CN102539553B - 一种强肝药物的指纹图谱的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种强肝药物指纹图谱的建立方法,所述强肝药物由茵陈、板蓝根、当归、白芍、丹参、郁金、黄芪、党参、泽泻、黄精、地黄、山药、山楂、秦艽、甘草、六神曲组成,所述建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述强肝药物中的芍药苷,条件包括:色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料;流动相包括:流动相A为乙腈,流动相B为酸性水溶液,进行梯度洗脱;流速:1.0mL/min;柱温:30℃;检测波长:210nm~400nm;理论塔板数按芍药苷峰计算,应不低于6000。所获得指纹图谱主要以其组成成分秦艽、白芍、甘草、丹参、茵陈、黄芪有效成分为主的色谱峰。采用本发明的建立方法,能有效获得能够全面表征强肝药物活性组分的指纹图谱,具有精密度、稳定性、重复性高的特点。获得的指纹图谱可用于确保产品质量的稳定一致,从而保证产品的安全有效。
Description
技术领域
本发明属于药物分析检测领域,涉及一种强肝药物的指纹图谱的建立方法,特别涉及强肝胶囊的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的建立方法。
背景技术
复方中药是中医临床用药的主要形式,是中医药学的特色与精髓。中药是一个由多成分、多因素构成的复杂体系,其化学成分的多样性与复杂性是其疗效的物质基础,建立符合中医药特点的现代质量控制体系,攻克中药质量分析与评价的难题,改进中药现有质量控制方法已成为人们积极研究的课题。
建立对中药的质量控制体系必须立足于中药的特色。复方中药的整体作用特点决定了中药不同于西药。中药的质量控制方法必须能对起效的全部成分(有机成分、无机成分和络合物成分)进行控制。只有这样,所建立的质量控制体系才能真正达到控制中药质量、保证中药用药安全有效的目的。中药质量控制正从简单的单个成分含量测定转向以先进技术为手段,多组分、多指标含量的测定及采用中药指纹图谱方式能够有效地表征中药的质量。通过指纹图谱中主要特征峰的相对保留时间及含量或比例的制定和比对,能有效地控制中药材及中药产品质量,保证产品质量的相对稳定。中药指纹图谱不仅包括了对几个已知成分的分析,还包括了对已知成分与各未知成分之间的相对含量分析。因此,中药指纹图谱真正体现了对中药内在质量的综合评价和全面控制,尤其适用于有效成分不完全明确的情况下,对中药材及中药产品的质量控制。
目前多数中药标准还是采用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分或指标成分,以及药典规定的常规检查项目。对于化学药品而言,其药效成分为结构清晰的单一化合物,构效关系明确,其含量和纯度直接表达其有效性及安全性。然而,中医用药的特点是复方配伍,任何单一的有效或活性成分的含量高低均不能表达其整体的疗效。在德国、法国等欧洲国家对植物药质量控制采用高效液相指纹图谱方法,近几年我国也 起步使用指纹图谱的质量控制方法,如中国药典2010年版一部复方丹参滴丸和注射液用双黄连标准中就采用HPLC指纹图谱作为控制物质群的质量控制方法,这是现代中药质量控制控制方法的进步,因此,其推行实施对中药的发展和规范必将起到积极的影响,同时指纹图谱也为国际社会所认可,有利于中药及其产品进入国际市场。
中药指纹图谱分析是对原药材、半成品、最终产品判断其真实性、质量一致性与稳定性的可行而有效的手段,在中药的药材鉴别、工艺生产、药效部位筛选、质量控制等方面的研究中应用广泛。利用标准指纹图谱追踪工艺过程及监测原药材与最终产品质量的稳定性、一致性,色谱指纹图谱可以较为全面地检测其多种成分在药材中分布的全貌,使药材的内在质量情况可控。
强肝胶囊收载于《国家药品标准新药转正标准》第三十五册,由茵陈、板蓝根、当归、白芍、丹参、郁金、黄芪、党参、泽泻、黄精、地黄、山药、山楂、秦艽、甘草、六神曲16味中药组成,具有清热利湿、补脾养血、益气解郁的功效。用于治疗慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪肝、中毒性肝炎、肝纤维化等。
强肝胶囊为石家庄东方药业有限公司生产的中药大品种,经研究证明,强肝胶囊有较强的抗肝纤维化作用,具有保护肝细胞,促进肝细胞再生,恢复肝功能和抑制纤维化作用。临床上用于治疗肝纤维化、早期肝硬化、病毒性肝炎、中毒性肝病、脂肪肝等,其治疗效果已经得到临床的验证。如何保证药物的质量以及强肝胶囊中有效成分的含量,是决定强肝胶囊疗效的基础。现行的强肝胶囊质量标准规定了茵陈、白芍的薄层色谱鉴别方法和芍药苷高效液相色谱含量测定方法。作为中药大复方,仅从外观性状、简单的鉴别和单一成分含量测定等角度对强肝胶囊进行质量控制,显然不能全面准确说明其内在的质量,不能保证其疗效。要控制强肝胶囊的功效,必须根据中药多组分、多靶点、多途径作用的特点,对其物质整体予以控制,从整体上有效地表征中药的质量,建立安全、有效、稳定的质量标准体系。指纹图谱作为中药及其成方制剂的质量控制的最优方法,目前已经成为国家共识。采用中药指纹图谱方式,一方面可以通过指纹图谱的特征性,有效的鉴别样品的真伪和产地,另一方面通过对主要指纹图谱特征峰的面积或比例的控制,能有效控制产品的质量,确保产品质量的稳定一致,从而保证产品安全有效。
有关强肝胶囊质量控制的文献报道较少。罗晨曲等建立了高效液相色 谱法测定强肝胶囊中龙胆苦苷含量的方法,陈理等用反相高效液相色谱法测定强肝胶囊中丹参酮II A及甘草酸的含量,但都仅局限于测定强肝胶囊大复方中的一、二种指标成分,但如何能够从宏观的角度对强肝胶囊制剂质量的进行宏观质量控制方法未见报道。同时,由于强肝胶囊的原料包含16味中药且中药成分之间存在复杂的相互作用,导致建立全面、有效地反映强肝胶囊内在质量和疗效的有效成分检测方法存在较大难度,因此,目前本领域存在对能够全面表征强肝胶囊这种药物的检测方法,例如指纹图谱的建立方法的需求。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的是提供一种建立强肝药物,如强肝胶囊内容物的指纹图谱的方法,该方法建立的指纹图谱能够全面表征这种强肝药物的药物活性组分及其含量,从而表征和控制其内在质量。
本发明的另一个目的是提供通过采用所建立的指纹图谱检测强肝药物的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一方面,本发明提供了一种强肝药物指纹图谱的建立方法,所述强肝药物由茵陈、板蓝根、当归、白芍、丹参、郁金、黄芪、党参、泽泻、黄精、地黄、山药、山楂、秦艽、甘草、六神曲组成(例如强肝胶囊,收载于《国家药品标准新药转正标准》第三十五册),所述建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述强肝药物成分,其中,所述高效液相色谱法的条件包括:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料;
流动相:流动相A为乙腈,流动相B为0.05%体积分数磷酸水溶液,进行梯度洗脱,所述梯度洗脱程序如下,其中流动相比例均为体积百分比:
0~15min,流动相A为0~10%,流动相B为100%~10%;
15~50min,流动相A为10%~30%,流动相B为90%~70%;
50~65min,流动相A为30%~60%,流动相B为70%~40%;
65~75min,流动相A为60%~100%,流动相B为40%~0%。
75~85min,流动相A为0%~100%,流动相B为100%~0%。
优选地,所述高效液相色谱法的条件还包括:
流速:1.0mL/min;
柱温:30℃;
检测波长:210nm~400nm;
理论塔板数按芍药苷峰计算,应不低于6000。
优选地,上述建立方法还包括通过以下步骤制备对照品溶液:取芍药苷对照品适量,加入甲醇溶解制成每1mL含0.1mg的溶液,作为对照品溶液。
并且,上述建立方法还包括通过以下步骤制备供试品溶液:取所述强肝药物成分1.0g~1.2g,置于锥形瓶中,加入70%体积分数甲醇水溶液100ml,超声提取1h,放冷,离心约10min,取上清液浓缩至约10ml,用25ml水溶解,置分液漏斗中,用水饱和正丁醇萃取3次,每次用量为30ml、20ml、20ml,合并3次萃取液,浓缩至干,用甲醇溶解转移至10ml容量瓶中,用0.45μm滤膜滤过,弃去初滤液,取续滤液即得。
具体而言,所述高效液相色谱法检测所述强肝药物成分包括以下步骤:
1)制备对照品溶液:取芍药苷对照品适量,加入甲醇溶解制成每1ml含0.1mg的溶液,作为对照品溶液;
