CN108061762B - 一种补肾托毒颗粒中三种黄酮成分的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种补肾托毒颗粒中三种黄酮成分的含量测定方法,即葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的含量测定方法。其特征:以乙腈为A相、体积比1∶30的甲醇‑0.1%磷酸为B相,经4次比例变换梯度洗脱,流速1.0mL/min;柱温40℃;检测波长:263nm;同时测定补肾托毒颗粒中葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的含量。波峰保留时间:葛根素9.5分钟、金丝桃苷15.5分钟、淫羊藿苷28.5分钟,在30分钟内三种成分出峰完毕,且各波峰分离良好。方法简便、快捷、高效率、低成本,易于普及掌握。
Description
技术领域
本发明属中药质量控制领域,涉及一种补肾托毒颗粒中三种黄酮成分的含量测定方 法,即葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的含量测定方法。
背景技术
补肾托毒颗粒由淫羊藿、补骨脂、菟丝子、枸杞子、地黄、蒲公英、虎杖、黄 芪、葛根、人参和三七,十一味药材组成,具有补肾填精,益气养血之功效,用于脾肾之虚, 气血不足之“虚劳”引起的头晕、心悸,气短乏力,面色唇甲淡白,皮肤粘膜出血,月经量 多,腰膝疲软等;再生障碍性贫血、缺铁性贫血、巨细胞贫血、溶血性贫血、白血病、骨髓 增生异常综合征、血小板减少性紫癜、多发性骨髓瘤、骨髓纤维化及癌症放化疗引起的骨髓 抑制等见上述证候者。其中淫羊藿和补骨脂为君药,菟丝子、枸杞子和地黄为臣药,人参、 黄芪、蒲公英、虎杖和三七为佐药,葛根为使药。诸药配合,补虚透邪,标本兼顾.共发挥阴阳 双补,填精益髓,补气养血,托毒透邪之功效。在治疗脾肾虚弱、气血不足引起的头晕、心悸, 气短乏力以及再生障碍性贫血等方面获得较好效果。为确保临床治疗效果,对其质量控制方 法进行了研究。获得同时测定君药淫羊藿中的淫羊藿苷,君药淫羊藿和臣药菟丝子中的金丝 桃苷,以及使药葛根中葛根素的一测多评测定方法。
补肾托毒颗粒剂重量比配方如下:
淫羊藿 16~46份 补骨脂 11~33份 菟丝子 13~35份 枸杞 10~30份
生地黄 10~30份 蒲公英 10~30份 虎杖 6~12份 黄芪 10~30份
葛根 6~12份 人参 3~10份 三七 1~3份
上述配方中的十一味中药,人参、三七粉碎成细粉备用;淫羊藿、菟丝子、蒲公英、黄芪、虎杖,加10倍量70%乙醇提取二次,每次2.5小时,滤过,合并滤液,回收乙醇后, 备用;其余补骨脂、枸杞子等四味中药,加10倍量水,提取2次,每次2.5小时,滤过,合 并滤液,70℃减压浓缩至相对密度1.15-1.20(60℃)清膏,与醇提清膏合并,继续在70℃ 减压浓缩至相对密度1.25-1.30(60℃)稠膏,加入备用的药材细粉,搅拌均匀,在70℃减 压干燥,取干膏,加入200-240g糊精与适量甜菊素,混合粉碎,用适量浓度乙醇制粒,70℃ 减压干燥,制成颗粒1000g,即得。
按照国家规定的君、臣、佐、使各味药材在处方中作用顺序以及贵重中药、有毒中药 尽量增订定量检测标准的原则,拟采用一测多评的手段,对君药淫羊藿中的淫羊藿苷、金丝 桃苷,臣药菟丝子中的金丝桃苷以及使药葛根中葛根素进行同时定量测定。以实现高效率、 低成本、多指标控制制剂质量的目的。
查阅资料得知,在中国药典2015年版一部淫羊藿药材项下,收载了淫羊藿苷的两种 含量测定方法,即药材项下是用乙腈-水(30∶70)为流动相,以等度洗脱的方式,270nm为检测波长,测定药材中的淫羊藿苷;在其炙淫羊藿项下,则是以乙腈为A相、水为B相,以 梯度洗脱方式,即0~29min,25%A;29~30min,25%~41%A;30~55min,41%A;270nm 为检测波长,测定饮片中的淫羊藿苷和宝藿苷I。很明显炙淫羊藿的多成分测定,因黄酮类 的结构与性质差异,需要采用梯度洗脱的方式,才能将淫羊藿苷和宝藿苷I分离,运行一针 要花费近1小时。在淫羊藿药材项下未收载金丝桃苷的含量测定指标,但其含有一定量金丝 桃苷。在中国药典2015年版一部菟丝子和葛根药材项下,分别收载了用乙腈-0.1%磷酸(17∶83)和甲醇-水(25∶75)为流动相,以等度洗脱的方式,以360nm和250nm为检测波长,分 别测定菟丝子中的金丝桃苷和葛根中的葛根素含量方法。但未查阅到在中药制剂中同时测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的报道。
通过多种流动相的组合、配比、检测波长、以及梯度时间程序改变等研究,获得35分钟内测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷一测多评测定方法。
发明内容
