CN102008541B

CN102008541B - 无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分的同时检测方法

Info

Publication number: CN102008541B
Application number: CN2010102991138A
Authority: CN
Inventors: 覃洁萍; 邓家刚; 冯军; 李芸; 李耀华; 冯旭
Original assignee: Guangxi University of Chinese Medicine
Current assignee: Guangxi University of Chinese Medicine
Priority date: 2010-10-08
Filing date: 2010-10-08
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-10-08
Also published as: CN102008541A

Abstract

本发明提供一种可用于同时检测无糖型复方扶芳藤制剂中3个主要活性成分含量的测定方法。该法采用超声辅助萃取法提取，以HILIC亲水色谱柱为固定相，乙腈-水为流动相，只用一个色谱条件便可同时测定该制剂中卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rb1的含量。经科学实验证明，该法简便、快速、准确性和重复性好，可用于各种剂型的无糖型复方扶芳藤制剂产品(如合剂、胶囊、片剂)的质量控制。

Description

无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分的同时检测方法

技术领域

本发明涉及一种无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分含量的同时检测方法，更确切地讲是无糖型复方扶芳藤制剂中卫矛醇、黄芪甲苷和人参皂苷Rb1含量的同时检测方法，属于复方中药制剂的分析检测领域。

背景技术

复方扶芳藤制剂是由扶芳藤、黄芪、红参(或人参)三味中药经适宜的加工、提取而制成的复方制剂，具益气补血、健脾养心的功效，有较好的补血、抗疲劳、提高机体免疫等作用，特别适合于气血亏虚，精力不足，失眠多梦，神经衰弱等患者。扶芳藤的主要成分是卫矛醇，而黄芪、红参(或人参)的主要成分有黄芪甲苷和人参皂苷等成分。现代药理研究表明，复方扶芳藤制剂中的卫矛醇及皂苷类等成分，具有增强心血管功能、增强造血功能、改善机体缺血状态等多种药理作用。目前复方扶芳藤制剂采用的质量控制方法是按照《中国药典》(一部)收载的质量标准进行。现行质量标准中除有TLC鉴别外，只有一个薄层色谱扫描的含量测定项目，用于测定制剂中黄芪甲苷的含量；显然现有的质量控制方法未能达到全面控制产品质量的目的。在我们的前期研究工作中，曾采用标准加入法测定了复方扶芳藤合剂中的人参皂苷Rg1和Rb1的含量；应用RP-HPLC-UV方法，建立了复方扶芳藤合剂中主要皂苷成分的HPLC-UV指纹图谱分析方法及HPLC-UV指纹图谱共有模式；并有用HPLC-ELSD法测定复方扶芳藤合剂中黄芪甲苷含量的报道。扶芳藤是该制剂的君药。但从目前已经建立的复方扶芳藤制剂的质量控制方法来看，这些方法较多的是测定制剂中黄芪、红参(或人参)的皂苷类成分，而对制剂中扶芳藤的主要成分卫矛醇的测定则少见报道。卫矛醇为糖醇类结构，极性较大，并且在紫外区没有吸收，因此一直无法用常规的高效液相色谱法进行分析。目前测定卫矛醇的方法主要有薄层扫描法，柱前衍生化后用HPLC、GC测定的方法，这些方法均存在实验操作步骤繁琐，实验条件不好控制等缺点。我们过去曾经报道过用正相色谱的氨基柱结合ELSD检测器分析测定复方扶芳藤胶囊中黄芪甲苷和卫矛醇的含量，但该法用的是正相柱，其缺点是当流动相含水量稍多时，固定相易流失，ELSD的基线噪音很大，从而影响了方法的重复性及稳定性，并且色谱柱的寿命较短。到目前为止，尚未有只用一个色谱系统就可同时测定复方扶芳藤制剂中3个药材的特征成分卫矛醇、黄芪甲苷和人参皂苷含量的报道。

发明内容

本发明的解决方案是提供一种无糖型复方扶芳藤制剂中卫矛醇、黄芪甲苷和人参皂苷Rb1含量的同时检测方法。该法采用超声辅助萃取法提取，并以新近开发的HILIC(Hydrophilic Interaction LiquidChromatography)亲水色谱柱为固定相，以乙腈-水为流动相，只用一个色谱条件便可同时测定该制剂中卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rb1的含量。经科学实验证明，该法简便、快速、准确性和重复性较好，可同时测定该制剂中3个药材的特征成分的含量，既可用于无糖型复方扶芳藤制剂成品的质量控制，也可用于生产中各中间体的质量控制。

