CN114113425A - 利用高效液相色谱鉴别芩连制剂中关黄柏替代黄柏入药的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药剂鉴别技术领域，具体涉及利用高效液相色谱鉴别芩连制剂中关黄柏替代黄柏入药的方法。当待测物为关黄柏入药时，通过高效液相色谱检测待测物中巴马汀和小檗碱两种生物碱的峰面积，当峰面积比大于0.20时，判定为关黄柏入药；当峰面积比不大于0.20时，判定为黄柏入药。本发明通过高效液相色谱法检测芩连制剂中巴马汀和小檗碱峰面积比，以筛查是否存在关黄柏替代黄柏入药的情况，为药品的生产、流通、使用过程中提供了一种快速检定的方法。
Description
技术领域
本发明属于药剂鉴别技术领域，涉及芩连制剂中快速筛查关黄柏替代黄柏入药的方法，具体涉及一种利用高效液相色谱鉴别芩连制剂中关黄柏替代黄柏入药的方法。
背景技术
芩连制剂是由黄芩、连翘、黄连、黄柏、赤芍、甘草等六味药经提取后制得的片剂、胶囊剂、颗粒剂以及丸剂，具有清热解毒、消肿止痛的功效，临床上用于脏腑蕴热、头痛目赤、口鼻生疮、热痢腹痛、湿热带下、疮疖肿痛等。以上四种剂型的处方配比和制法基本相同，均为黄芩、连翘、黄柏、甘草加水煎煮三次，滤液浓缩得清膏，与黄连、赤芍粉混匀加辅料制得不同的剂型。
黄柏、关黄柏分别为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinenseSchneid.和黄檗P.amurense Rupr.的干燥树皮，两者习称“川黄柏”和“关黄柏”，均性寒、味苦，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效。“黄柏”是常用中药材，自2005年版《中国药典》根据两者在成分含量和组成上的差异分列为黄柏和关黄柏。目前，临床上使用的多以黄柏为主，长期以来黄柏的价格高于关黄柏，因其化学成分相似，市场上常以关黄柏冒充黄柏。在药材、饮片的检验过程中，可以通过性状、显微鉴别、薄层鉴别等方法区分两者，但对于含黄柏或关黄柏的中成药而言，简单、快速、有效地解决其混淆、充伪问题尤为重要。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种利用高效液相色谱快速筛查关黄柏替代黄柏入药的方法。
为实现上述目的，本发明利用高效液相色谱快速筛查芩连制剂中关黄柏替代黄柏入药的方法，通过对芩连制剂中所含巴马汀和小檗碱进行检测，计算其峰面积比，来鉴别芩连制剂中是否存在黄柏替代入药的情况。
本发明以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ACE EXCEL 5C18柱，4.6×250mm，5μm)，以乙腈-0.1％磷酸溶液(每100ml加十二烷基磺酸钠0.2g)(36:64)为流动相，流速1mL/min，柱温35℃，检测波长为265nm；检测器：PDA，进样量为10μL。
有益效果：本发明通过高效液相色谱法对芩连制剂中所含巴马汀和小檗碱进行检测，计算其峰面积比，快速筛查芩连制剂中关黄柏替代黄柏入药的情况，快速、准确，为药品的生产、流通、使用过程中提供了一种快速筛查真伪的依据，有很好的应用价值。
附图说明
图1是巴马汀和小檗碱对照品谱图；
图2是黄柏模拟样谱图；
图3是关黄柏模拟样谱图；
图4是芩连片制剂谱图；
图5是芩连胶囊制剂谱图；
图6是芩连丸制剂谱图；
图7是缺黄柏芩连制剂谱图；
图8是缺黄连芩连制剂谱图；
图9是缺黄连加黄柏芩连制剂谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步阐明本发明，这些实施例是示例性的，旨在说明问题和解释本发明，并不是一种限制。
鉴于黄柏的主要药效成分包括酚酸类、生物碱类、三萜类、黄酮类等成分，其中小檗碱是代表性成分；关黄柏主要含有小檗碱、药根碱、木兰花碱、巴马汀、黄柏碱、甾醇及黏液质等多种成分，其中小檗碱和巴马汀是两个极具代表性的药效成分。以下实施方式采用高效液相色谱法对芩连制剂中所含巴马汀和小檗碱进行检测，计算其峰面积比，以期建立简单、快速地区分芩连制剂中黄柏和关黄柏入药的方法，为芩连制剂中是否存在关黄柏替代入药的筛查提供有效的方法。
1.仪器与材料
1.1仪器
