CN102818861B - 一种清毒安肾胶囊的指纹图谱建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及以天然植物药材原料制成的清毒安肾胶囊的质量控制方法，包括以下步骤：制备混合对照品溶液；制备清毒安肾胶囊甲醇溶液作为供试品溶液；采用高效液相色谱梯度洗脱法，检测比较其高效液相色谱的指纹图谱特征峰。本发明所构建的指纹图谱利用203nm、260nm双波长检测，检出34个共有色谱峰，涵盖清毒安肾胶囊中黄芪、淫羊藿、大黄、当归、川芎、白芍、地黄、三七、泽泻九味药材；并采用RRLC/MS/MS及HPLC-PDA确证和指认了指纹图谱中20个化学成分。本发明的检测方法可以全面监控原料药材、半成品和成品的质量，通过色谱指纹特征相似程度的比较，对其进行质量控制和防伪，实用性突出。
Description
技术领域
本发明涉及一种清毒安肾胶囊的质量控制方法及应用，具体是一种通过构建指纹图谱的清毒安肾胶囊的质量控制方法及应用，属于药物分析技术领域。
背景技术
中药复方是中医用药的主流，其特征包括：组成复方的药味具有一定的主次关系；复方内部的不同药味组合间的有机配合关系形成了复方整体综合的治疗特征。长久以来复方的物质基础基本处于一种模糊的状态；复方的质量优劣难以以明确的指标进行评价；复方的质量不稳定，直接引起了治疗效果的不稳定。中药指纹图谱的研究和建立正是为了解决中药质量控制和监督这一关键问题而采取的一种方法，它从药材的生产、加工、贮存及制剂的原料、中间品、成品等各个角度和方面，进行中药样品分析，通过相似性和相关性对比，发现质量变异和缺陷，从而全面、特异地把握住中药制剂的质量命脉。
清毒安肾胶囊是中药复方制剂，由黄芪、淫羊藿、大黄(酒制)、当归、川芎、白芍、地黄、三七、茯苓、泽泻十味药材组成，诸药合用，起健脾益肾、通腑降浊、活血化瘀功效，用于治疗慢性肾功能衰竭、肾功能不全代偿期、氮质血症期和尿毒症早期。其处方专利已获国家知识产权局授权，专利号为：20031011934.2。原质量标准【鉴别】项下采用薄层色谱法对处方中的黄芪、淫羊藿、白芍、大黄、当归、川芎、三七7味药材进行鉴别，【含量测定】项下采用高效液相色谱法分别测定君药淫羊藿中淫羊藿苷以及佐药白芍中芍药苷的含量，其不足之处在于：
1、【鉴别】项使用了6个薄层色谱鉴别，【含量测定】项使用了2种液相色谱条件分别测定淫羊藿中淫羊藿苷以及白芍中芍药苷的含量，操作繁琐，未测君药黄芪的含量。
2、复方制剂是多味中药联用，现行的单一测定方法给出信息少，无法全面、准确地评价中药制剂质量。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的不足之处，通过对清毒安肾胶囊 HPLC指纹图谱的研究，提供一种有效可靠的清毒安肾胶囊的质量控制方法及应用。
本发明采用HPLC非线性洗脱在一个流动相系统利用不同检测波长，同时检出复方中的八味药材成分，建立的指纹图谱可以全面监控原料药材、半成品和成品的质量，通过色谱指纹特征相似程度的比较，评价优劣、考察稳定性和一致性，弥补了原质量控制方法的不足。
本发明通过以下技术方案实现上述目的，一种清毒安肾胶囊的质量控制方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取清毒安肾胶囊0.1g～10.0g，用甲醇提取，滤过，取滤液适量，净化，用甲醇配成清毒安肾胶囊供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密称取毛蕊异黄酮苷、淫羊藿苷、大黄酚、阿魏酸、芍药苷、人参皂苷Rg1适量，加甲醇使溶解，制成混合对照品溶液：毛蕊异黄酮苷、淫羊藿苷、大黄酚、阿魏酸、芍药苷的浓度为0.1mg/ml，人参皂苷Rg1的浓度为0.2mg/ml。
(3)采用高效液相色谱法分析上述供试品溶液和对照品溶液，色谱条件为：进样量10～30μ1；色谱柱为ODS C18，3μm；流动相为用磷酸或甲酸或冰醋酸调至pH为2.4的水-乙腈，梯度洗脱；柱温：30℃；检测波长：203nm、260nm；得到清毒安肾胶囊高效液相色谱指纹图谱；