本发明无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分的同时检测方法包括以下步骤：

1.对照品溶液的制备：

①对照品溶液I的制备：取黄芪甲苷和人参皂苷Rb₁对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得含黄芪甲苷和人参皂苷Rb₁的混合对照品溶液。

②对照品溶液II的制备：取卫矛醇对照品适量，精密称定，置容量瓶中，先加少量水溶解，再加稀甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得卫矛醇对照品溶液。

2.供试品溶液的制备：

①复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液I的制备：取本品装量差异项下的胶囊内容物(或片剂)研细，取细粉适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇适量，密塞，超声提取，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁醇少量多次洗涤，收集滤液和洗涤液，用氨试液洗涤，取正丁醇层水浴蒸干，残留物加甲醇溶解并定容，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，得供试品溶液I。

②复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液II的制备：取上述供试品溶液I制备项下正丁醇提取后留下的残渣，置具塞锥形瓶中，精密加入稀甲醇水溶液适量，密塞，称重，超声，放冷，补足重量，滤过，取续滤液稀释，定容；用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。

③无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液I的制备：精密吸取合剂(口服液)适量，加入适量水饱和的正丁醇，振摇均匀后，用超声仪辅助萃取，分取正丁醇层，用氨试液洗涤，弃去氨水层，减压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。

④无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液II的制备：取供试品溶液I制备项下正丁醇萃取留下的下层液，蒸至稠膏状，加适量硅藻土拌样分散均匀，转移至具塞锥形瓶中，精密加入水或稀甲醇的水溶液，称重，超声提取，放冷，补足重量，滤过，取续滤液用稀甲醇稀释，摇匀；用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。

3.色谱条件：以HILIC亲水色谱柱为固定相；乙腈-水为流动相，梯度洗脱；柱温为25～30℃；流速为1ml/min；检测器为蒸发光散射检测器。

4.测定方法

①黄芪甲苷、人参皂苷Rb₁含量测定法：分别精密吸取黄芪甲苷、人参皂苷Rb₁标准混合溶液及供试品溶液I适量，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算，即得。

②卫矛醇含量测定法：分别精密吸取卫矛醇标准溶液及供试品溶液II适量，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算，即得。

经过研究，本发明优化的无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分的同时检测方法按以下步骤实施：

1.对照品溶液的制备：

①对照品溶液I的制备：取黄芪甲苷和人参皂苷Rb₁对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得含黄芪甲苷0.5～0.6mg/ml和人参皂苷Rb₁0.1～0.2mg/ml的混合对照品溶液，即得。

②对照品溶液II的制备：取卫矛醇对照品适量，精密称定，置容量瓶中，先加少量水溶解，再加含30％-40％甲醇的水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度为0.8～1mg/ml的卫矛醇对照品溶液，即得。

2.供试品溶液的制备：

①复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液I的制备：取本品装量差异项下的胶囊内容物(或片剂)研细，取相当于原药材15-25克的细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50ml，密塞，超声提取45min，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁醇少量多次洗涤，收集滤液和洗涤液，用氨试液洗涤后，取正丁醇层水浴蒸干，残留物加甲醇溶解并定容至5ml，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。

②复方扶芳藤胶囊(或片剂)供试品溶液II的制备：取上述供试品溶液I制备项下正丁醇提取后留下的残渣，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入含30％-40％甲醇的水溶液50ml，密塞，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液1ml于5ml容量瓶，加30％-40％甲醇至刻度，摇匀；用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。

③无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液I的制备：精密吸取相当于原药材15-25克的合剂(口服液)，加水饱和的正丁醇50ml，振摇均匀，超声辅助萃取20min，分取正丁醇层，用氨试液洗涤，弃去氨水层，减压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容到5ml，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。

④无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液II的制备：取供试品溶液I制备项下正丁醇萃取后留下的下层液，蒸至稠膏状，加适量硅藻土拌样分散均匀，转移至100ml具塞锥形瓶中，精密加入含30％-40％甲醇的水溶液50ml，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液1ml于5ml容量瓶，加30％-40％甲醇至刻度，摇匀；用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。

