CN101920001B - 五积散制剂及其中间体的hplc指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种五积散制剂及其中间体的指纹图谱质量测定方法。该方法指纹图谱质量测定方法由以下步骤组成：定量称取五积散制剂或其中间体，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液；吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到五积散制剂或其中间体的指纹图谱；其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为甲醇，流动相B为磷酸水溶液，流动相中A与B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为285～305nm。本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。

Description

五积散制剂及其中间体的HPLC指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及中药指纹图谱的质量测定方法，具体地说，本发明是一种五积散制剂及其中间体的指纹图谱质量测定方法。

背景技术

目前，由于种种原因，中药质量标准很不完善。市场上屡见中药的混淆品甚至伪品，严重危害人们的用药安全。因此加强对中药质量的研究，制定出更完善、更准确且更有权威性的评价中药质量的方法，这已成为人们的共识。

中药质量评价的现行标准是利用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分、活性成分或指标成分，以及药典规定的常规检查项目，有的甚至仅有一般的检查项目，且多为定性鉴别。目前的质量控制手段还难以从整体上反应中药内在质量的优劣。从发展趋势看，从现行的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的鉴别并与主要有效成分含量的测定相结合，已是发展的趋势。

中药质量的优劣，归根到底在于其内所含的化学成分及其含量上存在的差异。这种差异可以通过中药的色谱指纹图谱反应出来。采用现代色谱分析技术，可选用适当方法，一次得到若干个色谱峰，每一个峰的位置代表不同组分，其峰面积的大小反映了各组分的含量高低。因此色谱指纹图谱能够从整体上反映中药质量的差异，能够较好地体现出中药成分的复杂性和相关性，尤其是在现阶段绝大多数有效成分不明确的情况下，能够更好反映并评价、控制中药的内在质量。

五积散源于《太平惠民和剂局方》，由苍术、厚朴、陈皮、半夏、茯 苓、甘草、麻黄、桂枝、白芍、当归、川芎、干姜、枳壳、桔梗、白芷十五味药物组成。综观五积散全方，结构严谨，药味多而不冗杂，实为诸名方综合的复方。功能发表温中、燥湿化痰、理气活血，为消除寒、食、气、血、痰五积之剂。现内外妇儿临床中多用于脾胃宿冷，腹胁胀痛，胸膈停痰，呕逆恶心；外感风寒湿，内伤生冷，心腹痞闷，头目昏痛，肩背拘急，肢体怠惰，寒热往来，饮食不进；及妇人血气不调，心腹撮痛，经候不调，或闭不通方。

目前，市场上五积散制剂仅有五积丸、五积散颗粒及五积散酒，剂型较为单一。现有药品标准中对五积散制剂的质量控制仅有性状鉴别和检查项，已不能满足对质量控制的要求。文献报道中，对五积散制剂的质量控制的报道也仅李若存等对五积丸中麻黄、白术、厚朴、当归、苍术进行了薄层鉴别的研究(李若存等，湖南中医杂志，1997，13(2)：43)，这种薄层鉴别也仅是一种定性的质量控制，没有从量上进行质量控制。为更好地控制该制剂的质量，保证用药的安全性，更好地指导生产，使工艺控制更严格合理，是消费者能全面认识产品质量，有必要研究建立其指纹图谱质量测定方法，同时对原质量标准进行提高。

发明内容

本发明为了弥补现有五积散制剂质量控制技术的不足，提供一种简便、可靠、重复性好的，可宏观控制五积散制剂及其中间体的内在质量的中药指纹图谱测定方法。

为了实现上述的发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种五积散制剂及其中间体的指纹图谱质量测定方法，由以下步骤组成：

(a)供试品溶液的制备：取五积散制剂或其中间体，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液；

(b)供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到五积散制剂或其中间体的指纹图谱；

其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为甲醇，流动相B为磷酸水溶液，流动相中A与B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为285～305nm；