所述梯度洗脱步骤为：0～10分钟，流动相乙腈∶水由2∶98渐变为18∶82；10～20分钟，流动相乙腈∶水为18∶82；20～55分钟，流动相乙腈∶水由18∶82渐变为30∶70；55～90分钟，流动相乙腈∶水由30∶70渐变为88∶12。
上述质量控制方法步骤(1)所述制备清毒安肾胶囊供试品溶液是：取清毒安肾胶囊内容物适量，甲醇提取，滤过，定量转移到固相萃取柱，用甲醇分次洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，回收甲醇，残渣再用甲醇溶解，制成供试品溶液。更具体地，该步骤为：
取本品内容物适量，混匀，研细，取约0.8g，置具塞锥形瓶中，精密称定，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，定量转移至固相萃取小柱(填料：C18，规格：6ml，500mg)，用甲醇20ml分次洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干，残渣定量加入甲醇2ml，使完全溶解，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为成品供试品溶液。
所述梯度洗脱的步骤也可用表1表示：
表1梯度洗脱表
按照本发明的方法，通过对5批清毒安肾胶囊构建的高效液相色谱指纹图谱并进行分析比较，找出其共有特征峰得到清毒安肾胶囊标准指纹图谱。所构建的指纹图谱在203nm、260nm共检测出34个共有色谱峰，归属于黄芪的色谱峰4个，归属于淫羊藿的色谱峰7个，归属于大黄的色谱峰7个，归属于当归的色谱峰1个，归属于白芍的色谱峰2个，归属于地黄的色谱峰1个，归属于三七的色谱峰2个，归属于泽泻的色谱峰1个；另有当归、川芎的共有色谱峰4个。
清毒安肾胶囊的HPLC指纹图谱203nm的共有峰为[1*]、[2*]、[3]、[4]、[9*]、[13]、[15]、[18*]、[19*]、[20*]、[21*]、[24]、[27*]、[28*]、[31]、[34]16个峰；其中，归属于黄芪的共有峰为[15]1个峰；归属于淫羊藿的共有峰为[18*]、[19*]、[20*]、[21*]、[27*]5个峰；归属于白芍的共有峰为[3]、[4]2个峰；归属于地黄的共有峰为[31]1个峰；归属于三七的共有峰为[13]、[24]2个峰；归属于泽泻的共有峰为[34]1个峰；同时归属于当归、川芎的共有峰为[28*]1个峰；所述图谱的图形如说明书附图中的图1A所示的图谱；
清毒安肾胶囊的HPLC指纹图谱260nm的共有峰为[1*]、[2*]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9*]、[10]、[11]、[12]、[14]、[16]、[17]、[18*]、[19*]、[20*]、[21*]、[22]、[23]、[25]、[26]、[27*]、[28*]、[29]、[30]、[32]、[33]27个峰；其中，归属于黄芪的共有峰为[6]、[11]、[14]3个峰，归属于淫羊藿的共有峰为[12]、[18*]、[19*]、[20*]、[21*]、[26]、[27*]7个峰；归属于大黄的共有峰为[16]、[17]、[22]、[23]、[25]、[30]、[32]7个峰；归属于当归的共有峰为[10]1个峰；同时归属于当归、川芎的共有峰为[7]、[28*]、[29]、[33]4个峰；所述图谱的图形如说明书附图中的图1B所示的图谱。
检测波长203nm、260nm同时检测到的共有色谱峰(9个共有色谱峰)用*表示。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到：清毒安肾胶囊的HPLC指纹图谱，其特殊之处在于，利用DAD检测器和HPLC/MS/MS技术手段对主要峰进行色谱峰 归属及峰纯度检测，通过UV吸收曲线的比较，结合质谱的分子离子峰、裂解碎片信息确证和指认：