3.色谱条件及色谱适用性试验：以phenomenex Luna HILIC(250mm×4.6mm i.d.，5μm)色谱柱为固定相，乙腈(A)-水(B)为流动相，其梯度洗脱的体积百分比条件是：0～5min 93％A，5～15min 93％～80％A，15～25min 80％A；柱温为25～30℃；流速为1ml/min；检测器为蒸发光散射检测器，色谱柱柱效以黄芪甲苷峰计算不小于15000。

4.测定方法

①黄芪甲苷、人参皂苷Rb₁含量测定法：分别精密吸取黄芪甲苷、人参皂苷Rb₁标准混合溶液5μl、10μl及供试品溶液I 10μl，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算，即得。

②卫矛醇含量测定法：分别精密吸取卫矛醇标准溶液2μl、5μl及供试品溶液II 5μl，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算，即得。

本发明与现有技术相比，其主要优点及积极效果在于：

(1)本发明的检测方法，采用新的HILIC(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)亲水色谱柱为固定相，只用一个色谱条件便可同时测定该制剂中主要特征成分卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rb1的含量。

(2)本发明的检测方法，采用超声辅助萃取法制备合剂的供试品溶液，方法简便、快速，易于操作，并有效地克服了通常液液萃取法操作繁琐及常见的乳化现象。

(3)本发明的检测方法，适用于各种剂型的无糖型复方扶芳藤制剂的检测，如合剂、胶囊或片剂。

(4)本发明的检测方法具有简便、快速、稳定，重复性及重现性好、准确性高，易于掌握和操作的特点。

本发明的检测方法，是通过大量实验摸索得到的切实可行的方法，具有可重复性和较好的稳定性，根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的其它实施方案，但只要使用本发明所述的检测方法，均在本发明保护范围之内。

附图说明：

附图1无糖型复方扶芳藤合剂供试品I(A)和供试品II(B)的HPLC-ELSD图谱

附图2复方扶芳藤胶囊供试品I(A)和供试品II(B)HPLC-ELSD图谱

附图3复方扶芳藤片供试品I(A)和供试品II(B)HPLC-ELSD图谱

附图4黄芪甲苷、人参皂苷Rb1混合对照品溶液HPLC-ELSD图谱

附图5卫矛醇对照品溶液HPLC-ELSD图谱

具体实施方式：

下面将结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施例仅作为示例，旨在说明本发明，并不构成对本发明的限制。

实施例1无糖型复方扶芳藤合剂中卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rb1的含量测定

1仪器与试药

1.1仪器

日本SHIMADZU Lc2010AHT高效液相色谱仪，包括在线真空脱气机、高压四元梯度泵、标准自动进样器、智能化柱温箱；检测器为SofiA corporation Model 400型蒸发光散射检测器，威马龙色谱工作站数据处理系统；SartoriusBP211D型电子分析天平；KQ5200B型超声波清洗器(功率：250W，频率50kHz)(昆山市超声仪器有限公司)；LG16-W型离心机(北京医用离心机厂)。

1.2试药

人参皂苷Rb₁对照品(中国药品生物制品检定所，批号110704-200216)，黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110781-200613)；卫矛醇对照品(北京化学试剂公司出品，批号000711)，经HPLC-ELSD峰面积归一化法检测纯度为99.2％；乙腈为色谱纯(Fisher Scientific)，正丁醇、氨水、甲醇为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，水为超纯水；无糖型复方扶芳藤合剂10批，由广西中医学院制药厂提供。

2方法与结果

2.1色谱条件及系统适用性试验

以phenomenex Luna HILIC(250mm×4.6mm i.d.，5μm)色谱柱为固定相，乙腈(A)-水(B)为流动相，其梯度洗脱的体积百分比条件是：0～5min 93％A，5～15min 93％～80％A，15～25min 80％A；柱温为28℃；流速为1ml/min；检测器为SoftA corporation Model 400型蒸发光散射检测器(SC＝40℃，DT＝80℃，FS＝5V，FLT＝5)；色谱柱柱效以黄芪甲苷峰计算不小于15000。在此色谱条件下，处方中其它成分对测定无干扰。无糖型复方扶芳藤合剂供试品I(A)和供试品II(B)的HPLC-ELSD图谱及黄芪甲苷、人参皂苷Rb1混合对照品溶液、卫矛醇对照品溶液的HPLC-ELSD图谱分别见附图1、附图4和附图5。

