溶液，常温放置，5小时内每隔一定时间，按照本实验例第2项方法测定一次，进样量：10μl，记录其峰面积积分值，结果表明供试品溶液在5小时内基本稳定。见表8。
表8溶液稳定性试验结果表
Figure BDA0003761557360000101
(7)仪器精密度试验
取同一浓度黄芩苷对照品溶液连续6次按照本实验例第2项方法进样测定，进样量：10μl，变异系数表明仪器进样精密度良好。见表9。
表9精密度试验结果表
Figure BDA0003761557360000102
实验例2芍药苷的含量测定方法
1、仪器与试药：
(1)仪器：同实验例1。
(2)试药：芍药苷对照品(批号：110736-201842)、购于中国药品生物制品检定所，规格为供含量测定用。甲醇、乙腈(色谱级，FisherCo.Ltd)；水：娃哈哈饮用纯净水；甲醇、乙醇、磷酸：分析纯，北京化工厂。
保阴煎物质基准样品，处方：生地黄7.5g、熟地黄7.5g、芍药7.5g、山药5.6g、川续断5.6g、黄芩 5.6g、黄柏5.6g、生甘草3.7g；制法：以上八味，加水600ml，煎煮至约400ml，滤过，冷冻干燥，粉碎，即得。
稀乙醇：药典术语，即取乙醇529ml，加水稀释至1000ml，即得。
2、中药组合物及其制剂含量测定方法
对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取保阴煎物质基准样品粉末约0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，加入稀乙醇 35ml，超声处理(功率240W，频率40kHz)30分钟，使完全分散，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
高效液相色谱法测试：取对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱法测试，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为230nm，流速为每分钟1ml；柱温为30℃；进样量10μl。
表10梯度洗脱程序表
Figure BDA0003761557360000111
3、色谱条件的选择
3.1梯度程序的选择
取保阴煎物质基准样品粉末约0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，加入稀乙醇35ml，超声处理(功率 240W，频率40kHz 30分钟，使完全分散，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。经多次试验选择以乙腈-0.1％磷酸溶液作为梯度洗脱流动相，初步设计三个流动相的梯度洗脱程序(表11、 12、13)，进行优选，分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图12。
表11梯度洗脱程序1(流动相1)
Figure BDA0003761557360000112
表12梯度洗脱程序2(流动相2)
Figure BDA0003761557360000113
Figure BDA0003761557360000121
表13梯度洗脱程序3(流动相3)
Figure BDA0003761557360000122
由记录的色谱图可知：流动相3分离效果较好，故确定釆用流动相3。
3.2柱温的选择
分别精密吸取本实验例3.1项下的供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，选择不同的柱温记录色谱图，①柱温1：室温25℃；②柱温2：30℃；③柱温3：40℃。其余均与本实验例第2项的色谱条件相同，结果如图13所示。
由记录的色谱图可知：柱温箱温度25-40℃均可以显示芍药苷峰，尤其是25-30℃，芍药苷分离效果较好，所得图谱的峰面积的响应值较高。
3.3磷酸浓度的考察
分别精密吸取本实验例3.1项下的供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，选择流动相不同浓度的磷酸记录色谱图，①0.05％磷酸(pH值0.05)；②0.1％磷酸(pH值0.1)；③0.2％磷酸(pH值0.2)；其余均与本实验例第2项的色谱条件相同，结果如图14所示。
由记录的色谱图可知，磷酸浓度对芍药苷峰没有太大影响，采用含0.05％-0.2％的磷酸水溶液为流动相对芍药苷的分离效果均较好。
3.4色谱柱的考察
分别精密吸取本实验例3.1项下的供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，选择不同的色谱柱记录色谱图，①色谱柱1：Diamonsil C18 5μm，250×1.6mm；②色谱柱2：Agela C18 5μm，250×1.6mm；③色谱柱3：Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm；其余均与本实验例第2项的色谱条件相同，结果如图15 所示。