2)制备供试品溶液:取所述强肝药物成分1.0g~1.2g,置于锥形瓶中,加入70%体积分数甲醇水溶液100ml,超声提取1h,放冷,离心约10min,取上清液浓缩至约10ml,用25ml水溶解,置分液漏斗中,用水饱和正丁醇萃取3次,每次用量为30ml、20ml、20ml,合并3次萃取液,浓缩至干,用甲醇溶解转移至10ml容量瓶中,用0.45μm滤膜滤过,弃去初滤液,取续滤液即得;
3)测定:精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪,根据以下色谱条件进行测定,得到指纹图谱:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料;
流动相:流动相A为乙腈,流动相B为0.05%体积分数磷酸水溶液,进行梯度洗脱;
流速:1.0mL/min;
柱温:30℃;
紫外检测波长:230nm。
所述梯度洗脱程序如下,其中流动相比例均为体积百分比:
0~15min,流动相A为0~10%,流动相B为100%~10%;
15~50min,流动相A为10%~30%,流动相B为90%~70%;
50~65min,流动相A为30%~60%,流动相B为70%~40%;
65~75min,流动相A为60%~100%,流动相B为40%~0%;
75~85min,流动相A为0%~100%,流动相B为100%~0%。
根据上述建立方法得到的指纹图谱中共有14个吸收峰,其中峰8为对照品芍药苷,各峰以峰8为参照峰计算相对保留时间和相对峰面积如下:
相对保留时间:
峰1:0.382~0.384;峰2:0.427~0.432;峰3:0.479~0.482;峰4:0.539~549;峰5:0.664~0.666;峰6:0.870~0.872;峰7:0.939~0.941;峰8:1.000;峰9:1.124~1.127;峰10:1.178~1.180;峰11:1.326~1.329;峰12:1.596~1.603;峰13:1.649~1.652;峰14:1.881~1.889;
相对峰面积:
峰1:0.15~0.23;峰2:0.59~0.71;峰3:0.71~1.20;峰4:0.21~0.34;峰5:0.21~0.34;峰6:0.94~1.12;7:0.34~0.40;峰8:1.00;峰9:0.24~0.28;峰10:0.37~0.49;峰11:0.55~1.07;峰12:0.80~1.16;峰13:0.62~0.83;峰14:0.11~0.13。
在所述指纹图谱的吸收峰中,单峰面积超过5%的吸收峰有8个:
峰2,平均保留时间RT为14.178min,RSD为0.41%;峰面积为1743.0,RSD为10.15%;
峰3,平均保留时间RT为15.812min,RSD为0.22%;峰面积为2869.8,RSD为21.26%;
峰6,平均保留时间RT为28.666min,RSD为0.07%;峰面积为2779.5,RSD为7.71%;
峰8,平均保留时间RT为32.911min,RSD为0.07%;峰面积为2711.4,RSD为9.01%;
峰10,平均保留时间RT为38.808min,RSD为0.05%;峰面积为1178.8,RSD为12.27%;
峰11,平均保留时间RT为43.705min,RSD为0.07%;峰面积为2053.1,RSD为19.04%;
峰12,平均保留时间RT为52.705min,RSD为0.14%;峰面积为2807.9,RSD为16.98%;
峰13,平均保留时间RT为54.32min,RSD为0.07%;峰面积为1933.0,RSD为16.00%。
并且,单峰面积超过10%的吸收峰有5个:
峰3,平均保留时间RT为15.812min,RSD为0.22%;峰面积为2869.8,RSD为21.26%;
峰6,平均保留时间RT为28.666min,RSD为0.07%;峰面积为2779.5,RSD为7.71%;
峰8,平均保留时间RT为32.911min,RSD为0.07%;峰面积为2711.4,RSD为9.01%;
峰12,平均保留时间RT为52.705min,RSD为0.14%;峰面积为2807.9,RSD为16.98%;
峰13,平均保留时间RT为54.32min,RSD为0.07%;峰面积为1933.0,RSD为16.00%。
其中,通过对所述强肝药物复方与全方药材的相关性研究,确认了所述强肝药物HPLC指纹图谱的14个共有特征峰的来源。其中对应于原料药,峰2、3、7、8、11归属于所述强肝药物中的白芍,峰5归属于茵陈,峰4、12、13归属于丹参,峰6归属于秦艽,峰9归属于黄芪,峰10、14归属于甘草;
并且,采用与对照品色谱图对比及高效液相色谱—质谱(HPLC-MS)法对色谱峰进行了指认,其中峰2为没食子酸,峰4为丹参素,峰6为龙胆苦苷,峰7为芍药内酯苷,峰8为芍药苷,峰9为毛蕊异黄酮苷,峰10为甘草苷,峰11为没食子酰芍药苷,峰12为丹酚酸B,峰14为甘草酸。
并且峰2为没食子酸,约在14min出峰;峰4为丹参素,约在17min出峰;峰6为龙胆苦苷,约在28min出峰;峰7为芍药内酯苷,约在30min出峰;峰8为芍药苷,约在32min出峰;峰9为毛蕊异黄酮苷,约在37min;峰10为甘草苷,约在38min出峰;峰11为没食子酰芍药苷,约在43min;峰12为丹酚酸B,约在52min出峰;峰14为甘草酸,约在61min出峰。
在检测待测产品强肝药物,如强肝胶囊的质量时,可以将待测产品的指纹图谱与上文所获得的标准指纹图谱进行比较,计算相似度,识别两者所具有的共同吸收峰的数量,以确定产品是否合格。
因此,在另一方面本发明还提供了一种检测强肝药物的方法,所述强肝药物由茵陈、板蓝根、当归、白芍、丹参、郁金、黄芪、党参、泽泻、黄精、地黄、山药、山楂、秦艽、甘草、六神曲组成,所述方法包括根据上述方法建立的待测样品指纹图谱并与根据上述方法建立的标准指纹图谱比较。
以下是本发明的详细描述。
色谱条件:由于本样品为大复方,药味多,成分复杂,故采用梯度洗脱的方式;根据各药味成分的特点先后尝试了甲醇-水、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液等流动相系统,并且尝试了多种不同梯度条件,经过对各种色谱图比较,最后确定乙腈-0.05%体积分数磷酸水溶液系统,采用梯度洗脱方式,得到的多个色谱峰有较好的分离效果。
供试品溶液采用二极管阵列检测器(DAD)在210~400nm波长范围内进行全梯度扫描,并对各波长下的色谱图进行分析比较。结果表明,在230nm波长处,各色谱峰分离良好,特征峰明显且峰型较好,从图谱中可以尽可能的获取色谱组分信息及反映整体系组成的全貌,因此选定230nm为指纹图谱测定波长,结果见附图1。通过对luna、Diamonsil钻石1代、Ameritech,菲罗门-ODS等C18色谱柱比较,最终确定用Diamonsil钻石1代C18(5μm,2.5×460mm);柱温:30℃;检测波长:230nm;流动相A为乙腈,流动相B为0.05%体积分数磷酸水溶液;洗脱方式:梯度洗脱:洗脱梯度程序为:0~15min,流动相A为0~10%,流动相B为100%~10%;15~50min流动相A为10%~30%,流动相B为90%~70%;50~65min流动相A为30%~60%,流动相B为70%~40%;65~75min流动相A为60%~100%,流动相B为40%~0%;75~85min流动相A为0%~100%,流动相B为100%~0%;并记录75分钟色谱图。流速:1.0ml/min。进样量10μL。
优选对照品溶液的制备方法为:取芍药苷对照品适量置25ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
优选供试品溶液的制备方法:通过多次的试验考察确定了本质量控制方法中供试品溶液的制备方法,试验比较了用50%体积分数乙醇水溶液、70%体积分数乙醇水溶液、50%体积分数甲醇水溶液、70%体积分数甲醇水溶液、甲醇做提取溶剂对指纹图谱的影响,确定用70%体积分数甲醇水溶液作溶剂效果佳,同时对超声和回流不同提取方法和不同提取时间做了比较。结果表明使用70%体积分数甲醇水溶液超声1h,所得色谱峰较多,峰面积较大。由于本品药味多,提取工艺为水煎,考虑到本品大分子物质较多,色谱柱负荷较大,因此本实验还对样品除杂处理方法进行了考察,考察用正丁醇和乙酸乙酯分别萃取3次,4次制备得到供试品溶液进行,结果表明,用水饱和正丁醇萃取3次色谱峰与用70%体积分数甲醇水溶液直接提取进样所得的色谱图相当。因此,优选条件为取本品内容物约1.0g, 精密称定,加入70%体积分数甲醇水溶液100ml,超声提取1h,放冷,离心约10min,取上清液浓缩至约20ml,用25ml水溶解,用水饱和正丁醇萃取3次,每次用量为30ml,20ml,20ml,合并3次萃取液,浓缩至干,用甲醇溶解转移至10ml容量瓶中,摇匀,过0.45μm微孔滤膜,取续滤液作为供试品溶液。