2.2对照品及供试品溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备

人参皂苷Rb₁和黄芪甲苷对照品溶液的制备：取人参皂苷Rb₁和黄芪甲苷对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解，制成每1ml含人参皂苷Rb₁0.128mg和每1ml含黄芪甲苷0.55mg的对照品混合溶液，即得。

卫矛醇对照品溶液的制备：取卫矛醇对照品适量，精密称定，加35％甲醇溶解并制成每1ml含卫矛醇对照品1.05mg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备

供试品溶液I的制备：精密吸取相当于原药材15克的合剂(口服液)样品，加水饱和的正丁醇50ml，振摇均匀，超声辅助萃取20min，分取正丁醇层，用氨试液洗涤，弃去氨水层，减压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容到5ml，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。

供试品溶液II的制备：取供试品溶液I制备项下正丁醇萃取后留下的下层液，蒸至稠膏状，加适量硅藻土拌样分散均匀，转移至100ml具塞锥形瓶中，精密加入含35％甲醇的水溶液50ml，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液1ml于5ml容量瓶，加35％甲醇至刻度，摇匀；用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。

2.3测定法

2.4方法学考察

2.4.1线性关系的考察

分别吸取黄芪甲苷及人参皂苷Rb₁混合对照品溶液2、4、8、10、12、14μl和卫矛醇对照品溶液1、2、3、4、5、6μl，按2.1项下色谱条件进样分析，测定峰面积，以峰面积的自然对数(Y)对进样量(μg)的自然对数(X)进行线性回归，求得回归方程分别是：黄芪甲苷Y＝1.4282X+13.251，r＝0.997；人参皂苷Rb₁Y＝1.5181X+12.651，r＝0.9971。实验结果显示，黄芪甲苷及人参皂苷Rb₁分别在1.1～6.6μg，0.256～1.792μg范围内，卫矛醇在2.10～7.35μg范围内，其峰面积的自然对数(Y)与进样量(μg)的自然对数(X)呈良好的线性关系。

表1黄芪甲苷峰面积的自然对数(Y)与进样量(μg)的

自然对数(X)的线性关系

线性方程：Y＝1.3786X+13.268，(r＝0.9958)，线性范围：1.1～7.7μg。

表2人参皂苷Rb₁峰面积的自然对数(Y)与进样量(μg)的

自然对数(X)的线性关系

线性方程：Y＝Y＝1.5187X+12.652，(r＝0.9971)，线性范围：0.256～1.792μg

表3卫矛醇峰面积的自然对数(Y)与进样量(μg)的

自然对数(X)的线性关系

线性方程：＝1.5723X+12.315(r＝0.9984)，线性范围：1.05～6.30μg。

2.4.2精密度试验

在“2.1”项色谱条件下，取黄芪甲苷及人参皂苷Rb₁混合对照品溶液和卫矛醇对照品溶液重复进样6次，进样量分别为10μl和5μl，依法测定，计算其峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)，进行精密度考察试验，结果表明仪器精密度良好。见表4、表4和表6。

表4黄芪甲苷峰面积和保留时间精密度结果

表5人参皂苷Rb₁峰面积和保留时间精密度结果

表6卫矛醇峰面积和保留时间精密度结果

2.4.3稳定性试验

精密吸取无糖型复方扶芳藤合剂样品(批号：20090928)15ml，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液I和供试品溶液II，分别于0、2、4、8、12、24h精密吸取供试品溶液I 10μl和供试品溶液II5μl进样，测定其峰面积和保留时间，计算其RSD，进行稳定性考察试验。结果表明样品溶液在24h内稳定。见表7、表8和表9。

表7黄芪甲苷峰面积和保留时间稳定性结果

表8人参皂苷Rb₁峰面积和保留时间稳定性测定结果

表9卫矛醇峰面积和保留时间稳定性测定结果

2.4.4重复性试验

取同一批无糖型复方扶芳藤合剂样品液(批号：20090928)6份各15ml，分别按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液I和供试品溶液II；精密吸取供试品溶液I 10μl和供试品溶液II 5μl，按2.1项下色谱条件及2.3项下测定法进样分析，测定黄芪甲苷、人参皂苷Rb₁及卫矛醇的含量，计算其RSD，进行重复性考察试验。试验结果表明，黄芪甲苷含量为0.158mg/ml，RSD为2.6％；人参皂苷Rb₁含量为0.0199mg/ml，RSD为4.2％，卫矛醇含量为7.92mg/ml，RSD为3.1％。实验结果表明该法重复性良好。