岛津LC-20AB高效液相色谱仪，岛津PDA检测器，ACE EXCEL5C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，赛多利斯BS21S型电子天平，XM-300UVF超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司)；Milli-Q IQ7000超纯水一体化系统(密理博公司)。
1.2材料与试剂
盐酸小檗碱(批号110713-201814，纯度86.7％)、盐酸巴马汀(批号110732-201913，纯度85.7％)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、磷酸、十二烷基磺酸钠均为色谱纯，水为去离子水，其余均为分析纯。
2.试验方法
2.1色谱条件及峰面积计算
色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ACE EXCEL 5C18柱，4.6×250mm，5μm)；以乙腈-0.1％磷酸溶液(每100ml加十二烷基磺酸钠0.2g)(36:64)流动相，流速1mL/min，柱温35℃，检测波长为265nm。
峰面积计算
步骤一：记录出峰曲线上各点A1、A2、A3……的坐标数据为(x1,y1)、(x2,y2)、(x3,y3)……
步骤二：将出峰曲线上各点按照每连续四个点分成一组，得到以下点组：
(A1、A2、A3、A4)
(A5、A6、A7、A8)
……
(A4i-3、A4i-2、A4i-1、A4i)
……
步骤三：对任一点组(A4i-3、A4i-2、A4i-1、A4i)，使用A4i-3、A4i-2、A4i-1、A4i的坐标数据解得三次方程y＝aix3+bix2+cix+di中ai、bi、ci、di值，然后计算y＝aix3+bix2+cix+di在区间[x4i-3,x4i]内的定积分，得到区间[x4i-3,x4i]内的峰面积Si。
步骤四：对所有区间内的峰面积进行累加，得到峰面积S＝S1+S2、+S3+……+Si+……
该方法采用三次方程y＝aix3+bix2+cix+di对任一点组(A4i-3、A4i-2、A4i-1、A4i)拟合后积分得到峰面积，三次方程是同时具有增减性、凹凸性、凹凸转换性的最简方程，相较于常规色谱内置计算程序保留了出峰曲线的增减性、凹凸性、凹凸转换性，因此计算误差较小，峰面积精度较高。此外，该方法计算量小，对计算机的负担较轻。
2.2对照品溶液的制备
取盐酸巴马汀、盐酸小檗碱等对照品各适量，精密称定，用甲醇制成浓度分别为0.22mg/mL、0.18mg/mL的对照品储备溶液。
2.3供试品溶液的制备
取芩连制剂内容物适量，混匀，研细，取细粉约0.3g，精密称定，置50mL量瓶中，加入70％乙醇水溶液40mL，超声处理(功率300W，频率59kHz)20min，取出，放冷，用70％乙醇水溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4阴性样品溶液
按处方比例分别称取除黄连、黄柏及黄连加黄柏以外的其他味药，按制备工艺制成不含黄连、黄柏及黄连加黄柏的阴性供试品，按2.3项下方法操作，制得不含黄连、黄柏及黄连加黄柏的阴性对照溶液。
2.5模拟样对照溶液的制备
按处方比例分别称取黄柏或关黄柏及其他药味，按芩连片制备工艺制成黄柏模拟样与关黄柏模拟样，同供试品溶液制备，制得黄柏模拟样与关黄柏模拟样对照溶液。
2.6方法学研究
2.6.1线性考察
精密量取上述各对照品储备溶液适量，用甲醇稀释成标准系列溶液。各成分线性浓度见表1。按2.1色谱条件进样测定，记录峰面积，以对照品的浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。
表1对照品线性浓度范围(单位：μg/mL)
精密吸取各混合对照品线性溶液，在上述色谱条件下分别进样10μL测定，记录色谱图。以对照品进样量X(μg/mL)为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，各线性方程见表2。结果表明，巴马汀、小檗碱在1.1060～22.1192，9.2401～184.8011μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。
表2巴马汀与小檗碱线性方程表
2.6.2仪器精密度
取混合对照品，在上述色谱条件下连续进样6次，记录峰面积，计算仪器精密度，结果巴马汀、小檗碱峰面积的RSD(n＝6)分别为0.6％，0.1％，表明仪器精密度良好。