以芍药苷为参照峰的指纹图谱的制定:
精密吸取对照品溶液和供试品溶液,分别注入高效液相色谱仪,依据所得的图谱,制定标准指纹图谱。以上述方法作为待测定强肝胶囊样品中白芍、秦艽、丹参、茵陈、甘草和黄芪中一种或几种成分指纹图谱的测试手段,将待测定强肝胶囊样品指纹图谱与上述标准指纹图谱对比,计算相似度,应为0.90~1.00。
与现有技术相比,本发明提供的强肝药物指纹图谱的建立方法具有以下积极效果:
首先,本发明所涉及的强肝胶囊内容物为16味中药组成,各个药材所含化学成分复杂,对指纹图谱的制定造成干扰,导致各部分指纹图谱特征不稳定,所以必须严格控制流动相的色谱条件,才能得到良好的指纹图谱。也就是说,不是将药品中的秦艽、白芍和甘草、丹参、黄芪等部分药材或制剂的指纹图谱简单叠加就能得到药品的指纹图谱。实验证明,只有采用本发明经过大量实验所得到的切实可行的、特定的色谱条件,才能得到以该药物的组成成分秦艽、白芍、甘草、丹参、黄芪、茵陈等有效成分为主要特征的指纹图谱,从而实现了活性成分特征峰的有效分离和表征,从而得到了全面、清楚的指纹图谱。
其次,通过本发明的方法获得的指纹图谱能更全面、完善地表征药物的有效活性组分及其质量。该方法实现了对强肝胶囊最大可能的化学成分的全面检测,代表着强肝胶囊的主要药理活性,能有效地表征强肝胶囊的质量,有利于对活性成分的全面监控。所建立的指纹图谱可以用于质量控制,在保证产品的稳定均一的同时,确保产品的安全有效性。
并且,本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。在相同测试条件下,所提供的强肝胶囊内容物指纹图谱建立方法获取了强肝胶囊中以秦艽、白芍、甘草、丹参、黄芪、茵陈有效成分为特征的HPLC标准指纹图谱。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1为强肝药物(即强肝胶囊内容物)的HPLC-DAD三维色谱图;
图2为实施例3中10批强肝胶囊内容物供试品的指纹图谱叠加图;
图3为强肝胶囊内容物的HPLC对照指纹图谱;
图4至6分别为实施例4中试验的梯度洗脱条件1至3的HPLC图;
图7为实施例4中试验的不同检测波长下得到的HPLC图;
图8为实施例5中采用国家药品标准WS3-133(Z-133)-2002(Z)中色谱条件的流动相检测强肝胶囊得到的HPLC图;
图9至11分别为实施例6中强肝胶囊产品1、2和3内容物的HPLC色谱图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解,这些实施例仅用于说明本发明,其不以任何方式限制本发明的范围。
以下各实施例中所使用的对照品来源如下:
芍药苷,中国药品生物制品检定所,批号0736-9608。
以下各实施例中所使用的供试品强肝胶囊为本发明人与石家庄东方药业有限公司按照国家药品标准(新药转正标准)第35册WS3-133(Z-133)-2002(Z)制备,制备过程中充分注重了处方中各药材的产地属性、采收季节特征、工艺控制特征。制得的产品批号见下表1:
表1实施例中采用的强肝胶囊的批号
编号 | 批号 |
S1 | 20090301 |
S2 | 20090302 |
S3 | 20090303 |
S4 | 20090304 |
S5 | 20090305 |
S6 | 200+90306 |
S7 | 20090307 |
S8 | 20090308 |
S9 | 20090309 |
S10 | 20090310 |
S11 | 20090401 |
S12 | 20090402 |
S13 | 20090403 |
S14 | 20090404 |
S15 | 20090405 |
S16 | 20090406 |
S17 | 20090407 |
S18 | 20090408 |
S19 | 20090409 |
S20 | 20090410 |
S21 | 20090501 |
S22 | 20090502 |
S23 | 20090503 |
S24 | 20090504 |
S25 | 20090505 |
S26 | 20090506 |
S27 | 20090507 |
S28 | 20090508 |
S29 | 20090509 |
S30 | 20090510 |
S31 | 20090601 |
S32 | 20090602 |
S33 | 20090603 |
S34 | 20090604 |
S35 | 20090605 |
S36 | 20090606 |
S37 | 20090607 |
S38 | 20090608 |
S39 | 20090609 |
S40 | 20090610 |
S41 | 20090701 |
S42 | 20090702 |
其它仪器及试剂:
采用Agilent 1100液相色谱仪,包括四元泵,在线脱气装置,自动进样器,DAD检测器,柱温箱,Chemstation工作站;AB204-N电子天平(METTLER TOLEDO);超声仪:Autoscience AS3120;电热恒温水浴锅(江苏省医疗器械厂生产);旋转蒸发仪(瑞士BUCHi);METTLER TOLEDOPB303-N电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。
乙腈(色谱纯)购自天津康科德科技有限公司;磷酸(优级纯)购自天津市风船化学试剂科技有限公司;正丁醇(分析纯)购自天津市凯信化学工业有限公司;95%乙醇(分析纯)购自天津市凯信化学工业有限公司;甲醇(优级纯)购自天津康科德科技有限公司;天磁纯净水。
实施例1采用HPLC法建立强肝胶囊内容物的指纹图谱
对照品溶液的制备:精密称取芍药苷对照品2.54mg,置25ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得芍药苷对照品溶液(0.1016mg/mL)。
供试品溶液制备:称取强肝胶囊内容物1.0g,加入70%体积分数甲醇水溶液100ml,超声提取1h,放冷,离心约10min,取上清液浓缩至约10ml,用25ml水溶解,用水饱和正丁醇萃取3次,每次用量为30ml、20ml、20ml,合并3次萃取液,浓缩至干,用甲醇溶解转移至10ml容量瓶中,用0.45μm滤膜滤过,弃去初滤液,取续滤液即得,备用。
指纹图谱的测定:吸取上述芍药苷对照品溶液和强肝胶囊供试品溶液注入液相色谱仪,按照高效液相色谱法测定,得到强肝胶囊内容物HPLC标准指纹图谱,其中测定色谱条件包括:
色谱柱为Diamonsil C18(5μm,2.5×460mm)No 8037753,采用流动相A为乙腈,流动相B为0.05%体积分数磷酸水溶液,梯度洗脱程序见下表1;检测波长为230nm;柱温:30℃;流速:1.0ml/min,进样量10μL。
表1 HPLC梯度洗脱程序
实施例2指纹图谱建立方法的方法学考察
1)精密度试验
采用和实施例1相同的操作和条件,精密量取同一供试品溶液,连续进样5次,考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。以芍药苷为参照峰,计算其中各个色谱峰相对保留时间和相对峰面积。
结果表明,各个色谱峰相对保留时间的相对标准偏差RSD均低于0.5%,各个色谱峰相对峰面积的相对标准偏差RSD均低于3.9%,符合指纹图谱要求。
2)稳定性考察
采用和实施例1相同的操作和条件,制备供试品溶液,室温密闭放置,分别在0、3、6、9、12、24h进样分析,考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。以芍药苷为参照峰,计算其中14个色谱峰相对保留时间和相对峰面积。
结果表明,相对保留时间的相对标准偏差RSD均低于0.20%,相对峰面积的相对标准偏差RSD均低于3.00%。表明供试品溶液在24h内基本稳定。
3)重复性试验
采用和实施例1相同的操作和条件,取同一批号样品,制备供试品溶液5份,考察色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。
结果表明,计算其中14个色谱峰相对保留时间的相对标准偏差RSD均低于0.20%,相对峰面积的相对标准偏差RSD均低于3.00%,符合指纹图谱要求。
实施例3强肝胶囊内容物的对照指纹图谱的建立
按照实施例1所述方法对S1至S38批次强肝胶囊内容物进行分析测定,获得指纹图谱。
所获得指纹图谱中,共有化学成分吸收峰14个,其中单峰面积超过5%的吸收峰有8个,其特征如下:
2号峰,平均保留时间RT为14.178min,RSD为0.41%、峰面积为1743.0,RSD为10.15%;
3号峰,平均保留时间RT为15.812min,RSD为0.22%、峰面积为 2869.8,RSD为21.26%;