260nm：1*号峰为腺嘌呤、2*号峰为没食子酸、6号峰为毛蕊异黄酮苷、7号峰为阿魏酸、11号峰为芒柄花苷、14号峰为毛蕊异黄酮、18*号峰为朝藿定A、19*号峰为朝藿定B、20*号峰为朝藿定C、21*号峰为淫羊藿苷、23号峰为大黄酸、25号峰为芦荟大黄素、28*号峰为藁本内酯、29号峰为3-丁烯基苯酞、30号峰为大黄酚、32号峰为大黄素甲醚；
203nm：4号峰为芍药苷、13号峰为人参皂苷Rg1、24号峰为人参皂苷Rb1、34号峰为23-乙酰泽泻醇B。
以上色谱峰构成了清毒安肾胶囊的指纹特征。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、HPLC非线性梯度洗脱在-个流动相系统利用不同检测波长，同时检出复方中的九味药材。
2、该法针对成品所含有效成分的结构特点及理化特征，对供试品的预处理方法、流动相、检测波长、洗脱程序、柱温、流速等条件进行了筛选和优化，选用的方法具有良好的可行性。
3、更全面地监控原料药材、半成品和成品的质量，监控生产工艺的稳定性。
4、在该指纹图谱的基础上，可以开展指纹图谱信息与药效活性信息的相关性研究，从而深入地阐明产品的内在化学成分与该制剂疗效的相关性。
附图说明
图1A是本发明的清毒安肾胶囊(203nm)标准指纹图谱；图1B是本发明的清毒安肾胶囊(260nm)标准指纹图谱。
图2A是清毒安肾胶囊(203nm)黄芪的HPLC指纹图谱色谱峰示意图；图2B是清毒安肾胶囊(260nm)黄芪的HPLC指纹图谱色谱峰示意图。
图3A是清毒安肾胶囊(203nm)淫羊藿的HPLC指纹图谱色谱峰示意图；图3B是清毒安肾胶囊(260nm)淫羊藿的HPLC指纹图谱色谱峰示意图。
图4A是清毒安肾胶囊(203nm)大黄的HPLC指纹图谱色谱峰示意图；图4B是清毒安肾胶囊(260nm)大黄的HPLC指纹图谱色谱峰示意图。
图5A是清毒安肾胶囊(203nm)当归的HPLC指纹图谱色谱峰示意图；图5B是清毒安肾胶囊(260nm)当归的HPLC指纹图谱色谱峰示意图。
图6是清毒安肾胶囊(203nm)川芎的HPLC指纹图谱色谱峰示意图。
图7A是清毒安肾胶囊(203nm)当归、川芎的HPLC指纹图谱色谱峰示意图；图7B是清毒安肾胶囊(260nm)当归、川芎的HPLC指纹图谱色谱峰示意图。
图8A是清毒安肾胶囊(203nm)白芍的HPLC指纹图谱色谱峰示意图；图8B是清毒安肾胶囊(260nm)白芍的HPLC指纹图谱色谱峰示意图。
图9是清毒安肾胶囊(203nm)地黄的HPLC指纹图谱色谱峰示意图。
图10是清毒安肾胶囊(203nm)三七的HPLC指纹图谱色谱峰示意图。
图11是清毒安肾胶囊(203nm)泽泻的HPLC指纹图谱色谱峰示意图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
1仪器与试药
1.1仪器：戴安Dionex公司高效液相色谱仪(ASI-100自动进样器、ATH-585柱温箱、P680四元梯度泵、PDA-100检测器)；色谱柱：UltimateXB-C18(3.0×150mm，3μm)。
1.2试药：5批成品及对应的半成品，均由丽珠制药厂提供。实验中液相色谱所用试剂乙腈均为色谱纯，其余所用试剂均为分析纯，水为超纯水。对照品
2方法与结果
2.1供试品溶液的制备：取本品内容物适量，混匀，研细，取约0.8g，置具塞锥形瓶中，精密称定，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，定量转移至固相萃取小柱(填料：C18，规格：6ml，500mg)，用甲醇20ml分次洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干，残渣定量加入甲醇2ml，使完全溶解，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为成品供试品溶液(0.04g/ml)；