2.6.3重复性
片剂：取同一批样品，按2.3项下方法制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，巴马汀、小檗碱的含量分别为2.11，8.09mg·g-1，RSD分别为0.4％，1.6％，表明本方法重复性良好。
胶囊剂：取同一批样品，按2.3项下方法制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，巴马汀、小檗碱的含量分别为2.60，17.85mg·g-1，RSD分别为0.5％，0.2％，表明本方法重复性良好。
丸剂：取同一批样品，按2.3项下方法制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，巴马汀、小檗碱的含量分别为1.94，16.61mg·g-1，RSD分别为1.5％，2.0％，表明本方法重复性良好。
目前无市售芩连颗粒。
2.7样品测定
2.7.1模拟样测定
对模拟对照样品进行测定，黄柏模拟样的R值为0.09～0.17，关黄柏模拟样的R值为0.22～0.30。R值为小檗碱与巴马汀的峰面积的比值。
2.7.2不同批次、不同规格样品验证
搜集市售芩连片、芩连胶囊、芩连丸样品，按2.3项下方法操作，制备供试品溶液各2份，按上述色谱条件测定，计算R值为0.09～0.16。
3.结论
本研究采用高效液相色谱法对芩连制剂中所含巴马汀和小檗碱进行检测，计算其峰面积比，以“R≤0.20”作为黄柏入药的判定依据，以“R＞0.20”作为关黄柏入药的判定依据，建立了简单、快速地区分芩连制剂中黄柏和关黄柏入药的方法，为芩连制剂中是否存在黄柏替代入药的筛查提供了有效的方法。
以上实施方式是示例性的，其目的是说明本发明的技术构思及特点，以便熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.利用高效液相色谱鉴别芩连制剂中关黄柏替代黄柏入药的方法，其特征在于，通过高效液相色谱法检测芩连制剂中巴马汀和小檗碱峰面积比，根据巴马汀和小檗碱峰面积比值的大小判断是否存在关黄柏替代黄柏入药的情况。
2.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱鉴别芩连制剂中关黄柏替代黄柏入药，其特征在于，当待测物中巴马汀和小檗碱两种生物碱的峰面积比大于0.20时，判定为关黄柏入药；当峰面积比不大于0.20时，判定为黄柏入药。
3.根据权利要求1或2所述的利用高效液相色谱鉴别芩连制剂中关黄柏替代黄柏入药，其特征在于，巴马汀和小檗碱两种生物碱的峰面积比的检测方法为：取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，于265nm波长处测定峰面积，得到巴马汀和小檗碱的峰面积比。
4.根据权利要求3所述的筛查黄柏和关黄柏入药的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的测定条件为：采用ACE EXCEL 5 C18色谱柱（4.6×250mm，5μm），以乙腈-0.1%磷酸溶液（每100mL加十二烷基磺酸钠0.2g）（36:64）为流动相，检测波长265nm。
5.根据权利要求3所述的筛查黄柏和关黄柏入药的方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法为：取盐酸巴马汀、盐酸小檗碱等对照品各适量，精密称定，用溶剂制成浓度为0.2mg/mL的溶液。
6.根据权利要求3所述的筛查黄柏和关黄柏入药的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法为：取供试品粉末约0.3g，精密称定，置50mL量瓶中，加入溶剂40mL，超声处理20min，取出，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
7.根据权利要求6所述的筛查黄柏和关黄柏入药的方法，其特征在于，所述超声的功率为300W，频率59kHz。
8.根据权利要求6所述的筛查黄柏和关黄柏入药的方法，其特征在于，所述溶剂为70%乙醇水溶液。
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