以乙腈为A相、甲醇-0.1%磷酸(1∶30)为B相,采用梯度洗脱方式,即0~20min, 8~25%A;20~35min,25~42%A;35~35.1min,42~8%A;35.1~40mm,8%A;流速1.0mL/min; 柱温40℃;检测波长:263nm;在35分钟内测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷一测多评测 定方法。三成分的保留时间:葛根素9.5分钟、金丝桃苷15.5分钟、淫羊藿苷28.5分钟,波峰分离良好。
通过方法学考察,葛根素进样量在0.3656-3.656μg,与峰面积呈良好的线性关系(见 表1、图1),回归方程为Y=1550341.2X+27450,r=0.99996;金丝桃苷进样量在0.0235-0.235μg,与峰面积呈良好的线性关系(见表2、图2),回归方程为Y=1308624.9X+436,r=0.99997;淫羊藿苷进样量在0.5038-5.038μg,与峰面积呈良好的线性关系(见表3、图3),回归方程为Y=953714.8X+37825,r=0.9999。采用加样回收实验,结果表明:葛根素的平均回收率为100.54%,RSD为0.71%(n=6,见表5);金丝桃苷的平均回收率为100.86%, RSD为0.77%(n=6,见表6);淫羊藿苷的平均回收率为100.02%,RSD为0.16%(n=6,见表7); 精密度(见表8)、稳定性(见表9)、重复性(见表10),均符合方法学要求。适用于补肾托毒 颗粒中葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的同时定量测定。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为:
(1)色谱条件与系统适用性试验以乙腈为A相、甲醇-0.1%磷酸(1∶30)为B相, 采用梯度洗脱方式,即0~20min,8~25%A;20~35min,25~42%A;35~35.1min,42~8%A;35.1~40min,8%A;流速1.0mL/min;柱温40℃;检测波长:263nm;理论板数按葛根素 峰计算应不低于3000;
(2)对照品溶液的制备精密称取葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷对照品适量,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml分别含葛根素0.09mg、金丝桃苷0.009mg和淫羊藿苷0.09mg 的混合对照品溶液;
(3)供试品溶液的制备取本品,研细,取0.4g,精密称定,置锥形瓶中,精密加 入60%甲醇25ml,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理10分钟;放冷,再称定重 量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,用0.45μm的微孔滤膜滤过,续滤液 作为供试品溶液;
(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的含量(见表12)。
本发明的原理如下:
葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷都属于黄酮类的化合物与糖结合成的苷;结构式如下:
从分子量大小与羟基多少分析,葛根素水溶性最大,其次是金丝桃苷,而水溶性最小、 分子量最大的是淫羊藿苷,但都能溶于含水醇中。从其紫外光谱图得知,葛根素在约248nm (图5)有最大吸收;金丝桃苷在约254和354nm有两个吸收峰(图6),254nm处灵敏,且波峰谱带较宽,从250~264nm峰值变化不大;淫羊藿苷在约265nm(图7)有最大吸收。 依据三成分在制剂中的含量高低以及其最大吸收,选择在263nm作为检测波长,目的是平衡 三成分的波峰值,即,使含量低微的金丝桃苷处于较大的波峰面积值,使高含量的葛根素和淫羊藿苷的波峰面积值有所减小。直接以含水甲醇超声提取颗粒中的三种成分,滤过后,进样即可。无萃取、无蒸干、简便、快捷、实用。通过经时地调整A相和B相体积比,使三种 成分在30分钟内出峰完毕。再依据该三种成分的进样量在一定范围内,与其峰面积呈现良好 的线性关系,而用于定量测定。
本发明的创新点及有益效果如下:
(1)以乙腈为A相、甲醇-0.1%磷酸(1∶30)为B相,采用梯度洗脱方式,即0~20min,8~25%A;20~35min,25~42%A;35~35.1min,42~8%A;35.1~40min,8%A;流速1.0mL/min; 柱温40℃;检测波长:263nm;在35分钟内测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷一测多评测 定方法,为首次报道。