由记录的色谱图可知：三个色谱柱均可分离芍药苷，展示出芍药苷峰，分离效果均较好。
4、供试品溶液的制备
(1)提取溶剂的考察
取物质基准样品粉末约0.2g，精密称定，分别置50ml量瓶中，各加入稀乙醇、70％乙醇、甲醇35ml，超声处理(功率240W，频率40kHz)30分钟，使完全分散，放冷，各加稀乙醇、70％乙醇、甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按照本实验例第2项的色谱条件测定。实验结果见表14。
表14不同提取溶剂实验结果
Figure BDA0003761557360000131
结果表明稀乙醇、70％乙醇提取芍药苷值较接近，故选择稀乙醇和70％乙醇为提取溶剂。
(2)提取时间的考察
为将芍药苷提取完全，同时避免能源浪费，对其提取时间进行考察，取物质基准样品粉末约0.2g，四份，精密称定，分别置50ml量瓶中，各加入稀乙醇35ml，分别超声处理(功率240W，频率40kHz)20、 30、40、60分钟，使完全分散，放冷，各加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按照本实验例第2项的色谱条件测定。实验结果见表15。
表15不同提取时间的实验结果
Figure BDA0003761557360000132
结果表明，不同的超声提取时间对芍药苷含量无显著影响，主要峰面积差异不大。
5、方法学验证
(1)专属性
选择稀乙醇为空白溶剂。
白芍阴性对照溶液的制备：白芍阴性对照品的处方：生地黄7.5g、熟地黄7.5g、山药5.6g、川续断 5.6g、黄芩5.6g、黄柏5.6g、生甘草3.7g；制法：以上七味，加水600ml，煎煮至约400ml，滤过，冷冻干燥，粉碎，即得，取白芍阴性对照品按照本实验例第2项“供试品溶液的制备”方法同法制成白芍阴性对照溶液。
精密吸取空白溶剂和白芍阴性对照溶液以及按照本实验例第2项下制得的芍药苷对照品溶液和供试品溶液各10μl，按照本实验例第2项下色谱条件检测，注入高效液相色谱仪，测定并记录色谱图。
结果表明，测得芍药苷对照品及供试品的色谱图，由仪器给出的理论塔板数计算，其理论板数按芍药苷计算>2000。该色谱条件下，样品可得到很好的分离，白芍阴性对照溶液在芍药苷的相应位置上无干扰峰出现，供试品溶液与对照品溶液主峰的保留时间一致。芍药苷对照品、空白溶剂、供试品和白芍阴性样品的色谱图测得见图16-19。
(2)标准曲线的制备
精密吸取已知浓度的芍药苷对照品溶液(芍药苷0.46mg/ml)，分别加入甲醇稀释成不同浓度的对照品溶液，分别吸取10μl注入高效液相色谱仪中，按照本实验例第2项下色谱条件测定。以各自的进样量(μg)为横坐标、峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表16、图20。
表16芍药苷的标准曲线表
Figure BDA0003761557360000141
计算得回归方程：Y＝12204x-38438，R＝0.9998。由此确定芍药苷的线性范围在9.2～101.2μg。
(3)准确度实验
采用加样回收测定法，取同一已知含量的保阴煎物质基准样品，加入相应量的对照品，制备加样回收率样品溶液，并按照本实验例第2项方法进行测定，结果见表17。
Figure BDA0003761557360000142
加样回收率样品溶液制备方法如下：取已知含量的保阴煎物质基准样品(芍药苷含量为9.574mg/g) 粉末0.2g，6份，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入已知含量芍药苷对照品溶液(1.907mg/ml)1.0ml，再精密加入稀乙醇35ml，超声处理(功率240W，频率40kHz)30分钟，使完全分散，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
表17芍药苷准确度测定结果表
Figure BDA0003761557360000143
结果表明：芍药苷回收率为99.598％，RSD0.523％。以上表明本法准确度较好，方法可行。
(4)重复性试验
取同一批保阴煎物质基准样品6份，按照本实验例第2项下方法平行制备供试品溶液6份，分别测定，结果显示RSD均小于3.0％，表明该方法重复性良好，见表18。
表18重复性试验结果表
Figure BDA0003761557360000151
根据上述测定结果可知，该方法重复性良好。
(5)中间精密度试验
取同一浓度芍药苷对照品溶液由不同操作人员、采用不同色谱系统测定，结果表明RSD小于2％，芍药苷中间精密度良好。见表19。
表19中间精密度试验结果表
Figure BDA0003761557360000152
(6)稳定性试验