表10黄芪甲苷含量测定重复性试验结果

表11人参皂苷Rb₁含量测定重复性试验结果

表12卫矛醇含量测定重复性试验结果

2.4.5加样回收率试验

分别精密吸取同一批号供试品液9份，分成3组，每组分别精密加入高、中、低3个不同量的黄芪甲苷、人参皂苷Rb₁及卫矛醇对照品溶液，混匀后按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液I和供试品溶液II；精密吸取供试品溶液I 10μl和供试品溶液II5μl，按2.1项下色谱条件及2.3项下测定法进样分析，测定黄芪甲苷、人参皂苷Rb₁及卫矛醇的含量，计算加样回收率。实验结果表明，黄芪甲苷、人参皂苷Rb₁及卫矛醇的平均加样回收率分别为99.0％、99.6％和98.3％，RSD为2.8％、1.3％和2.2％(n＝9)。

2.5样品测定

分别精密吸取10批无糖型复方扶芳藤合剂样品液15-25ml，分别按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液I和供试品溶液II；精密吸取供试品溶液I 10μl和供试品溶液II 5μl，按2.1项下色谱条件及2.3项下测定法进样测定，并计算出每毫升无糖型复方扶芳藤合剂样品中黄芪甲苷、人参皂苷Rb₁及卫矛醇的含量，每批重复测定2次，计算其平均含量，结果见表13、14、15。

表13 10批样品黄芪甲苷含量测定结果(n＝2)

表14 10批样品人参皂苷Rb₁含量测定结果(n＝2)

表15 10批样品卫矛醇含量测定结果(n＝2)

实施例2复方扶芳藤胶囊的制备及其卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rb1的含量测定

1复方扶芳藤胶囊的制备

按处方比例称取按药典检测合格的扶芳藤、黄芪药材，加水煎煮二次，每次2小时，合并滤液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.12～1.16(60℃)的浸膏，放冷，加乙醇使含醇量为63％，搅拌，静置48小时，滤过，滤液备用。取人参药材，加65％乙醇加热回流提取三次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液与上述滤液合并，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.26(80℃)的浸膏，放冷，加入经100℃干燥24小时的淀粉，搅拌均匀，制粒，干燥，粉碎，装入胶囊，即得。

2复方扶芳藤胶囊中卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rb1的含量测定

2.1仪器与试剂

2.1.1仪器：同实施例1。

2.1.2试药：人参皂苷Rb1对照品(中国药品生物制品检定所，批号110704-200216)，黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110781-200613)；卫矛醇对照品(北京化学试剂公司出品，批号000711)，经HPLC-ELSD峰面积归一化法检测纯度为99.2％；乙腈为色谱纯(Fisher Scientific)，正丁醇、氨水、甲醇为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，水为超纯水。

2.2供试品溶液的制备

2.2.1供试品溶液I的制备：取本品装量差异项下的胶囊内容物研细，取相当于原药材15-25克的细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50ml，密塞，超声提取45min，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁醇少量多次洗涤，收集滤液和洗涤液，用氨试液洗涤后，取正丁醇层水浴蒸干，残留物加甲醇溶解并定容至5ml，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得供试品溶液I。

2.2.2供试品溶液II的制备：取上述供试品溶液I制备项下正丁醇提取后留下的残渣，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入含30％-40％甲醇的水溶液50ml，密塞，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液1ml于5ml容量瓶，加30％-40％甲醇至刻度，摇匀；用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II。

2.3HPLC分析条件：同实施例1。

2.4测定法：同实施例1。

复方扶芳藤胶囊供试品I(A)和供试品II(B)的HPLC-ELSD图谱及黄芪甲苷、人参皂苷Rb1混合对照品溶液、卫矛醇对照品溶液的HPLC-ELSD图谱分别见附图2、附图4和附图5。

实施例3复方扶芳藤片中卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rb1的含量测定

1复方扶芳藤片的制备：

按处方比例称取按药典检测合格的红参药材，用65％乙醇加热回流提取三次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液备用；药渣加水煎煮三次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.06(60℃)，放冷，冷藏48小时以上，滤过，滤液备用；扶芳藤和黄芪加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.14(60℃)，放冷，加2倍量乙醇，搅匀，静置48小时以上，滤过，滤液与红参的乙醇提取液及水煎液合并，浓缩至相对密度为1.26(80℃)的浸膏，放冷。，取药材提取得到的浸膏，加入适量淀粉，混匀，干燥，制粒，压片，即得。