半成品供试品溶液的制备：取本品内容物适量，混匀，研细，取约0.8g，置具塞锥形瓶中，精密称定，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，定量转移至固相萃取小柱(填料：C18，规格：6ml，500mg)，用甲醇20ml分次洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干，残渣定量加入甲醇2ml，使完全溶解，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为成品供试品溶液(0.025g/ml)；
混合对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮苷、淫羊藿苷、大黄酚、阿魏酸、芍药苷、人参皂苷Rg1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含毛蕊异黄酮苷、淫羊藿苷、大黄酚、阿魏酸、芍药苷各0.1mg，含人参皂苷Rg10.2mg的混合溶液，即得；
药材供试品溶液的制备：取各味药材粗粉，取样量分别为黄芪0.54g，淫羊藿、大黄、白芍、茯苓、泽泻0.20g，当归、川芎、地黄0.27g，三七0.08g，按生产工艺的制法提取后，溶液减压蒸干，精密加入50ml甲醇溶解，取5ml定量转移至固相萃取小柱(填料：C18，规格：6ml，500mg)，用20ml甲醇洗脱，收集流出液，减压蒸干，定量吸取2ml甲醇溶解，用0.22μm微孔滤膜滤过，作为药材供试品溶液，备用。
2.2高效液相色谱分析：精密吸取成品及半成品供试品溶液10μl，进样；色谱条件：Ultimate XB-C18(3.0×150mm，3μm)；流动相为乙腈(A)-0.04％磷酸溶液(B)，采用表2的梯度洗脱方式：
表2梯度洗脱表
检测波长：203nm、260nm；流速：0.6ml/min；得到清毒安肾胶囊高效液相色谱指纹图谱。
2.3共有峰确定：按照实验方法，对所有清毒安肾胶囊进行分析，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2009版)进行评价，清毒安肾胶囊指纹图谱共有模式的建立基于以下原则：①样品成分复杂，因此只对峰面积≥1mAU*min的色谱峰进行归属；②成品与大黄、淫羊藿等药材对应的色谱峰较多，因此某些特征性不强的色谱峰未列入共有模式，共有模式应尽量全面反映归属于各味药材的成分情况；③某些成分响应值高且在各批次中稳定存在，可能是药材共煎产生，也将其列入共有模式。共有峰列表如下：
成品在203nm的共有峰列表如下：
| 峰号 | 纯否 | 归属药材 | 色谱峰确证名称 |
| 1* | + | - | 腺嘌呤 |
| 2* | + | - | 没食子酸 |
| 3 | - | 白芍 | - |
| 4 | + | 白芍 | 芍药苷 |
| 9* | - | - | - |
| 13 | + | 三七 | 人参皂苷Rg1 |
| 15 | - | 黄芪 | - |
| 18* | + | 淫羊藿 | 朝藿定A |
| 19* | + | 淫羊藿 | 朝藿定B |
| 20* | + | 淫羊藿 | 朝藿定C |
| 21* | + | 淫羊藿 | 淫羊藿苷 |
| 24 | - | 三七 | 人参皂苷Rb1 |
| 27* | + | 淫羊藿 | - |
| 28* | + | 当归、川芎 | 藁本内酯 |
| 31 | - | 地黄 | - |
| 34 | - | 泽泻 | 23-乙酰泽泻醇B |
成品在260nm的共有峰列表如下：
| 峰号 | 纯否 | 归属药材 | 色谱峰确证名称 |
| 1* | + | - | 腺嘌呤 |
| 2* | + | - | 没食子酸 |
| 5 | + | - | - |
| 6 | - | 黄芪 | 毛蕊异黄酮苷 |
| 7 | - | 当归、川芎 | 阿魏酸 |
| 8 | - | - | - |
| 9* | - | - | - |
| 10 | + | 当归 | - |
| 11 | - | 黄芪 | 芒柄花苷 |
| 12 | + | 淫羊藿 | - |
| 14 | + | 黄芪 | 毛蕊异黄酮 |