6号峰,平均保留时间RT为28.666min,RSD为0.07%、峰面积为2779.5,RSD为7.71%;
8号峰,平均保留时间RT为32.911min,RSD为0.07%、峰面积为2711.4,RSD为9.01%;
10号峰,平均保留时间RT为38.808min,RSD为0.05%、峰面积为1178.8,RSD为12.27%;
11号峰,平均保留时间RT为43.705min,RSD为0.07%、峰面积为2053.1,RSD为19.04%;
12号峰,平均保留时间RT为52.705min,RSD为0.14%、峰面积为2807.9,RSD为16.98%;
13号峰,平均保留时间RT为54.32min,RSD为0.07%、峰面积为1933.0,RSD为16.00%;
强肝胶囊与组成复方的各个全方药材相关性研究:采用HPLC法,照强肝胶囊指纹图谱测定方法获取强肝胶囊供试品、各个药材样品以及其阴性复方供试品的指纹图谱,利用色谱峰保留时间相对偏差指标考察其相关性,对强肝胶囊化学指纹图谱的峰归属进行分析;在此基础上,取没食子酸、芍药苷、丹参素、龙胆苦苷、芍药内酯苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、没食子酰芍药苷、丹酚酸B、甘草酸对照品,制备单一成分的对照品溶液,分别照强肝胶囊指纹图谱测定方法获取指纹图谱,利用相同成分色谱峰保留时间的一致性确定各成分;经分析比较确定14个峰为共有峰来源,其中以32min处芍药苷色谱峰为自身对照峰,2号峰没食子酸约在14min出峰;4号峰丹参素约在17min出峰;6号峰龙胆苦苷约在28min出峰;7号峰芍药内酯苷约在30min出峰;8号峰芍药苷约在32min出峰;9号峰毛蕊异黄酮苷约在37min出峰;10号峰甘草苷约在38min出峰;11号峰没食子酰芍药苷约在43min出峰;12号峰丹酚酸B约在52min出峰;14号峰甘草酸约在61min出峰。
用《中药色谱图的指纹谱评价系统》软件(2004A)进行色谱峰的匹配,计算了10批强肝胶囊内容物的相似度,评价结果见下表2。
表2 10批强肝胶囊内容物的相似度评价结果
这10批强肝胶囊内容物的HPLC色谱结果的叠加图见图2。
将这10批强肝胶囊内容物的HPLC色谱数据导入《中药色谱图的指纹谱评价系统》软件(2004A)中,进行色谱峰的匹配,软件自动生成强肝胶囊内容物的对照指纹图谱,见图3。
本发明提供的对照指纹图谱可以用于检测强肝药物(即强肝胶囊)的质量,可以计算待测样品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度,如相似度大于0.9以上,则为合格产品。
此外,取38个批次的强肝胶囊的内容物,按本发明的指纹图谱分析法进行分析,得到指纹图谱,不同批次样品的指纹图谱中确定有14个共有峰,以芍药苷所对应的色谱峰(8号峰)为参照峰,计算各个指纹图谱特征峰的相对值,结果分别见表2和表3。
表3 38批强肝胶囊内容物指纹图谱相对保留时间统计
编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 |
S1 | 0.383 | 0.428 | 0.479 | 0.546 | 0.665 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.178 | 1.327 | 1.594 | 1.650 | 1.880 |
S2 | 0.383 | 0.429 | 0.480 | 0.544 | 0.665 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.178 | 1.327 | 1.594 | 1.649 | 1.880 |
S3 | 0.383 | 0.429 | 0.480 | 0.546 | 0.665 | 0.872 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.178 | 1.328 | 1.596 | 1.651 | 1.878 |
S4 | 0.383 | 0.429 | 0.479 | 0.546 | 0.663 | 0.870 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.179 | 1.328 | 1.597 | 1.652 | 1.879 |
S5 | 0.383 | 0.429 | 0.480 | 0.546 | 0.665 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.178 | 1.328 | 1.595 | 1.650 | 1.879 |
S6 | 0.381 | 0.427 | 0.478 | 0.544 | 0.663 | 0.870 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.180 | 1.329 | 1.600 | 1.654 | 1.879 |
S7 | 0.382 | 0.428 | 0.478 | 0.545 | 0.664 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.179 | 1.327 | 1.595 | 1.650 | 1.878 |
S8 | 0.384 | 0.430 | 0.481 | 0.547 | 0.666 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.178 | 1.327 | 1.595 | 1.649 | 1.877 |
S9 | 0.384 | 0.430 | 0.481 | 0.547 | 0.666 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.179 | 1.328 | 1.594 | 1.649 | 1.877 |
S10 | 0.383 | 0.430 | 0.480 | 0.547 | 0.665 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.178 | 1.326 | 1.596 | 1.647 | 1.880 |
S11 | 0.383 | 0.430 | 0.480 | 0.547 | 0.666 | 0.871 | 0.941 | 1.000 | 1.125 | 1.178 | 1.326 | 1.597 | 1.648 | 1.882 |
S12 | 0.383 | 0.430 | 0.480 | 0.546 | 0.665 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.178 | 1.326 | 1.597 | 1.648 | 1.882 |
S13 | 0.383 | 0.429 | 0.479 | 0.546 | 0.665 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.179 | 1.327 | 1.599 | 1.649 | 1.882 |
S14 | 0.383 | 0.430 | 0.480 | 0.547 | 0.665 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.179 | 1.326 | 1.597 | 1.648 | 1.883 |
S15 | 0.383 | 0.430 | 0.480 | 0.546 | 0.666 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.179 | 1.327 | 1.600 | 1.650 | 1.883 |
S16 | 0.383 | 0.430 | 0.480 | 0.547 | 0.664 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.177 | 1.325 | 1.597 | 1.648 | 1.883 |
S17 | 0.383 | 0.430 | 0.480 | 0.546 | 0.665 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.178 | 1.326 | 1.598 | 1.648 | 1.883 |
S18 | 0.384 | 0.431 | 0.481 | 0.548 | 0.666 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.179 | 1.329 | 1.603 | 1.651 | 1.885 |
