CN102309531A - 一种西洋参药材指纹图谱的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种西洋参指纹图谱的测定方法。西洋参原产于北美洲加拿大的蒙特利尔、魁北克和美国东部，味苦，性凉，入心、肺、肾经，功能以补益为主，有滋阴生津、凝神益智功效。本发明采用高效液相色谱法蒸发光检测器检测的方法进行指纹图谱测定，用于西洋参原料质量控制。

Description

一种西洋参药材指纹图谱的测定方法

技术领域

本发明涉及一种西洋参药材指纹图谱的测定方法，属于药物分析技术领域。

背景技术

西洋参(Panax quinquefolium L)，为五加科人参属植物，俗名美国人参、花旗参、洋参、广东参，原产于北美洲加拿大的蒙特利尔、魁北克和美国东部。药用部分为干燥的根，味苦，性凉，入心、肺、肾经。功能以补益为主，有滋阴生津、凝神益智功效。早在清康熙33年《补图本草备要》和清乾隆30年《本草纲要拾遗》中已有西洋参药性的记载。我国应用西洋参已有近300年的历史，20世纪70年代后期，在我国和日本引种栽培成功，吉林、黑龙江、北京、山东、陕西等地均有栽培【贾继明，吴立军，吴以岭.西洋参与糖尿病.中医药信息，2007，24(6)：35-38】。

由于西洋参产地繁多，质量控制对于中药成品质量的影响显著，中药材指纹图谱是在中医药基础理论指导下，针对中药材的品种和质量，在现有认知水平基础上，以整体信息和药效指标为依据，采用多种分析方法和技术，建立的客观、整体和多指标的综合评价体系。中药材指纹图谱的建立，将对中药的规范化、标准化、产业化和国际化提供科学的技术平台，对中药现代化的战略行动具有科学的指导意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种西洋参指纹图谱的测定方法。

本发明所述指纹图谱的测定方法是采用高效液相色谱法测定其指纹图谱，其检测设备为蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)。

本发明所述指纹图谱的测定方法高效液相的色谱条件优选为：

色谱柱为C18柱；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％醋酸水溶液，梯度洗脱。

本发明所述指纹图谱的测定方法高效液相的色谱条件中梯度洗脱的流动相梯度优选如下：

0→20分钟，流动相A由80％匀速降至79％，20→25分钟，流动相A由79％匀速降至74％，25→29分钟，流动相A由74％匀速降至73％，29→43分钟，流动相A由73％匀速降至66％，43→47分钟，流动相A由66％匀速降至64％，47→54分钟，流动相A由64％匀速降至57％，54→55分钟，流动相A由57％匀速降至55％，55→59分钟，流动相A由55％匀速降至50％，59→65分钟，流动相A由50％匀速降至5％，65→69分钟，流动相A保持5％。

本发明所述指纹图谱的测定方法中对供试品溶液的配制方法如下：

供试品溶液  称取过40目筛的药材10.0g，用100.0ml 70％甲醇溶液超声提取30min，过滤，滤液减压浓缩蒸去甲醇后用水定容到20.0ml。加入6.0ml石油醚萃取，脱脂，重复萃取3次；萃取后水层加入6.0ml水饱和正丁醇萃取其中的目标成分，重复萃取3次；正丁醇萃取液减压浓缩至干，用甲醇定容到10.0ml，0.45μm滤膜滤过，即得；

本发明所述指纹图谱的测定方法的色谱条件更优选如下：

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％醋酸水溶液，梯度洗脱；洗脱梯度为：0→20分钟，流动相A由80％匀速降至79％，20→25分钟，流动相A由79％匀速降至74％，25→29分钟，流动相A由74％匀速降至73％，29→43分钟，流动相A由73％匀速降至66％，43→47分钟，流动相A由66％匀速降至64％，47→54分钟，流动相A由64％匀速降至57％，54→55分钟，流动相A由57％匀速降至55％，55→59分钟，流动相A由55％匀速降至50％，59→65分钟，流动相A由50％匀速降至5％，65→69分钟，流动相A保持5％。

色谱柱为C18，规格为250mm×4.6mm×5μm；柱温为35℃；流速为1.0ml/min；气体压力为25psi；雾化器级别为60％；漂移管温度为60℃。

为证实该方法准确可靠，重复性好，能够用于控制西洋参药材的内在质量进行如下方法学验证：

1仪器与材料

1.1仪器AT201电子天平(瑞士METTLER-TOLDO)，R205旋转蒸发仪(德国BUCHI)，HS10260D超声波清洗器(天津市恒奥科技公司)，高效液相色谱仪HPLC，Waters ailiance 2695，检测器：Waters ELSD 2420。

1.2试剂与药品

人参皂苷对照品Rb1，Rb2，Rc，Rd，Rg1，Re，Rg3，P-F11由中国国家药品生物制品检定所提供。乙腈(HPLC级，美国Fisher公司)、甲醇(HPLC级，美国Fisher公司)，水为重蒸水，正丁醇(分析纯，天津四友化学试剂有限公司)。HPLC用所有试剂均经过0.45μm微孔滤膜过滤及超声脱气处理。