取同一本实验例第2项方法制得的供试品溶液，常温放置，10小时内每隔一定时间，按上述色谱条件测定一次，进样量：10μl，记录其峰面积积分值，结果表明供试品溶液在10小时内基本稳定。见表 20。
表20溶液稳定性试验结果表
Figure BDA0003761557360000153
(7)仪器精密度试验取同一浓度芍药苷对照品溶液连续6次进样测定，进样量：10μl，变异系数表明仪器进样精密度良好。见表21。
表21精密度试验结果表
Figure BDA0003761557360000154
Figure BDA0003761557360000161
实验例3盐酸小檗碱的含量测定方法
1、仪器与试药：
(1)仪器：同实验例1。
(2)试药：盐酸小檗碱对照品(批号：110713-201814)购于中国药品生物制品检定所，规格为供含量测定用。甲醇、乙腈(色谱级，Fisher Co.Ltd)；水：娃哈哈饮用纯净水；甲醇、乙醇：分析纯，北京化工厂。
保阴煎物质基准样品，处方：生地黄7.5g、熟地黄7.5g、芍药7.5g、山药5.6g、川续断5.6g、黄芩 5.6g、黄柏5.6g、生甘草3.7g；制法：以上八味，加水600ml，煎煮至约400ml，滤过，冷冻干燥，粉碎，即得。
2、中药组合物及其制剂含量测定方法
对照品溶液的制备：取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含32μg的溶液，即得，以体积比为45：55的乙腈和含0.1％磷酸水溶液(每100ml含0.1％磷酸水溶液中加0.1g十二烷基磺酸钠)为流动相。
供试品溶液的制备：取保阴煎物质基准样品粉末约0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，加入稀乙醇 35ml，超声处理(功率240W，频率40kHz)30分钟，使完全分散，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
高效液相色谱法测试：取对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱法测试，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Agilene 5TC-C18 5μml，250×1.6mm)；以体积比为45：55的乙腈和含0.1％磷酸水溶液(每100ml含0.1％磷酸水溶液中加0.1g十二烷基磺酸钠)为流动相；检测波长为265nm，流速为每分钟1ml；柱温为30℃；进样量10μl。
3、色谱条件的选择
3.1流动相的选择
取物质基准样品粉末约0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，加入稀乙醇35ml，超声处理(功率240W，频率40kHz 30分钟，使完全分散，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。经多次试验选择以乙腈-水相(含0.1％磷酸的水溶液，每100ml含0.1％磷酸的水溶液中加0.1g十二烷基磺酸钠) 为流动相，初步设计三个流动相的洗脱程序进行优选，分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，其余均与本实验例第2项的色谱条件相同，记录色谱图，结果见图21。
表22不同流动相比例考察盐酸小檗碱实验结果
Figure BDA0003761557360000171
结果表明：三种流动相下盐酸小檗碱的分离度均大于1.5，其中，体积比为45:55综合效果最佳，分离效果好，且保留时间短。
3.2柱温的选择
分别精密吸取本实验例3.1项下的供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，选择不同的柱温记录色谱图，①柱温1：室温25℃；②柱温2：30℃；③柱温3：40℃。其余均与本实验例第2项的色谱条件相同，结果如图22所示。
由记录的色谱图可知：柱温箱温度25-30℃，分离效果较好，所得图谱的峰面积的响应值较高、分离效果较好，峰的个数较稳定，故定为色谱柱柱温。
3.3流动相不同
分别精密吸取本实验例3.1项下的供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，选择流动相不同浓度的磷酸记录色谱图；①流动相1：乙腈-水(45:55)；②流动相2：乙腈-0.1％磷酸(45:55)；③流动相3：乙腈-0.1％磷酸溶液(每100ml加十二烷基磺酸钠0.1g)(45:55)；其余均与本实验例第2项的色谱条件相同，结果如图23所示。
由记录的色谱图可知：乙腈-0.1％磷酸溶液(每100ml加十二烷基磺酸钠0.1g)(45:55)展示出盐酸小檗碱峰，且分离效果较好，所得图谱的峰面积的响应值较高。
3.4色谱柱的选择