S20 | 0.384 | 0.431 | 0.481 | 0.548 | 0.665 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.179 | 1.327 | 1.601 | 1.651 | 1.885 |
S21 | 0.383 | 0.430 | 0.481 | 0.548 | 0.666 | 0.870 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.180 | 1.327 | 1.601 | 1.651 | 1.884 |
S21 | 0.383 | 0.430 | 0.480 | 0.546 | 0.664 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.180 | 1.329 | 1.604 | 1.652 | 1.884 |
S22 | 0.383 | 0.431 | 0.480 | 0.547 | 0.664 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.180 | 1.328 | 1.603 | 1.651 | 1.883 |
S23 | 0.383 | 0.431 | 0.481 | 0.546 | 0.665 | 0.872 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.180 | 1.329 | 1.602 | 1.650 | 1.884 |
S24 | 0.384 | 0.432 | 0.482 | 0.549 | 0.666 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.179 | 1.328 | 1.601 | 1.649 | 1.881 |
S25 | 0.384 | 0.432 | 0.479 | 0.539 | 0.664 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.124 | 1.179 | 1.328 | 1.602 | 1.650 | 1.881 |
S26 | 0.385 | 0.433 | 0.482 | 0.549 | 0.667 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.179 | 1.328 | 1.603 | 1.651 | 1.884 |
S27 | 0.384 | 0.432 | 0.481 | 0.548 | 0.666 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.179 | 1.328 | 1.601 | 1.649 | 1.883 |
S28 | 0.383 | 0.432 | 0.481 | 0.547 | 0.664 | 0.870 | 0.939 | 1.000 | 1.126 | 1.181 | 1.330 | 1.604 | 1.652 | 1.885 |
S29 | 0.383 | 0.432 | 0.481 | 0.549 | 0.666 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.180 | 1.329 | 1.603 | 1.651 | 1.883 |
S30 | 0.382 | 0.431 | 0.480 | 0.547 | 0.664 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.125 | 1.180 | 1.328 | 1.604 | 1.652 | 1.885 |
S31 | 0.383 | 0.428 | 0.480 | 0.545 | 0.664 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.178 | 1.324 | 1.596 | 1.647 | 1.889 |
S32 | 0.382 | 0.427 | 0.479 | 0.544 | 0.664 | 0.870 | 0.940 | 1.000 | 1.127 | 1.179 | 1.326 | 1.601 | 1.652 | 1.889 |
S33 | 0.382 | 0.427 | 0.479 | 0.544 | 0.664 | 0.870 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.178 | 1.326 | 1.602 | 1.652 | 1.888 |
S34 | 0.383 | 0.429 | 0.480 | 0.545 | 0.664 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.179 | 1.327 | 1.602 | 1.653 | 1.888 |
S35 | 0.383 | 0.429 | 0.479 | 0.545 | 0.664 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.179 | 1.327 | 1.603 | 1.653 | 1.886 |
S36 | 0.383 | 0.429 | 0.480 | 0.545 | 0.664 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.180 | 1.326 | 1.599 | 1.650 | 1.885 |
S37 | 0.383 | 0.429 | 0.480 | 0.546 | 0.665 | 0.871 | 0.940 | 1.000 | 1.126 | 1.180 | 1.327 | 1.600 | 1.650 | 1.884 |
S38 | 0.383 | 0.429 | 0.480 | 0.546 | 0.664 | 0.870 | 0.939 | 1.000 | 1.126 | 1.179 | 1.327 | 1.601 | 1.651 | 1.883 |
表4 38批强肝胶囊内容物指纹图谱的相对峰面积统计
峰号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 |
时间 | 12.604 | 14.145 | 15.794 | 17.965 | 21.875 | 28.657 | 30.928 | 32.903 | 37.036 | 38.789 | 43.668 | 52.622 | 54.305 | 61.943 |
1 | 0.177 | 0.617 | 0.850 | 0.242 | 0.227 | 1.031 | 0.363 | 1.000 | 0.246 | 0.436 | 0.546 | 0.981 | 0.783 | 0.119 |
2 | 0.194 | 0.675 | 0.862 | 0.277 | 0.227 | 1.023 | 0.365 | 1.000 | 0.248 | 0.444 | 0.794 | 0.879 | 0.931 | 0.128 |
3 | 0.137 | 0.526 | 0.850 | 0.147 | 0.183 | 0.813 | 0.370 | 1.000 | 0.207 | 0.365 | 0.587 | 0.690 | 0.536 | 0.098 |
4 | 0.123 | 0.558 | 0.826 | 0.159 | 0.192 | 0.823 | 0.393 | 1.000 | 0.216 | 0.380 | 0.557 | 0.825 | 0.456 | 0.105 |
5 | 0.109 | 0.546 | 0.542 | 0.203 | 0.201 | 0.837 | 0.370 | 1.000 | 0.171 | 0.266 | 0.595 | 0.956 | 0.630 | 0.078 |
6 | 0.152 | 0.684 | 1.673 | 0.189 | 0.210 | 0.773 | 0.451 | 1.000 | 0.116 | 0.468 | 0.425 | 0.786 | 0.497 | 0.119* |
7 | 0.160 | 0.528 | 0.741 | 0.187 | 0.203 | 0.877 | 0.380 | 1.000 | 0.174 | 0.537 | 0.471 | 0.695 | 0.480 | 0.112 |
8 | 0.111 | 0.504 | 0.387 | 0.205 | 0.162 | 0.889 | 0.408 | 1.000 | 0.136 | 0.131 | 0.496 | 1.269 | 0.797 | 0.136 |