1.3药材

10个国产西洋参样品于2006年10月分别采集于吉林、辽宁、黑龙江、北京、山东、陕西等地，均为4年生样品，并购买了加拿大蒙特利尔产西洋参。各样品均经河北省药品检验所鉴定为正品西洋参(Panax quinquefoliumL.)，见表1。

表1西洋参(Panax quinquefolium L.)药材来源

2、方法与结果

2.1色谱条件

经实验确定以下色谱条件：色谱柱为ES C18，250mm×4.6mm×5μm；柱温为35℃；进样量为10μl；流速为1.0ml/min；气体压力：25psi；雾化器级别：60％；漂移管温度：60℃，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％醋酸水溶液；时间梯度洗脱程序如下：0→20分钟，流动相A由80％匀速降至79％，20→25分钟，流动相A由79％匀速降至74％，25→29分钟，流动相A由74％匀速降至73％，29→43分钟，流动相A由73％匀速降至66％，43→47分钟，流动相A由66％匀速降至64％，47→54分钟，流动相A由64％匀速降至57％，54→55分钟，流动相A由57％匀速降至55％，55→59分钟，流动相A由55％匀速降至50％，59→65分钟，流动相A由50％匀速降至5％，65→69分钟，流动相A保持5％。

2.2对照品溶液的制备

精确称取8种对照品，10mg人参皂苷Rb1，5mg人参皂苷Rb2，10mg人参皂苷Rc，10mg人参皂苷Rd，10mg人参皂苷Rg1，10mg人参皂苷Re，10mg人参皂苷Rg3，10mg人参皂苷P-F11，分别置于5ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得储备液，作为各组分的标准对照品溶液；分别精确移取对照品储备液，1.2ml人参皂苷Rb1，1.0ml人参皂苷Rb2，1.0ml人参皂苷Rc，1.0ml人参皂苷Rd，1.0ml人参皂苷Rg1，1.0ml人参皂苷Re，1.0ml人参皂苷Rg3，1.0ml人参皂苷P-F11，置于10ml容量瓶中，定容，摇匀，作为混合对照品溶液备用。

2.3供试品溶液的制备

称取过40目筛的药材10.0g，用100.0ml 70％甲醇溶液超声提取30min，过滤，滤液减压浓缩蒸去甲醇后用水定容到20.0ml。加入6.0ml石油醚萃取，脱脂，重复萃取3次。萃取后水层加入6.0ml水饱和正丁醇萃取其中的目标成分，重复萃取3次。正丁醇萃取液减压浓缩至干，用甲醇定容到10.0ml，0.45μm滤膜滤过，即得。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验

取西洋参供试品溶液，按照上述色谱条件连续进样5次，记录色谱图，以人参皂苷Rb1为内参比，计算相对保留时间和相对峰面积，结果相对保留时间RSD小于0.3％，相对峰面积的RSD小于5％，表明仪器精密度良好。

2.4.2重复性试验

取西洋参药材5份，按照“供试品溶液制备”项下方法操作，进样分析，以人参皂苷Rb1为内参比，计算供试品溶液各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果相对保留时间RSD小于0.4％，相对峰面积RSD小于5.0％，表明该方法重复性良好。

2.4.3样品溶液稳定性试验

取西洋参供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8和24h，进样分析，记录色谱图，以人参皂苷Rb1为内参比，计算相对保留时间和相对峰面积RSD，结果相对保留时间RSD小于0.5％，相对峰面积的RSD小于5％，说明各种组分在本实验条件下24小时内性质稳定。

3不同产地西洋参HPLC-ELSD指纹图谱的建立

3.1参照峰的选择

取供试品溶液，按上述液相色谱条件，建立不同产地西洋参样品的指纹图谱，见图1。在各色谱峰中，人参皂苷Rb1与人参皂苷Re两个峰最大，由于Re与Rg1分离度非常小，相互存在干扰，所以选择Rb1为参照峰较为适宜。根据分析时的基线噪声水平，将信噪比小于10的色谱峰除去不作考虑。在本实验所建立的分析系统下，皂苷类成分的出峰时间集中在20-65min之间，因此20min之前的出峰不作考虑。

3.2共有峰的确定

从不同产地西洋参样品在相同提取条件指纹图谱中的保留时间中可看出，11个样品可以基本确定12个共有峰，与对照品图谱色谱峰作参照，指认了其中的人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Rg1，Rg3，Re和P-F11 8个峰，在其余色谱峰中确认了4各未知共有峰，见表2。

表2共有峰相对保留时间

3.3西洋参HPLC-ELSD指纹图谱共有模式的确立

利用国家药典委员会的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004版)软件对各产地HPLC-ELSD色谱图进行指纹图谱的建立，采用靖宇产西洋参为参照谱，利用系统的自动匹配功能进行色谱峰的匹配，时间漂移设置为0.5min，以中位数法产生对照图谱，得到西洋参药材对照指纹图谱见图2。