分别精密吸取本实验例3.1项下的供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，选择不同的色谱柱记录色谱图，①色谱柱1：Diamonsil C18 5μm，250×1.6mm；②色谱柱2：Agela C18 5μm，250×1.6mm；③色谱柱3：Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm；其余均与本实验例第2项的色谱条件相同，结果如图24 所示。
由记录的色谱图可知：Diamonsil、Agela与Agilene色谱柱盐酸小檗碱峰的分离效果均较好，所得图谱的峰面积的响应值较高、峰的个数较稳定，为与芍药苷和黄芩苷保持一致，优选Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm色谱柱。
4、供试品溶液的制备
(1)提取溶剂的考察
取物质基准样品粉末约0.2g，精密称定，分别置50ml量瓶中，各加入稀乙醇、70％乙醇、甲醇35ml，超声处理(功率240W，频率40kHz)30分钟，使完全分散，放冷，各加稀乙醇、70％乙醇、甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按照本实验例第2项的色谱条件测定。实验结果见表23。
表23不同提取溶剂实验结果
Figure BDA0003761557360000181
结果表明三种溶剂提取盐酸小檗碱值较接近，三种溶剂均可作为提取溶剂。
(2)提取时间的考察
为将盐酸小檗碱提取完全，同时避免能源浪费，对其提取时间进行考察，取供试品粉末约0.2g，分别置具塞锥形瓶中，各精密加入稀乙醇称定重量，分别超声处理(功率200W，频率40kHz)20、30、40、 60分钟，使完全分散，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按照本实验例第2项的色谱条件测定。实验结果见表24。
表24不同提取时间的实验结果
Figure BDA0003761557360000182
Figure BDA0003761557360000191
结果表明，不同的超声提取时间对盐酸小檗碱含量无显著影响，主要峰面积差异不大，故选择30 分钟超声提取。
5、方法学验证
(1)专属性
选择稀乙醇为空白溶剂。
黄柏阴性对照溶液的制备：黄柏阴性对照品的处方：生地黄7.5g、熟地黄7.5g、山药5.6g、川续断 5.6g、黄芩5.6g、黄柏5.6g、生甘草3.7g；制法：以上七味，加水600ml，煎煮至约400ml，滤过，冷冻干燥，粉碎，即得，取黄柏阴性对照品按照本实验例第2项“供试品溶液的制备”方法同法制成黄柏阴性对照溶液。
精密吸取空白溶剂和黄柏阴性对照溶液以及按照本实验例第2项下制得的盐酸小檗碱对照品溶液和供试品溶液各10μl，按照本实验例第2项下色谱条件检测，注入高效液相色谱仪，测定并记录色谱图。
结果表明，测得盐酸小檗碱对照品及供试品的色谱图，由仪器给出的理论塔板数计算，其理论板数按盐酸小檗碱计算>4000。该色谱条件下，样品可得到很好的分离，黄柏阴性对照溶液在盐酸小檗碱的相应位置上无干扰峰出现，供试品溶液与对照品溶液主峰的保留时间一致。盐酸小檗碱对照品、空白溶剂、供试品和阴性样品的色谱图测得见图25-28。
(2)标准曲线的制备
精密吸取已知浓度的盐酸小檗碱对照品溶液(盐酸小檗碱0.6mg/ml)，分别加入流动相稀释成不同浓度的对照品溶液，分别吸取10μl注入高效液相色谱仪中，按照本实验例第2项下色谱条件测定。以各自的进样量(μg)为横坐标、峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表25、图29。
表25盐酸小檗碱的标准曲线表
Figure BDA0003761557360000192
计算得回归方程：Y＝38015x-35858，R＝0.9999。由此确定盐酸小檗碱的线性范围在6.88～75.68μg。
(3)准确度实验
采用加样回收测定法，取同一已知含量的保阴煎物质基准样品，加入相应量的对照品，制备加样回收率样品溶液，并按照本实验例第2项方法进行测定，结果见表17。
Figure BDA0003761557360000201
加样回收率样品溶液制备方法如下：取已知含量的样品(盐酸小檗碱含量为7.101mg/g)粉末0.2g， 6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入已知含量盐酸小檗碱对照品溶液(1.496mg/ml)1.0ml，再精密加入稀乙醇49ml，称定重量，超声处理(功率240W，频率40kHz)30分钟，使完全分散，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
表26盐酸小檗碱准确度测定结果表
Figure BDA0003761557360000202
结果表明：盐酸小檗碱回收率为100.58％，RSD为0.648％。以上表明本法准确度较好，方法可行。