9 | 0.081 | 0.481 | 0.167 | 0.153 | 0.189 | 0.711 | 0.379 | 1.000 | 0.221 | 0.224 | 0.337 | 1.218 | 0.574 | 0.181 |
10 | 0.128 | 0.588 | 0.412 | 0.260 | 0.224 | 0.876 | 0.432 | 1.000 | 0.171 | 0.240 | 0.539 | 1.564 | 0.630 | 0.198 |
11 | 0.146 | 0.657 | 0.487 | 0.272 | 0.188 | 0.835 | 0.410 | 1.000 | 0.198 | 0.290 | 0.526 | 1.168 | 0.775 | 0.195 |
12 | 0.137 | 0.497 | 0.188 | 0.233 | 0.265 | 0.924 | 0.404 | 1.000 | 0.193 | 0.271 | 0.748 | 1.742 | 0.450 | 0.220 |
13 | 0.162 | 0.655 | 0.724 | 0.197 | 0.254 | 1.019 | 0.354 | 1.000 | 0.281 | 0.519 | 0.735 | 0.863 | 0.556 | 0.118 |
14 | 0.155 | 0.573 | 0.946 | 0.200 | 0.213 | 0.915 | 0.357 | 1.000 | 0.241 | 0.394 | 0.772 | 0.947 | 0.608 | 0.116 |
15 | 0.202 | 0.594 | 1.425 | 0.253 | 0.245 | 0.989 | 0.383 | 1.000 | 0.255 | 0.406 | 0.832 | 0.932 | 0.648 | 0.123 |
16 | 0.137 | 0.598 | 0.510 | 0.214 | 0.234 | 0.917 | 0.343 | 1.000 | 0.267 | 0.448 | 0.664 | 1.010 | 0.750 | 0.110 |
17 | 0.121 | 0.544 | 0.591 | 0.195 | 0.212 | 0.894 | 0.346 | 1.000 | 0.230 | 0.405 | 0.875 | 0.941 | 0.744 | 0.101 |
18 | 0.173 | 0.563 | 1.220 | 0.220 | 0.264 | 0.998 | 0.363 | 1.000 | 0.257 | 0.423 | 0.795 | 0.816 | 0.622 | 0.113 |
19 | 0.130 | 0.550 | 0.834 | 0.138 | 0.189 | 0.813 | 0.377 | 1.000 | 0.222 | 0.419 | 0.665 | 0.625 | 0.4845 | 0.104 |
20 | 0.220 | 0.593 | 1.201 | 0.297 | 0.333 | 1.105 | 0.370 | 1.000 | 0.263 | 0.435 | 0.911 | 0.910 | 0.668 | 0.113 |
21 | 0.183 | 0.623 | 0.963 | 0.210 | 0.289 | 1.029 | 0.339 | 1.000 | 0.264 | 0.488 | 0.729 | 0.798 | 0.623 | 0.117 |
22 | 0.212 | 0.706 | 1.308 | 0.273 | 0.259 | 1.038 | 0.384 | 1.000 | 0.282 | 0.451 | 0.914 | 1.076 | 0.794 | 0.134 |
23 | 0.170 | 0.657 | 0.707 | 0.230 | 0.223 | 0.948 | 0.342 | 1.000 | 0.277 | 0.461 | 0.678 | 0.976 | 0.788 | 0.116 |
24 | 0.152 | 0.617 | 0.806 | 0.237 | 0.252 | 0.992 | 0.358 | 1.000 | 0.261 | 0.434 | 0.692 | 1.103 | 0.767 | 0.111 |
25 | 0.229 | 0.647 | 1.405 | 0.285 | 0.341 | 1.074 | 0.394 | 1.000 | 0.239 | 0.398 | 1.068 | 1.028 | 0.659 | 0.105 |
26 | 0.224 | 0.663 | 1.510 | 0.317 | 0.342 | 1.001 | 0.401 | 1.000 | 0.261 | 0.402 | 0.691 | 1.165 | 0.599 | 0.117 |
27 | 0.185 | 0.699 | 0.927 | 0.267 | 0.267 | 0.119 | 0.379 | 1.000 | 0.281 | 0.470 | 0.764 | 1.298 | 0.825 | 0.130 |
28 | 0.196 | 0.642 | 1.227 | 0.255 | 0.236 | 1.000 | 0.375 | 1.000 | 0.250 | 0.404 | 0.721 | 1.103 | 0.632 | 0.122 |
29 | 0.157 | 0.619 | 0.730 | 0.226 | 0.239 | 0.974 | 0.360 | 1.000 | 0.264 | 0.426 | 0.518 | 1.139 | 0.708 | 0.116 |
30 | 0.186 | 0.585 | 1.035 | 0.228 | 0.321 | 1.109 | 0.3614 | 1.000 | 0.277 | 0.500 | 0.526 | 0.890 | 0.550 | 0.112 |
31 | 0.149 | 0.594 | 0.653 | 0.203 | 0.193 | 0.931 | 0.335 | 1.000 | 0.245 | 0.383 | 0.578 | 0.965 | 0.766 | 0.111 |
32 | 0.179 | 0.610 | 1.033 | 0.233 | 0.210 | 0.940 | 0.386 | 1.000 | 0.240 | 0.372 | 0.616 | 1.008 | 0.616 | 0.117 |
33 | 0.175 | 0.597 | 1.522 | 0.213 | 0.179 | 0.881 | 0.345 | 1.000 | 0.247 | 0.394 | 0.753 | 0.978 | 0.638 | 0.128 |
34 | 0.156 | 0.591 | 0.930 | 0.215 | 0.214 | 0.925 | 0.349 | 1.000 | 0.246 | 0.392 | 0.589 | 1.024 | 0.623 | 0.121 |
35 | 0.163 | 0.599 | 0.797 | 0.232 | 0.235 | 0.942 | 0.342 | 1.000 | 0.257 | 0.408 | 0.603 | 1.044 | 0.684 | 0.116 |
36 | 0.154 | 0.498 | 0.766 | 0.207 | 0.263 | 0.891 | 0.353 | 1.000 | 0.188 | 0.546 | 0.575 | 0.881 | 0.508 | 0.104 |
37 | 0.136 | 0.568 | 0.627 | 0.157 | 0.210 | 0.847 | 0.378 | 1.000 | 0.221 | 0.394 | 0.668 | 0.706 | 0.422 | 0.102 |
38 | 0.170 | 0.816 | 1.095 | 0.234 | 0.303 | 1.175 | 0.564 | 1.000 | 0.230 | 0.769 | 0.501 | 0.945 | 0.673 | 0.143 |
实施例4色谱条件的选择和优化
由于强肝药物(强肝胶囊)为大复方,药味多,成分复杂,在确定本发明的色谱条件之前,进行了多次比较实验。主要包括:
1.梯度洗脱条件
根据各药味成分的特点先后尝试了甲醇-水、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液等流动相系统。在确定以乙腈-0.05%体积分数磷酸水溶液作为洗脱流动相之后,在其它处理和本发明的方法完全相同的情况下,尝试了多种不同梯度洗脱条件,例如:
梯度洗脱条件1:乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B),0~30min,10%~30%A;30~35min,30%~10%A;35~40min,10%~10%A;色谱图见图4;
梯度洗脱条件2:乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)0~15min,0~90%A;15~30min,10%~20%A;30~50min,20%~70%A;50~70min,70%~100%A;70~80min,100%~0A,色谱图见图5;
梯度洗脱条件3:乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)0~10min,0~10%A;10~30min,10%~35%A;30~60min,35%~70%A;60~70min,70%~100%A;70~80min,100%~0A;色谱图见图6。
经过对各种色谱图比较,发现在其他梯度洗脱条件下,均不能很好的表征强肝药物(强肝胶囊)成分各特征峰,也因此不能从整体上有效地表征中药的内在质量;而采用本发明的色谱梯度洗脱条件对药物各特征峰有良好的分离效果,其色谱洗脱条件要优于其它条件。
2.检测波长
在选定的流动相洗脱条件下,在其它处理和本发明的方法完全相同的情况下,对220nm、230nm、254nm、280nm、320nm等不同的波长处的色谱图进行了对比,结果见图7(A:检测波长280nm;B:检测波长220nm;C:检测波长254nm)。结果证明本发明条件所测得的指纹图谱所表征的成分峰最多,峰形清晰且有较好的分离度。
实施例5与强肝胶囊国家药品标准检测方法的比较
国家食品和药品监督管理局的国家药品标准WS3-133(Z-133)-2002(Z)公布了对强肝胶囊的含量测定方法,其中为采用高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。
采用该国家标准的色谱条件的流动相乙腈-水(15∶85)对强肝胶囊内容物进行了测定,获得色谱图见图8。该图表明采用国家标准的条件仅能表征色谱峰1、2、3三个成分,因此不能从整体上有效地表征中药强肝胶囊的内在质量,而在本发明的色谱条件下可获得14个以上的成分色谱峰,能更好的表征强肝胶囊复方的物质基础多样性与复杂性。
此外,国家药品标准中供试品制备方法为甲醇超声处理,调pH值=9~10,后,用正丁醇-三氯甲烷(1∶1)萃取,该方法调pH后会使一部分成分如有机酸,黄酮类成分、丹参酚酸类成分发生改变,溶于水中,不利于有机溶剂的萃取;采用乙酸乙酯溶剂萃取仅能提取脂溶性强的成分,对一些极性大的成分如龙胆苦苷、芍药苷会提取不完全。而采用本发明的供试品溶液的制备能够尽可能地使本品的物质基础成分提取完全,从而能更好从整体上有效地表征中药成分的内在质量。
实施例6指纹图谱与药效的相关性分析
采用盐酸四环素致小鼠脂肪肝、四氯化碳致大鼠肝纤维化实验模型,进行生化测定及组织病理学检查。
1实验材料
1.1药物:
强肝胶囊产品1:棕色粉末,样品S40。
强肝胶囊产品2:棕色粉末,样品S41。
强肝胶囊产品3:棕色粉末,样品S42。
盐酸四环素:天津市光复精细化工研究所,批号20100710。
水飞蓟宾胶囊:35mg/粒,批号100511,天津天士力制药股份有限公司。
复方蛋氨酸胆碱片(东宝甘泰):批号100110,通化东宝药业股份有限公司。
水飞蓟素胶囊(利加隆):德国马博士大药厂,140mg/粒,批号B0901894。
复方鳖甲软肝片(简称复方鳖甲):内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司,0.5g/片,批号20100613。
1.2试剂:
甘油三酯试剂盒(酶法):北京北化康泰临床试剂有限公司,批号 20100728。
总胆固醇试剂盒(酶法):北京北化康泰临床试剂有限公司,批号20100907。
超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒:批号20101230。
丙二醛试剂盒:批号20101230。
谷丙转氨酶(ALT/GPT)试剂盒:批号20101215。
谷草转氨酶(AST/GOT)试剂盒:批号20101213。
总胆红素试剂盒:批号20101217。
蛋白定量试剂盒(双缩脲法):批号20101110。
白蛋白(溴甲酚绿比色法)试剂盒:批号20101208。
羟脯氨酸试剂盒:批号20101216。
以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
HA(透明质酸)试剂盒:批号101025,购自天津灏洋生物制品科技有限公司。
LN(层粘连蛋白)试剂盒:批号101025,购自天津灏洋生物制品科技有限公司。
橄榄油:化学纯,批号F20100512,国药集团化学试剂有限公司。
四氯化碳:分析纯,批号20100804,天津市凯信化学工业有限公司。
1.3仪器:
TU-1810紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司产品。酶标仪:B10-RAD 550model USA。
1.4动物:
昆明种小鼠、Wistar种大鼠:均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号:scxk(京)2006-0009。
2样品指纹图谱分析
采用本发明的指纹图谱分析法对3个强肝胶囊产品进行指纹图谱分析,结果分别见图9~11。此外,图谱中色谱峰情况和总峰面积见表5。
表5强肝胶囊产品1、2和3内容物的指纹图谱数据分析
产品1 | 产品2 | 产品3 | |
色谱峰个数 | 14 | 14 | 10 |
总峰面积值 | 17609.4 | 19040.2 | 7328.7 |
5-14个峰面积值 | 15246.6 | 14697.4 | 7003.5 |
峰号 | 1-14号 | 1-14号 | 2、5-14号 |
3药效试验方法
3.1强肝胶囊对盐酸四环素致小鼠脂肪肝的防治作用
参照文献(孙创斌等,去脂软肝丸对四环素致小鼠脂肪肝模型肝脂的影响,云南中医学院学报,2002;25(1):8-10)方法,选用昆明种小鼠,体重22-25g。按体重随机分为11组,每组10只,均雌雄各半。给药组分强肝胶囊(S40)2、4g生药/kg剂量组、强肝胶囊(S41)2、4g生药/kg剂量组、强肝胶囊(S42)2、4g生药/kg剂量组、阳性药东宝肝泰4.68片/kg及水飞蓟宾胶囊100mg/kg剂量组,采用灌胃给药,灌胃容积均为0.2ml/10g体重。正常对照组及模型对照组均灌胃给予等容量0.5%CMC,每天一次,连续10天。给药第8天除正常对照组外均腹腔注射盐酸四环素(213mg/kg,0.2ml/10g体重),每天1次,连续3次。末次灌胃及注射给药后1小时,眼眶取血,测定血清总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)。脱臼处死,取肝脏称重,计算肝脏系数(肝重/10g体重)。取肝组织约200mg,用乙醇∶丙酮(1∶1)混合液2ml匀浆,测定肝脏总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)含量,结果采用t-值法进行统计分析。另取部分肝组织,用10%福尔马林固定,HE染色,在光镜下进行组织病理学检查。肝损伤分级如下:
-肝组织未见著变
+肝细胞肿胀,胞浆疏松,个别肝细胞见空泡变性
++肝细胞肿胀,胞浆疏松,少量肝细胞见空泡变性
+++肝细胞肿胀,胞浆疏松,肝细胞见空泡变性≯1/2视野
++++肝细胞肿胀,胞浆疏松明显,肝细胞空泡变性>1/2视野
3.2强肝胶囊对四氯化碳所致大鼠肝纤维化的防治作用
参照文献(彭小东等,四氯化碳皮下注射构建大鼠肝纤维化模型的研究,江西医学院学报,2005年第45卷第2期5-11)方法,选用雄性Wistar大鼠,体重100-130g,按体重随机分为11组,给药组分强肝胶囊(S40)1、2g生药/kg剂量组、强肝胶囊(S41)1、2g生药/kg剂量组、强肝胶囊(S42)1、2g生药/kg剂量组、阳性药复方鳖甲软肝片2g药粉/kg及水飞蓟素胶囊75mg/kg剂量组,采用灌胃给药,灌胃容积均为1ml/100g体重。正常对照组及模型对照组均灌胃给予等容量0.5%CMC,每天一次,连续 8周。除正常对照组外,其余各组大鼠均在给药的同时,皮下注射四氯化碳(以橄榄油配成50%,0.3ml/100g体重),每周2次,连续8周。末次灌胃给药后1小时,眼眶取血,测定血清ALT、AST、TBIL、ALB、TP及羟脯氨酸含量,酶免法测定血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)含量,结果采用t-值法进行统计分析。另取部分肝组织,用10%福尔马林固定,HE染色,在光镜下进行病理组织学检查。肝纤维化分级如下:
-肝组织未见著变
+仅见少量肝细胞空泡变性
++肝细胞空泡变性<视野的1/2,纤维组织增生不明显
+++肝细胞空泡变性>视野的1/2,纤维组织有增生并有假小叶形成的趋势。
++++肝细胞空泡变性>视野的2/3,纤维组织增生明显并有假小叶形成。
4试验结果
通过给上述动物模型施用供试品强肝胶囊的产品1(S40)、产品2(S41)、产品3(S42),发现强肝胶囊对小鼠脂肪肝、大鼠肝纤维化均有明显的防治作用,以产品1作用最佳,结果见下表6和表7:
表6强肝胶囊产品1、2和3(4g生药量)对四环素致小鼠脂肪肝生化指标的影响
#P<0.05##P<0.01(与正常对照组比较)
*P<0.05**P<0.01(与模型对照组比较
表7强肝胶囊产品1、2和3(2g生药量)对四氯化碳肝纤维化的影响
名称 | 肝系数 | 总胆红素 | 羟脯氨酸 | 透明质酸 |
(肝重/100g) | (umol/L) | (ug/ml) | (ng/ml) | |
正常 | 3.17 | 6.59 | 37.6 | 32.32 |
模型 | 5.57## | 8.91 | 48.61 | 53.84## |
产品1 | 3.9** | 6.84* | 37.50* | 35.11** |
产品2 | 4.36* | 7.05* | 38.28* | 36.70* |
产品3 | 4.78 | 7.23 | 48.96 | 47.59 |
正常 | 3.17 | 6.59 | 37.6 | 32.32 |
#:P<0.05##:P<0.01(与正常对照组比较)
*:P<0.05**:P<0.01(与模型对照组比较)
三种样品的指纹图谱分析表明,三种样品虽然生药量相同,但其指纹特征峰的个数、峰面积总值均有一定的差异;产品1和产品2之间的各个参数相差不明显,药效结果虽然有一定的差异,但未见明显的差异;而产品3与前两种样品的指纹图谱各个数据值差异明显,药效结果也表现出明显的差异性。因此说明本发明建立的指纹图谱能够用于帮助控制强肝药物的质量。
综上所述,建立以秦艽、白芍、甘草、丹参、黄芪、茵陈等有效成分为特征峰的指纹图谱质量控制方法,可以有效的表征本品的质量,特征峰强弱,直接影响着其药理作用,特征峰强,则药理作用强,特征峰弱则其药理作用弱,因此说明该指纹图谱不仅能有效地表征强肝胶囊的内在质量,而且可用于表征中药组合物强肝胶囊的药理活性,在保证产品的稳定均一的同时,确保产品的安全有效性。
对于本领域技术人员而言,根据本发明所公开的技术内容,本领域技术人员将很清楚本发明的其它实施方案,本发明实施例仅作为示例。在不违反本发明主旨及范围的情况下,可对本发明进行各种改变和改进。例如,使用不同的检测仪器所获得的测定结果可能有所不同,但只要使用本发明所述的质量控制方法,均在本发明保护范围之内。
Claims (6)
1.一种强肝药物指纹图谱的建立方法,所述强肝药物由茵陈、板蓝根、当归、白芍、丹参、郁金、黄芪、党参、泽泻、黄精、地黄、山药、山楂、秦艽、甘草、六神曲组成,所述建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述强肝药物成分,其中,所述高效液相色谱法的条件包括:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料;
流动相:流动相A为乙腈,流动相B为0.05%体积分数磷酸水溶液,进行梯度洗脱,
所述梯度洗脱程序如下,其中流动相比例均为体积百分比:
0min,流动相A为0,流动相B为100%;
15min,流动相A为10%,流动相B为90%;
50min,流动相A为30%,流动相B为70%;
65min,流动相A为60%,流动相B为40%;
75min,流动相A为100%,流动相B为0;
80min,流动相A为0,流动相B为100%;
所述高效液相色谱法的条件还包括:
流速:1.0mL/min;
柱温:30℃;
检测波长:230nm;
理论塔板数按芍药苷峰计算,应不低于6000;并且
所述高效液相色谱法检测所述强肝药物成分包括以下步骤:
1)制备对照品溶液:取芍药苷对照品适量,加入甲醇溶解制成每1ml含0.1mg的溶液,作为对照品溶液;
2)制备供试品溶液:取所述强肝药物成分1.0~1.2g,置于锥形瓶中,加入70%体积分数甲醇水溶液100ml,超声提取1h,放冷,离心约10min,取上清液浓缩至约10ml,用25ml水溶解,置分液漏斗中,用水饱和正丁醇萃取3次,每次用量为30ml、20ml、20ml,合并3次萃取液,浓缩至干,用甲醇溶解转移至10ml容量瓶中,用0.45μm滤膜滤过,弃去初滤液,取续滤液即得;
3)测定:精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪,根据所述高效液相色谱法的色谱条件进行测定,得到指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,所述建立方法得到的指纹图谱中共有14个吸收峰,其中峰8为对照品芍药苷,各峰以峰8为参照峰的相对保留时间和相对峰面积如下:
相对保留时间:
峰1:0.382~0.384;峰2:0.427~0.432;峰3:0.479~0.482;峰4:0.539~549;峰5:0.664~0.666;峰6:0.870~0.872;峰7:0.939~0.941;峰8:1.000;峰9:1.124~1.127;峰10:1.178~1.180;峰11:1.326~1.329;峰12:1.596~1.603;峰13:1.649~1.652;峰14:1.881~1.889;
相对峰面积:
峰1:0.15~0.23;峰2:0.59~0.71;峰3:0.71~1.20;峰4:0.21~0.34;峰5:0.21~0.34;峰6:0.94~1.12;7:0.34~0.40;峰8:1.00;峰9:0.24~0.28;峰10:0.37~0.49;峰11:0.55~1.07;峰12:0.80~1.16;峰13:0.62~0.83;峰14:0.11~0.13。
3.根据权利要求1或2所述的建立方法,其特征在于,所述指纹图谱的吸收峰中,单峰面积超过5%的吸收峰有8个:
峰2,平均保留时间RT为14.178min,RSD为0.41%,峰面积为1743.0,RSD为10.15%;
峰3,平均保留时间RT为15.812min,RSD为0.22%,峰面积为2869.8,RSD为21.26%;
峰6,平均保留时间RT为28.666min,RSD为0.07%,峰面积为2779.5,RSD为7.71%;
峰8,平均保留时间RT为32.911min,RSD为0.07%,峰面积为2711.4,RSD为9.01%;
峰10,平均保留时间RT为38.808min,RSD为0.05%,峰面积为1178.8,RSD为12.27%;
峰11,平均保留时间RT为43.705min,RSD为0.07%,峰面积为2053.1,RSD为19.04%;
峰12,平均保留时间RT为52.705min,RSD为0.14%,峰面积为2807.9,RSD为16.98%;
峰13,平均保留时间RT为54.32min,RSD为0.07%,峰面积为1933.0,RSD为16.00%。
4.根据权利要求1或2所述的建立方法,其特征在于所述指纹图谱的吸收峰中,单峰面积超过10%的吸收峰有5个:
峰3,平均保留时间RT为15.812min,RSD为0.22%,峰面积为2869.8,RSD为21.26%;
峰6,平均保留时间RT为28.666min,RSD为0.07%,峰面积为2779.5,RSD为7.71%;
峰8,平均保留时间RT为32.911min,RSD为0.07%,峰面积为2711.4,RSD为9.01%;
峰12,平均保留时间RT为52.705min,RSD为0.14%,峰面积为2807.9,RSD为16.98%;
峰13,平均保留时间RT为54.32min,RSD为0.07%,峰面积为1933.0,RSD为16.00%。
5.根据权利要求2所述的建立方法,其特征在于,所述指纹图谱的吸收峰中,峰2、3、7、8、11归属于所述强肝药物中的白芍,峰5归属于茵陈,峰4、12、13归属于丹参,峰6归属于秦艽,峰9归属于黄芪,峰10、14归属于甘草;
并且,其中峰2为没食子酸,峰4为丹参素,峰6为龙胆苦苷,峰7为芍药内酯苷,峰8为芍药苷,峰9为毛蕊异黄酮苷,峰10为甘草苷,峰11为没食子酰芍药苷,峰12为丹酚酸B,峰14为甘草酸。
6.一种检测强肝药物的方法,所述强肝药物由茵陈、板蓝根、当归、白芍、丹参、郁金、黄芪、党参、泽泻、黄精、地黄、山药、山楂、秦艽、甘草、六神曲组成,所述方法包括根据权利要求1至5中任一项所述方法建立待测样品指纹图谱并与根据所述方法建立的标准指纹图谱比较。
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