(2)淫羊藿药材主含黄酮类,代表性成分有淫羊藿苷、宝藿苷I、金丝桃苷等,中 国药典2015年版一部淫羊藿药材项下,未收载金丝桃苷的含量测定方法,也未查阅到其他文献有关淫羊藿中金丝桃苷含量测定的报道。本申请在11味药材组成的复方制剂中,同时测定 君药淫羊藿中的淫羊藿苷,臣药菟丝子和君药淫羊藿都含有的金丝桃苷以及使药葛根中的葛 根素。方法简便、快捷、易于普及实施,并为药材淫羊藿中的淫羊藿苷和金丝桃苷同时定量 测定,提供了方法与参考数据。
附图说明
图1葛根素的线性关系图
图2金丝桃苷的线性关系图
图3淫羊藿苷的线性关系图
图4葛根素的光谱扫描图
图5金丝桃苷的光谱扫描图
图6淫羊藿苷的光谱扫描图
图7为葛根素、金丝桃苷、淫羊藿苷对照品HPLC色谱图
图8为补肾托毒颗粒HPLC色谱图
图9为缺少葛根的阴性样品HPLC色谱图
图10为缺少淫羊藿和菟丝子的阴性样品HPLC色谱图
图11为缺少淫羊藿的阴性样品HPLC色谱图
图1、图2、图3纵坐标为峰面积;横坐标为进样量(μg)
图4、图5、图6纵坐标为吸收强度(mAU);横坐标为吸收波长(nm)
图7、图8、图9、图10、图11中,1.葛根素2.金丝桃苷3.淫羊藿苷
本发明具体实施方式
实施例1:
(1)色谱条件与系统适用性试验乙腈为A相、甲醇-0.1%磷酸(1∶30)为B相, 采用梯度洗脱方式,即0~20min,8~25%A;20~35min,25~42%A;35~35.1min,42~8%A;35.1~40min,8%A;流速1.0mL/min;柱温40℃;检测波长:263nm;理论板数按葛根素 峰计算应不低于3000;
(2)对照品溶液的制备精密称取葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷对照品适量,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml分别含葛根素0.09mg、金丝桃苷0.009mg和淫羊藿苷0.09mg 的混合对照品溶液;
(3)供试品溶液的制备取本品,研细,取0.4g,精密称定,置锥形瓶中,精密加 入60%甲醇25ml,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理10分钟;放冷,再称定重 量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,用0.45μm的微孔滤膜滤过,续滤液 作为供试品溶液;
(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的含量。
表1葛根素进样量与峰面积
表2金丝桃苷进样量与峰面积
表3淫羊藿苷进样量与峰面积
表5样品中葛根素的回收率试验结果
表6样品中金丝桃苷的回收率试验结果
表7样品中淫羊藿苷的回收率试验结果
表9精密度实验结果(峰面积)
表10稳定性实验结果(峰面积)
表11重复性试验结果(mg/g)
表12补肾托毒颗粒的含量测定结果(mg/g)
Claims (2)
1.一种补肾托毒颗粒中三种黄酮成分的含量测定方法,其特征在于:
(1)色谱条件与系统适用性试验以乙腈为A相、体积比1∶30的甲醇-0.1%磷酸为B相,采用梯度洗脱方式,即0~20min,8→25%A;20~35min,25→42%A;35~35.1min,42→8%A;35.1~40min,8%A;流速1.0mL/min;柱温40℃;检测波长:263nm;理论板数按葛根素峰计算应不低于3000;
(2)对照品溶液的制备精密称取葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷对照品适量,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml分别含葛根素0.09mg、金丝桃苷0.009mg和淫羊藿苷0.09mg的混合对照品溶液;
(3)供试品溶液的制备取补肾托毒颗粒,研细,取0.4g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入60%甲醇25ml,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理10分钟;放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,用0.45μm的微孔滤膜滤过,续滤液作为供试品溶液;
(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的含量。
2.根据权利要求1所述的一种补肾托毒颗粒中三种黄酮成分的含量测定方法,其特征在于所述的补肾托毒颗粒由补骨脂、淫羊藿、菟丝子、枸杞、生地黄、蒲公英、虎杖、黄芪、葛根、人参、三七,十一味药材组成,每1g颗粒相当2-3g原药材。
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