(4)重复性试验
取同一批保阴煎物质基准样品6份，按照本实验例第2项下方法平行制备供试品溶液6份，分别测定，结果显示RSD均小于3.0％，表明该方法重复性良好，见表27。
表27重复性试验结果表
Figure BDA0003761557360000203
根据上述测定结果可知，该方法重复性良好。
(5)中间精密度试验
取同一浓度盐酸小檗碱对照品溶液由不同操作人员、采用不同色谱系统，按照本实验例第2项测定，结果表明RSD小于2％，盐酸小檗碱中间精密度良好。见表28。
表28中间精密度试验结果表
Figure BDA0003761557360000204
Figure BDA0003761557360000211
(6)稳定性试验
取同一本实验例第2项方法制得的供试品溶液，常温放置，13小时内每隔一定时间，按照本实验例第2项下方法测定一次，进样量：10μl，记录其峰面积积分值，结果表明供试品溶液在13小时内基本稳定。见表29。
表29溶液稳定性试验结果表
Figure BDA0003761557360000212
(7)仪器精密度试验取同一浓度盐酸小檗碱对照品溶液连续6次按照本实验例第2项方法进样测定，进样量：10μl，变异系数表明仪器进样精密度良好。见表30。
表30精密度试验结果表
Figure BDA0003761557360000213
实施例1-15
实施例1-15分别采用15批次保阴煎物质基准样品，各批次样品按照如下方法制备供试品溶液和对照品溶液。分别按照实验例1第2项的高效液相色谱法测试测定黄芩苷含量，实验例2第2项的高效液相色谱法测试测定芍药苷含量，实验例3第2项的高效液相色谱法测试测定盐酸小檗碱的含量，
供试品溶液的制备：取保阴煎物质基准样品粉末约0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，加入稀乙醇35ml，超声处理(功率240W，频率40kHz)30分钟，使完全分散，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含66.3μg的溶液，即得黄芩苷对照品溶液，取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得芍药苷对照品溶液。取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含32μg的溶液，即得盐酸小檗碱对照品溶液，以体积比为45：55的乙腈和含0.1％磷酸水溶液(每100ml含0.1％磷酸水溶液中加0.1g十二烷基磺酸钠)为流动相。
结果如下表所示。
表31 15批物质基准样品中芍药苷、黄芩苷、盐酸小檗碱含量
Figure BDA0003761557360000221
上述15批次保阴煎物质基准样品含芍药苷(C23H28O11)大于5.42％，含黄芩苷(C21H18O11)大于 1.424％，含小檗碱以盐酸小檗碱(C20H17NO4·HCI)计，大于5.0％，品质优良。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种中药组合物及其制剂的含量测定方法，其特征在于：所述中药组合物包括生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草，所述的含量测定方法选自如下A-C中的至少一项：
A、芍药苷的含量测定
(1)供试品溶液和芍药苷对照品溶液的制备；
(2)采用高效液相色谱法检测供试品溶液和芍药苷对照品溶液，填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和含磷酸的水溶液为流动相，按照如下程序进行梯度洗脱：0→35min→50min→65min，流动相中乙腈的体积百分数为13％→13％→60％→13％；
B、黄芩苷的含量测定
(1)供试品溶液和黄芩苷对照品溶液的制备；
(2)采用高效液相色谱法检测供试品溶液和黄芩苷对照品溶液，填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶，以体积比为45:55-50:50的甲醇和含磷酸的水溶液为流动相；
C、盐酸小檗碱的含量测定
(1)供试品溶液和盐酸小檗碱对照品溶液的制备
(2)采用高效液相色谱法检测供试品溶液和盐酸小檗碱对照品溶液，填充剂采用十八烷基硅烷键合硅胶，以体积比为40-50:50-60的乙腈与水相为流动相，水相为含十二烷基磺酸钠和磷酸的水溶液。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，在芍药苷的含量测定、黄芩苷的含量测定以及盐酸小檗碱的含量测定中，步骤(1)包括：
1)取供试品，加溶剂提取，得到提取液；
2)将提取液固液分离，取液体，即为供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的含量测定方法，其特征在在于，步骤(1)还满足如下A-D中的任意一项或者多项：