| 16 | - | 大黄 | - |
| 17 | - | 大黄 | - |
| 18* | + | 淫羊藿 | 朝藿定A |
| 19* | + | 淫羊藿 | 朝藿定B |
| 20* | + | 淫羊藿 | 朝藿定C |
| 21* | + | 淫羊藿 | 淫羊藿苷 |
| 22 | + | 大黄 | - |
| 23 | - | 大黄 | 大黄酸 |
| 25 | + | 大黄 | 芦荟大黄素 |
| 26 | + | 淫羊藿 | - |
| 27* | + | 淫羊藿 | - |
| 28* | - | 当归、川芎 | 藁本内酯 |
| 29 | - | 当归、川芎 | 3-丁烯基苯酞 |
| 30 | + | 大黄 | 大黄酚 |
| 32 | - | 大黄 | 大黄素甲醚 |
| 33 | - | 当归、川芎 | - |
2.4共有特征峰的描述
所述清毒安肾胶囊的HPLC指纹图谱203nm的共有峰为[1*]、[2*]、[3]、[4]、[9*]、[13]、[15]、[18*]、[19*]、[20*]、[21*]、[24]、[27*]、[28*]、[31]、[34]16个峰；其中，归属于黄芪的共有峰为[15]1个峰；归属于淫羊藿的共有峰为[18*]、[19*]、[20*]、[21*]、[27*]5个峰；归属于白芍的共有峰为[3]、[4]2个峰；归属于地黄的共有峰为[31]1个峰；归属于三七的共有峰为[13]、[24]2个峰；归属于泽泻的共有峰为[34]1个峰；同时归属于当归、川芎的共有峰为[28*]1个峰；所述图谱的图形如说明书附图中的图1A所示的图谱。
利用DAD检测器和HPLC/MS/MS技术手段对主要峰进行色谱峰归属及峰纯度检测，通过UV吸收曲线的比较，结合质谱的分子离子峰、裂解碎片信息确证和指认：
203nm：4号峰为芍药苷、13号峰为人参皂苷Rg1、24号峰为人参皂苷Rb1、34号峰为23-乙酰泽泻醇B。
所述清毒安肾胶囊的HPLC指纹图谱260nm的共有峰为[1*]、[2*]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9*]、[10]、[11]、[12]、[14]、[16]、[17]、[18*]、[19*]、[20*]、[21*]、[22]、[23]、[25]、[26]、[27*]、[28*]、[29]、[30]、[32]、[33]27个峰；其中，归属于黄芪的共有峰为[6]、[11]、[14]3个峰，归属于淫羊藿的共有峰为[12]、[18*]、[19*]、[20*]、[21*]、[26]、[27*]7个峰；归属于大黄的共有峰为[16]、[17]、[22]、[23]、[25]、[30]、[32]7个峰；归属于当归的共有峰为[10]1个峰；同时归属于当归、川芎的共有峰为[7]、[28*]、[29]、[33]4个峰；所述图谱的图形如说明书附图中的图1B所示的图谱。
利用DAD检测器和HPLC/MS/MS技术手段对主要峰进行色谱峰归属及峰纯度检测，通过UV吸收曲线的比较，结合质谱的分子离子峰、裂解碎片信息确证和指认：
260nm：1*号峰为腺嘌呤、2*号峰为没食子酸、6号峰为毛蕊异黄酮苷、7 号峰为阿魏酸、11号峰为芒柄花苷、14号峰为毛蕊异黄酮、18*号峰为朝藿定A、19*号峰为朝藿定B、20*号峰为朝藿定C、21*号峰为淫羊藿苷、23号峰为大黄酸、25号峰为芦荟大黄素、28*号峰为藁本内酯、29号峰为3-丁烯基苯酞、30号峰为大黄酚、32号峰为大黄素甲醚。
2.5精密度试验：取同一清毒安肾胶囊供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2009版)进行评价，各检测波长下的相似度均大于0.99，表明仪器精密度好。
相似度结果如下：
20.3nm
260nm
2.6稳定性考察：取同一清毒安肾胶囊供试品溶液，分别在0、2、4、8、10、24小时进样，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价，相似度均大于0.97，表明供试品溶液放置24小时内稳定。