所述的梯度洗脱的程序采用以下程序：

0～20分钟时，流动相A∶流动相B＝10∶90～15∶85；

20～25分钟时，流动相A∶流动相B＝15∶85～30∶70；

25～60分钟时，流动相A∶流动相B＝30∶70～50∶50；

60～70分钟时，流动相A∶流动相B＝50∶50～70∶30；

70～110分钟时，流动相A∶流动相B＝70∶30～100∶0；

所述梯度洗脱程序的各步骤中，流速为0.80～1.20毫升/分钟，所述的比例均为体积比。

上述的梯度洗脱的程序，优选采用以下程序：

0分钟时，流动相A∶流动相B＝10∶90；

20分钟时，流动相A∶流动相B＝15∶85；

25分钟时，流动相A∶流动相B＝30∶70；

60分钟时，流动相A∶流动相B＝50∶50；

70分钟时，流动相A∶流动相B＝70∶30；

110分钟时，流动相A∶流动相B＝100∶0；

上述各步骤中，流速为1.00毫升/分钟，所述的比例均为体积比。

所述的高效液相色谱的检测波长为294nm。

所述的色谱柱的柱温为25～35℃，最优选的色谱柱的柱温为30℃。

优选的流动相B为0.05～0.4％的磷酸水溶液，最优选的流动相B为 0.2％的磷酸水溶液。

本发明具有以下的优点：

(1)本发明在建立五积散制剂及其中间体的指纹图谱过程中，确认了18个共有特征指纹峰，并对其相对保留时间和相对峰面积进行了研究，保证了制剂的化学组成稳定性和使用安全性。而现有技术中，仅有对五积散制剂进行定性质量控制的方法。

(2)五积散处方含十五味药材，药味甚多，化学成分复杂，要实现其特征指纹峰的分离难度很大。为了克服上述的难题，发明人在建立起指纹图谱的过程中，采用了梯度洗脱的方法，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题。

(3)建立的五积散制剂标准指纹图谱代表着五积散制剂大部分药理活性，能有效地表征五积散制剂的质量，从而实现对五积散制剂的大部分化学成分进行检测，可以从整体上、宏观上控制五积散制剂的内在质量。

(4)以五积散制剂中各有效成分指纹图形作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定五积散制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价五积散制剂的质量提供了新的对照标准，将为提高五积散制剂的质量及疗效控制提供参考依据。

(5)本发明方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。可用于鉴别五积散制剂的真伪，为我国药品行业产品质量的监控提供示范。

(6)可用于生产工艺稳定性和产品稳定性的考察，有利于对中药质量的全方面监控。

附图说明

图1是本发明实施例中对照品溶液叠加图。

图2是本发明实施例中五积散酒的代表性HPLC对照指纹图谱。

图3是本发明实施例中10批次五积散酒的代表性HPLC指纹图谱。

图4是本发明实施例中五积散酒中间体的代表性HPLC对照指纹图谱。

图5是本发明实施例中10批次五积散酒中间体的代表性HPLC指纹图谱。

具体实施方式

实施例1五积散酒中间体、制剂的制备

取茯苓80g、当归60g、白芍60g、桔梗60g、苍术(麸炒)60g、白芷60g、厚朴(姜制)60g、陈皮60g、枳壳(麸炒)60g、麻黄60g、半夏(制)60g、桂枝60g、甘草60g、川芎30g、干姜30g，以上十五味，粉碎成粗粉，用白酒作溶剂，浸渍10～15天后，缓缓渗漉，即得中间体漉液。

将收集的漉液另取蔗糖2000g制成糖浆，待温，加入上述漉液中，静置，滤过，约制成17500g，即得。

实施例2五积散丸的制备

取茯苓90g、当归90g、白芍90g、桔梗180g、苍术(麸炒)240g、白芷90g、厚朴(姜制)120g、陈皮150g、枳壳(麸炒)、150g、麻黄120g、法半夏90g、桂枝150g、甘草90g、川芎60g、干姜90g，以上十五味，茯苓与白芍粉碎，过80目筛，得细粉，备用；苍术(麸炒)、枳壳、陈皮、桂枝、干姜、白芷、当归、川芎和厚朴(姜制)九味药材提取挥发油，用β-CD包合，放置12h以上，过滤，低温干燥，得包合物备用。提油后的药渣及药液与桔梗、甘草、麻黄和半夏加水煎煮二次，每次2h， 所得水提液过滤后浓缩至相对密度为1.25-1.35(60℃测)的稠膏，备用。将上述β-CD包合物、稠膏、细粉与淀粉适量，混匀，制丸，干燥，打光，即得。

实施例3五积散颗粒的制备

取茯苓150g、当归150g、白芍150g、桔梗300g、苍术(麸炒)400g、白芷150g、厚朴(姜制)200g、陈皮250g、枳壳(麸炒)250g、麻黄200g、法半夏150g、桂枝250g、甘草150g、川芎100g、干姜150g，以上十五味，苍术(麸炒)、枳壳、陈皮、桂枝、干姜、白芷、当归、川芎和厚朴(姜制)九味提取挥发油，用β-CD包合，放置12h以上，过滤，低温干燥，得包合物备用。提油后的药渣及药液与桔梗、白芍、甘草、麻黄、半夏(制)、茯苓共煎煮二次，每次2小时，合并煎液，过滤，滤液浓缩至相对密度1.1-1.2(60℃测)的浸膏，备用。将上述β-CD包合物、浸膏和糊精适量，混匀，制成颗粒，干燥，制成1000g，即得。