3.4不同产地西洋参指纹图谱相似度计算

按照建立起来的指纹图谱分别对国产西洋参之间、国产西洋参与加拿大西洋参之间进行了相似度分析，结果表明，国产西洋参之间具有较高的相似度，而国产西洋参与加拿大西洋参的相似度存在较大差异，可见，地域和气候对西洋参药材化学成分具有较大的影响。见表3、表4。

表3国产不同产地西洋参药材指纹图谱相似度结果

表4国产西洋参与加拿大西洋参指纹图谱相似度分析结果

目前，中药材的鉴别和分类很大程度上还依赖于经验和表观分析，缺乏从定性定量分析数据中获取评价依据的统一、实用的方法。近年来的色谱指纹图谱相似度研究方面发挥了其优势，在指纹图谱相似度计算中，一般将所选取的色谱峰同时作比较计算，反映指纹图谱的整体相似性，可对中药产品质量做出较全面、准确的评价。本发明以不同产地西洋参样品的峰面积和保留时间为依据，采用国家药典会推行的中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度计算，较全面反映不同西洋参样品的整体特征。本发明建立的的测定方法，对于西洋参药材及其相关产品的质量控制与检验有一定的应用价值。

附图说明：

图1西洋参总皂苷指纹图谱

图2不同产地西洋参药材指纹图谱

图3实施例1测定西洋参总皂苷指纹图谱

具体实施方式

实施例1

色谱条件：色谱柱为ES C18，250mm×4.6mm×5μm；柱温为35℃；进样量为10μl；流速为1.0ml/min；气体压力：25psi；雾化器级别：60％；漂移管温度：60℃，流动相A为乙腈，流动相B为0.05％醋酸水溶液；时间梯度洗脱程序如下：0→20分钟，流动相A由80％匀速降至79％，20→25分钟，流动相A由79％匀速降至74％，25→29分钟，流动相A由74％匀速降至73％，29→43分钟，流动相A由73％匀速降至66％，43→47分钟，流动相A由66％匀速降至64％，47→54分钟，流动相A由64％匀速降至57％，54→55分钟，流动相A由57％匀速降至55％，55→59分钟，流动相A由55％匀速降至50％，59→65分钟，流动相A由50％匀速降至5％，65→69分钟，流动相A保持5％。

供试品溶液的制备：称取过40目筛的药材10.0g，用100.0ml 70％甲醇溶液超声提取30min，过滤，滤液减压浓缩蒸去甲醇后用水定容到20.0ml。加入6.0ml石油醚萃取，脱脂，重复萃取3次。萃取后水层加入6.0ml水饱和正丁醇萃取其中的目标成分，重复萃取3次。正丁醇萃取液减压浓缩至干，用甲醇定容到10.0ml，0.45μm滤膜滤过，即得。

取供试品溶液，按上述液相色谱条件，进样，记录色谱图，结果见图3，经与标准图谱比对，完全拟合。

Claims (5)

1.一种西洋参药材的指纹图谱测定方法，该方法采用高效液相色谱法测定其指纹图谱，其特征在于采用蒸发光散射检测器检测。

2.根据权利要求1所述测定方法，其特征在于所述高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱为C18柱；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％醋酸水溶液，梯度洗脱。

3.根据权利要求1-2任一项所述的测定方法，其特征在于所述色谱条件中梯度洗脱的流动相梯度如下：

0→20分钟，流动相A由80％匀速降至79％，20→25分钟，流动相A由79％匀速降至74％，25→29分钟，流动相A由74％匀速降至73％，29→43分钟，流动相A由73％匀速降至66％，43→47分钟，流动相A由66％匀速降至64％，47→54分钟，流动相A由64％匀速降至57％，54→55分钟，流动相A由57％匀速降至55％，55→59分钟，流动相A由55％匀速降至50％，59→65分钟，流动相A由50％匀速降至5％，65→69分钟，流动相A保持5％。

4.根据权利要求1-2任一项所述的测定方法，其特征在于对供试品溶液的配制方法如下：

供试品溶液  称取过40目筛的药材10.0g，用100.0ml 70％甲醇溶液超声提取30min，过滤，滤液减压浓缩蒸去甲醇后用水定容到20.0ml；加入6.0ml石油醚萃取，脱脂，重复萃取3次；萃取后水层加入6.0ml水饱和正丁醇萃取其中的目标成分，重复萃取3次；正丁醇萃取液减压浓缩至干，用甲醇定容到10.0ml，0.45μm滤膜滤过，即得。

5.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于该测定方法的色谱条件如下：

色谱柱为C18，规格为250mm×4.6mm×5μm；柱温为35℃；流速为1.0ml/min；气体压力为25psi；雾化器级别为60％；漂移管温度为60℃。

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