2复方扶芳藤片中卫矛醇、黄芪甲苷、人参皂苷Rb1的含量测定

2.1仪器与试剂

2.1.1仪器：同实施例1。

2.1.2试药：同实施例2。

2.2供试品溶液的制备：

2.2.1供试品溶液I的制备：取本品20片研细，取相当于原药材15-25克的细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50ml，按实施例2方法制备供试品溶液I，即得。

2.2.2供试品溶液II的制备：同实施例2。

2.3HPLC分析条件：同实施例1。

2.4测定法：同实施例1。

复方扶芳藤片供试品I(A)和供试品II(B)的HPLC-ELSD图谱及黄芪甲苷、人参皂苷Rb1混合对照品溶液、卫矛醇对照品溶液的HPLC-ELSD图谱分别见附图3、附图4和附图5。

Claims

1.一种无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分含量的同时检测方法，其特征在于检测方法包括以下步骤：

(1)色谱条件：以HILIC亲水色谱柱phenomenex Luna HILIC为固定相，其规格为250mm×4.6mm i.d.，5μm；乙腈-水为流动相，梯度洗脱，其梯度洗脱的体积百分比条件是：0～5min 93％乙腈，5～15min 93％～80％乙腈，15～25min 80％乙腈；柱温为25～30℃；流速为1ml/min；检测器为蒸发光散射检测器；色谱柱柱效以黄芪甲苷峰计算不小于15000；

(2)对照品溶液的制备：

①对照品溶液I的制备：取黄芪甲苷和人参皂苷Rb₁对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得含黄芪甲苷0.5～0.6mg/ml和人参皂苷Rb₁0.1～0.2mg/ml的混合对照品溶液，即得；

②对照品溶液II的制备：取卫矛醇对照品适量，精密称定，置容量瓶中，先加少量水溶解，再加含35％甲醇的水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度为0.8～1mg/ml的卫矛醇对照品溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备：

①复方扶芳藤胶囊或片剂供试品溶液I的制备：取本品装量差异项下的胶囊内容物或复方扶芳藤片研细，取相当于原药材15-25克的细粉，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50ml，密塞，超声提取45min，放冷，滤过，残渣用水饱和正丁醇少量多次洗涤，收集滤液和洗涤液，用氨试液洗涤，弃去氨水层，分取正丁醇层水浴蒸干，残留物加甲醇溶解并定容至5ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I；

②复方扶芳藤胶囊或片剂供试品溶液II的制备：取上述供试品溶液I制备项下正丁醇提取后留下的残渣，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入含30％-40％甲醇的水溶液50ml，密塞，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液1ml于5ml容量瓶，加含30％-40％甲醇的水溶液至刻度，摇匀；用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II；

③无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液I的制备：精密吸取相当于原药材15-25克的合剂样品，加水饱和的正丁醇50ml，振摇均匀，超声20min，分取正丁醇层，用氨试液洗涤，弃去氨水层，减压回收正丁醇，残渣用甲醇溶解并定容到5ml，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液I；

④无糖型复方扶芳藤合剂供试品溶液II的制备：取供试品溶液I制备项下正丁醇萃取后留下的下层液，蒸至稠膏状，加适量硅藻土拌样分散均匀，转移至100ml具塞锥形瓶中，精密加入含30％-40％甲醇的水溶液50ml，称重，超声30min，放冷，补足重量，滤过，取续滤液1ml于5ml容量瓶，加含30％-40％甲醇的水溶液至刻度，摇匀；用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液II；

(4)测定方法

①黄芪甲苷、人参皂苷Rb₁含量测定法：分别精密吸取黄芪甲苷、人参皂苷Rb₁标准混合溶液5μl、10μl及供试品溶液I 10μl，注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算黄芪甲苷和人参皂苷Rb₁的含量，即得；

②卫矛醇含量测定法：分别精密吸取卫矛醇标准溶液2μl、5μl及供试品溶液II 5μl，注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，以外标两点法对数方程计算卫矛醇含量，即得。

2.如权利要求1所述的无糖型复方扶芳藤制剂中3种主要活性成分含量的同时检测方法，其特征在于其中的无糖型复方扶芳藤制剂是由扶芳藤、黄芪、人参或红参制备而成的，是不加蔗糖的合剂、胶囊或片剂。