实施例4指纹图谱测定

1、仪器与试剂

仪器：采用Waters 2695液相色谱，包括四元泵，在线脱气装置，自动进样器，PDA检测器，柱温箱，Empower2工作站；CP225D电子天平(北京塞多利斯公司)、数显恒温水浴锅(天津长风有限公司)、KQ-300DV超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、合成纤维过滤膜(孔径0.45μm)(上海兴亚净化材料厂)。

试剂：甲醇为色谱纯；乙醇、磷酸等为分析纯；超纯水自制。

2、供试品溶液的制备：

五积散酒供试品溶液的制备：取实施例1各批次五积散酒，研细，取约10.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品。

五积散酒中间体供试品溶液的制备：取实施例1各批次浸膏8.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品。

3、HPLC分析条件

InertsilODS-2(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相：A相为甲醇；B相为0.05％磷酸水溶液。检测波长285nm，柱温35℃；进样体积20μl；色谱流动相洗脱梯度如下表1。

表1  色谱流动相的洗脱梯度

4、数据分析

共计对10批五积散酒分别进行指纹图谱分析，以峰面积较大、保留时间适中的柚皮苷为参照物，将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间。分别计算10批五积散酒中各色谱峰的相对保留时间(见表2)、相对峰面积(见表3)，其中18个峰为各样品所共有(见图3)。

各共有峰相对保留时间为：峰1(0.2567～0.2621)，峰2(0.6271～0.6300)，峰3(0.8319～0.8337)，峰4(0.8709～0.8725)，峰5(0.9604～0.9615)，峰S(1.0000)，峰7(1.0222～1.0227)，峰8(1.0591～1.0606)，峰9(1.1299～1.1317)，峰10(1.1793～1.1820)，峰 11(1.2548～1.2579)，峰12(1.3318～1.3362)，峰13(1.5496～1.5580)，峰14(1.6261～1.6351)，峰15(1.6469～1.6570)，峰16(1.6570～1.6671)，峰17(1.8685～1.8866)，峰18(2.3255～2.3452)。

表2 10批五积散酒的HPLC色谱指纹图谱中共有峰的相对保留时间

表3 10批五积散酒的HPLC色谱指纹图谱中共有峰的相对峰面积

相似度评价

将10批样品的指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004A版》中，计算各样品指纹图谱与生成的对照图谱R的相似度，结果见表4。

表4 10批样品指纹图谱相似度评价结果

共计对10批五积散酒中间体分别进行指纹图谱分析，以峰面积较大、保留时间适中的柚皮苷为参照物，将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间。分别计算10批五积散酒中间体中各色谱峰的相对保留时间(见表5)、相对峰面积(见表6)，其中18个峰为各样品所共有(见图5)。

各共有峰相对保留时间为：峰1(0.6232～0.6312)，峰2(0.8245～0.8364)，峰3(0.8517～0.8632)，峰4(0.9569～0.9638)，峰S(1.0000)，峰6(1.0230～1.0336)，峰7(1.0604～1.0714)，峰8(1.1290～1.1407)，峰9(1.1796～1.1904)，峰10(1.2533～1.2638)，峰11(1.3285～1.3429)，峰12(1.5455～1.5812)，峰13(1.6227～1.6629)，峰14(1.6388～1.6781)，峰15(1.6522～1.6927)，峰16(1.7317～1.7651)，峰17(1.8664～1.9021)，峰18(2.3895～2.4426)。

表5  10批五积散酒中间体的HPLC色谱指纹图谱中共有峰的相对保留时间

表6 10批五积散酒中间体的HPLC色谱指纹图谱中共有峰的相对峰面积

相似度评价

将10批样品的指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件 2004A版》中，计算各样品指纹图谱与生成的对照图谱R的相似度，结果见表7。

表7 10批样品指纹图谱相似度评价结果

实施例5指纹图谱测定

1、仪器与试剂(同实施例4)

2、供试品溶液的制备：

五积散丸供试品溶液的制备：取实施例二各批次五积散丸，研细，取约0.28g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加稀乙醇超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品。

3、HPLC分析条件

InertsilODS-2(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相：A相为甲醇；B相为0.2％磷酸水溶液。检测波长294nm，柱温25℃；进样体积20μl；色谱流动相洗脱梯度见下表8。

表8  色谱流动相的洗脱梯度

4、数据分析

共计对10批五积散丸分别进行指纹图谱分析，以峰面积较大、保留时间适中的柚皮苷为参照物，将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间。分别计算10批五积散酒中各色谱峰的相对保留时间(见表9)、相对峰面积(见表10)，其中18个峰为各样品所共有。

各共有峰相对保留时间为：峰1(0.3069～0.3126)，峰2(0.6072～0.6188)，峰3(0.8237～0.8391)，峰4(0.8767～0.8898)，峰5(0.9395～0.9638)，峰S(1.0000)，峰7(1.0079～1.0297)，峰8(1.0282～1.0539)，峰9(1.0934～1.1147)，峰10(1.1448～1.1632)，峰11(1.2062～1.2387)，峰12(1.2761～1.2997)，峰13(1.4461～1.4599)，峰14(1.4489～1.4892)，峰15(1.4896～1.5107)，峰16(1.4936～1.5201)，峰17(1.6363～1.6788)，峰18(2.1011～2.1154)。