A、步骤1)中，溶剂选自甲醇、乙醇、甲醇水溶液或者乙醇水溶液；
B、步骤1)供试品的质量与溶剂的体积之比为0.1-0.3:20-50；
C、步骤1)中，提取方式为回流提取或者超声提取，提取时间为15min-1h；
D、步骤2)中，所述固液分离为离心或者过滤。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的含量测定方法，其特征在于，A、芍药苷的含量测定中，步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为220-240nm，流速为0.8-1.2ml/min，柱温25-40℃，进样量为2-20μl；和/或，所述含磷酸的水溶液中磷酸的体积百分浓度为0.05-0.2％；和/或，色谱柱选自Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm色谱柱、Diamonsil C185μm，250×1.6mm色谱柱或者Agela C18 5μm，250×1.6mm色谱柱。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的含量测定方法，其特征在于，B、黄芩苷的含量测定中，步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为270-290nm，流速为0.8-1.2ml/min，柱温25-40℃，进样量为2-20μl；和/或，所述含磷酸的水溶液中磷酸的体积百分浓度为0.05-0.2％；和/或，色谱柱选自Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm色谱柱、Diamonsil C185μm，250×1.6mm色谱柱或者Agela C18 5μm，250×1.6mm色谱柱。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的含量测定方法，其特征在于，C、盐酸小檗碱的含量测定中，步骤(2)高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为260-270nm，流速为0.8-1.2ml/min，柱温25-40℃，进样量为2-20μl；和/或，所述水相中磷酸的体积百分浓度为0.05-0.3％；和/或，所述水相中十二烷基磺酸钠的质量体积百分浓度为0.05-0.2％；和/或，色谱柱选自Agilene 5TC-C18 5μm，250×1.6mm色谱柱、Diamonsil C18 5μm，250×1.6mm色谱柱或者Agela C18 5μm，250×1.6mm色谱柱。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的含量测定方法，其特征在于，C、盐酸小檗碱的含量测定中，柱温为25-30℃，和/或，C、盐酸小檗碱的含量测定中，流动相采用体积比为45:55的乙腈与含0.05-0.2％十二烷基磺酸钠和0.05-0.3％的磷酸的水溶液；和/或，B、黄芩苷的含量测定中，柱温为25-30℃，和/或，B、黄芩苷的含量测定中，供试品溶液的提取溶剂选自30％-80％的乙醇水溶液；和/或，A、芍药苷的含量测定中，供试品溶液的提取溶剂选自30％-80％的乙醇水溶液；和/或，A、芍药苷的含量测定中，色谱柱为Agilene5TC-C18 5μm，250×1.6mm色谱柱。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的含量测定方法，其特征在于，在芍药苷的含量测定、黄芩苷的含量测定以及盐酸小檗碱的含量测定中步骤(1)包括：取供试品0.1-0.3g，加入30％-80％的乙醇水溶液10-40mL，超声处理15min-1h，加入30％-80％的乙醇水溶液定容至25-50mL，滤过，取续滤液，即得。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的含量测定方法，其特征在于，黄芩苷对照品溶液的制备包括，取黄芩苷对照品，加溶剂制成每1ml含黄芩苷10-140μg的溶液；和/或，芍药苷对照品溶液的制备包括，取芍药苷对照品，加溶剂制成每1ml含芍药苷8-120μg的溶液；和/或，盐酸小檗碱对照品溶液的制备包括，取盐酸小檗碱对照品，加溶剂制成每1ml含盐酸小檗碱5-80μg的溶液。
10.一种中药组合物及其制剂的质量检测方法，其特征在于，包括按照权利要求1-9中任一所述的含量测定方法测定待测样品中芍药苷和/或黄芩苷和/或盐酸小檗碱的含量的步骤；所述中药组合物包括生地黄、熟地黄、芍药、山药、川续断、黄芩、黄柏和生甘草。
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