相似度结果如下：
203nm
260nm
2.7重复性试验：取同一批清毒安肾胶囊6份，按供试品溶液制备项下方法操作，分别进样，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价，相似度均大于0.98。
相似度结果如下：
203nm
260nm
2.8中间精密度：精密称取同一批号的清毒安肾胶囊(批号0910002)，分别在不同日期、不同分析人员、不同仪器等变动因素条件下，依法测定，检测指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价。表明该方法中间精密度好，清毒安肾胶囊HPLC指纹图谱质量控制方法可行。
2.8.1不同分析时间：取同一批号的清毒安肾胶囊，分别于不同日期按“供试品溶液的制备”项下方法操作，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价，相似度均大于0.99。
相似度结果如下：
203nm
| 分析时间1 | 分析时间2 | 对照指纹图谱 | |
| 分析时间1 | 1.000 | 0.995 | 0.999 |
| 分析时间2 | 0.995 | 1.000 | 0.999 |
| 对照指纹图谱 | 0.999 | 0.999 | 1.000 |
260nm
| 分析时间1 | 分析时间2 | 对照指纹图谱 | |
| 分析时间1 | 1.000 | 0.998 | 0.999 |
| 分析时间2 | 0.998 | 1.000 | 1.000 |
| 对照指纹图谱 | 0.999 | 1.000 | 1.000 |
2.8.2不同分析人员：取同一批号的清毒安肾胶囊，不同人员分别按“供试品溶液的制备”项下方法操作，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2009版)进行评价，相似度均大于0.99。
相似度结果如下：
203nm
| 分析人员1 | 分析人员2 | 对照指纹图谱 | |
| 分析人员1 | 1.000 | 0.976 | 0.995 |
| 分析人员2 | 0.976 | 1.000 | 0.994 |
| 对照指纹图谱 | 0.995 | 0.994 | 1.000 |
260nm
| 分析人员1 | 分析人员2 | 对照指纹图谱 | |
| 分析人员1 | 1.000 | 0.997 | 0.999 |
| 分析人员2 | 0.997 | 1.000 | 0.999 |
| 对照指纹图谱 | 0.999 | 0.999 | 1.000 |
Claims (1)
1.一种清毒安肾胶囊的指纹图谱建立方法，其特征是它包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取清毒安肾胶囊0.1g～10.0g，用甲醇提取，滤过，取滤液适量，净化，用甲醇配成清毒安肾胶囊供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备：精密称取毛蕊异黄酮苷、淫羊藿苷、大黄酚、阿魏酸、芍药苷、人参皂苷Rgl适量，加甲醇使溶解，制成混合对照品溶液：毛蕊异黄酮苷、淫羊藿苷、大黄酚、阿魏酸、芍药苷的浓度为0.1mg/m1，人参皂苷Rgl的浓度为0.2mg/m1；
(3)采用高效液相色谱法分析上述供试品溶液和对照品溶液，色谱条件为：进样量10～30μl；色谱柱为ODS C18，3μm；流动相为用磷酸或甲酸或冰醋酸调至pH为2.4的水-乙腈，梯度洗脱；柱温：30℃；检测波长：203nm、260nm；得到清毒安肾胶囊高效液相色谱指纹图谱；所述梯度洗脱步骤为：0～10分钟，流动相乙腈∶水由2∶98渐变为18∶82；10～20分钟，流动相乙腈∶水为18∶82；20～55分钟，流动相乙腈∶水由18∶82渐变为30∶70；55～90分钟，流动相乙腈∶水由30∶70渐变为88∶12。
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