表9  10批五积丸的HPLC色谱指纹图谱中共有峰的相对保留时间

表10  10批五积丸的HPLC色谱指纹图谱中共有峰的相对峰面积

相似度评价

将10批样品的指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004A版》中，计算各样品指纹图谱与生成的对照图谱R的相似度，结果见表11。

表11  10批样品指纹图谱相似度评价结果

实施例6指纹图谱测定

1、仪器与试剂(同实施例4)

2、供试品溶液的制备：

五积散颗粒供试品溶液的制备：取实施例3各批次五积散颗粒，研 细，取约0.17g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水超声提取3次，每次30分钟，蒸干，溶解，定容，过滤，即为供试品；

3、HPLC分析条件

InertsilODS-2(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相：A相为乙腈∶甲醇溶液(1∶10)；B相为水。检测波长275nm，柱温28℃；进样体积20μl；色谱流动相洗脱梯度见下表12。

表12色谱流动相的洗脱梯度

4、数据分析

共计对10批五积散颗粒分别进行指纹图谱分析，以峰面积较大、保留时间适中的柚皮苷为参照物，将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间。分别计算10批五积散颗粒中各色谱峰的相对保留时间(见表13)、相对峰面积(见表14)，其中18个峰为各样品所共有。

各共有峰相对保留时间为：峰1(0.1628～0.1658)，峰2(0.5412～0.5498)，峰3(0.8011～0.8132)，峰4(0.8510～0.8609)，峰5(0.9560～0.9661)，峰S(1.0000)，峰7(1.0245～1.0470)，峰8(1.0592～1.0677)，峰9(1.1322～1.1403)，峰10(1.1935～1.2260)，峰11(1.2889～1.3149)，峰12(1.3617～1.3717)，峰13(1.5678～1.6032)， 峰14(1.6036～1.6373)，峰15(1.6247～1.6524)，峰16(1.6461～1.6718)，峰17(1.8583～1.8898)，峰18(2.3105～2.3789)。

表13  10批五积颗粒的HPLC色谱指纹图谱中共有峰的相对保留时间

表14 10批五积颗粒的HPLC色谱指纹图谱中共有峰的相对峰面积

相似度评价

将10批样品的指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004A版》中，计算各样品指纹图谱与生成的对照图谱R的相似度，结果见表15。

表15  10批样品指纹图谱相似度评价结果

以上对本发明所提供的五积散制剂及其中间体的指纹图谱质量测定方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (7)

1.一种五积散制剂及其中间体的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，由以下步骤组成：

(a)供试品溶液的制备：取五积散制剂或其中间体，用水、甲醇或乙醇中的至少一种溶剂提取，定容，得供试品溶液；

(b)供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到五积散制剂或其中间体的指纹图谱；

其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为甲醇，流动相B为磷酸水溶液，流动相中A与B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为285～305nm；

所述的梯度洗脱的程序是：

0～20分钟时，流动相A∶流动相B＝10∶90～15∶85；

20～25分钟时，流动相A∶流动相B＝15∶85～30∶70；

25～60分钟时，流动相A∶流动相B＝30∶70～50∶50；

60～70分钟时，流动相A∶流动相B＝50∶50～70∶30；

70～110分钟时，流动相A∶流动相B＝70∶30～100∶0；

所述梯度洗脱程序的各步骤中，流速为0.80～1.20毫升/分钟，所述的比例均为体积比。

2.根据权利要求1所述的五积散制剂及其中间体的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于，所述的梯度洗脱的程序是：

0分钟时，流动相A∶流动相B＝10∶90；

20分钟时，流动相A∶流动相B＝15∶85；

25分钟时，流动相A∶流动相B＝30∶70；

60分钟时，流动相A∶流动相B＝50∶50；

70分钟时，流动相A∶流动相B＝70∶30；

110分钟时，流动相A∶流动相B＝100∶0；

上述各步骤中，流速为1.00毫升/分钟，所述的比例均为体积比。

3.根据权利要求1或2所述的五积散制剂及其中间体的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述的高效液相色谱的检测波长为294nm。

4.根据权利要求1或2所述的五积散制剂及其中间体的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述的色谱柱的柱温为25～35℃。

5.根据权利要求4所述的五积散制剂及其中间体的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述的色谱柱的柱温为30℃。

6.根据权利要求1或2所述的五积散制剂及其中间体的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述的流动相B为0.05～0.4％的磷酸水溶液。

7.根据权利要求6所述的五积散制剂及其中间体的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述的流动相B为0.2％的磷酸水溶液。

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