CN112684036A - 黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，特别涉及黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法及其应用。本发明提供一种黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法，利用高效液相色谱法对待测样品进行检测，以获得色谱图；以及基于所述色谱图，获得黄蛭益肾胶囊中所含化学成分的种类和含量；色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈作为流动相A，以0.05～0.1％磷酸水作为流动相B进行梯度洗脱。该方法灵敏度和精密度高，稳定性和重复性好，可以客观、全面、准确的评价黄蛭益肾胶囊质量，对保证黄蛭益肾胶囊临床疗效具有重要意义。

Description

黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法及其应用。

背景技术

中药指纹图谱是借助于波谱或色谱技术获得的中药化学成分的光谱图或色谱图，是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。目前，美国FDA、英国和印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用植物学会均接受色谱指纹图谱的质控方法。由于中药复方指纹图谱整张图谱是由不同峰群组成，每一峰群都代表一组生物信息，且各种生物信息之间的相互协同及拮抗作用，正好体现了中药复方的配伍和组方理论。此外，这些峰群或峰群之间通过对机体主病及主证的治疗，体现了控制某张中药复方指纹图谱，就可确保其相应药效。目前中药指纹图谱的建立方法主要有：光谱法，如紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)；色谱法，如薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法；以及其他方法，如x射线衍射法、核磁共振法等。其中高效液相色谱法(HPLC)具有分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点，不受样品挥发度和热稳定性的限制，比气相色谱法等其他方法应用范围更广，是构建指纹图谱的主要方法之一。

由于现行标准中黄蛭益肾胶囊缺乏指纹图谱，无法全面的控制黄蛭益肾胶囊的质量，因此，亟需开发一种黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法，以对黄蛭益肾胶囊进行质控，保障临床疗效。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法，该方法灵敏度和精密度高，稳定性和重复性好，可以客观、全面、准确的评价黄蛭益肾胶囊质量，对保证黄蛭益肾胶囊临床疗效具有重要意义。

为此本发明第一方面提供一种黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法。根据本发明的实施例，所述测定方法包括：利用高效液相色谱法对黄蛭益肾胶囊样品进行检测；

其中，所述高效液相色谱法采用的流动相包括：

流动相A，所述流动相A选自乙腈；

流动相B，所述流动相B选自0.05～0.1％磷酸水溶液。

中药的指纹图谱是指中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价，具备专属性强、稳定性好、重现性好的优点，因此中药指纹图谱已经成为目前国际上较为先进的中药质量控制手段。同时，高效液相色谱法(HPLC)具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点。不受样品挥发度和热稳定性的限制，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建中药指纹图谱的主要方法之一。

为了更全面、有效的控制黄蛭益肾胶囊的质量，提高其质量控制水平，让临床用药安全及疗效更加有所保证，发明人创造性的获得一种第一方面所述的黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法，利用该方法能够准确、全面检测黄蛭益肾胶囊中所含化学成分的种类与数量，该方法灵敏度和精密度高，稳定性和重复性好，能够实现对黄蛭益肾胶囊良好的质控。

根据本发明的实施例的黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法，还可以具有以下附加技术特征的至少之一：

根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法采用如下梯度洗脱方式：

时间(min)	A相(％)	B相(％)
			5	5	95
15	10	90
			25	15	85
35	20	80
			45	25	75
55	30	70
			65	35	65
75	40	60
			85	45	55

在本发明提供的测定方法中，所述高效液相色谱法利用上述洗脱条件，所得色谱峰形、响应及分离度均较好。而其他的洗脱条件则无法达到本发明的分离度和良好的峰型。

根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法采用的色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。

根据本发明的实施例，所述色谱柱为Waters

Shield RP18，尺寸250mm×4.6mm，5μm。

只有采用本发明提供的色谱柱以及相应的尺寸，才能够获得较好的分离效果，峰数量也较多，而采用其他的色谱柱，分离效果不好，峰型差且峰数量也较少。根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法采用的柱温为28℃～32℃。

根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法采用的流动相的流速为0.8～1.2mL/min。

根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法采用的检测波长为205～215nm。

本发明提供的高效液相色谱法中，在205～215nm处的图谱信息较多且分离较好。

根据本发明的实施例，所述高效液相色谱法采用的进样体积8μL～12μL。

根据本发明的实施例，所述黄蛭益肾胶囊样品进行高效液相色谱检测之前，预先经过如下预处理；

1)将所述黄蛭益肾胶囊样品中的内容物与有机溶剂进行混合，得到溶解液；

2)将所述溶解液进行过滤，收集滤液，得待测样品溶液。

根据本发明的实施例，所述有机溶剂选自80～100体积％的甲醇溶液。

在本发明提供的测定方法中，采用80～100体积％的甲醇溶液溶解黄蛭益肾胶囊样品中的内容物，能够进一步提高样品色谱峰信息，使得样品色谱峰信息丰富，峰形较好。

根据本发明的实施例，所述混合是在80～120W的功率、45～60kHz频率的超声中进行20～40min。

根据本发明的实施例，所述溶解液的浓度为0.08～0.12g/mL。

本发明提供一种黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法。根据本发明的实施例，所述测定方法包括以下步骤：

(1)取黄蛭益肾胶囊待测样品的内容物2g，精密称定，加入甲醇20mL，超声处理30min，超声处理功率100W，频率52kHz；

(2)取上清液过0.45μm的滤膜，取续滤液，得待测样品溶液；

(3)以Waters

Shield RP18(250mm×4.6mm，5μm)为色谱柱，以乙腈作为流动相A，以0.05％磷酸水作为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：

流速1.0mL/min，柱温30℃，进样体积10μL，检测波长：210nm。

本发明提供的黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法中的测定条件，是本发明的发明人经过大量实验，付出创造性劳动获得的较优的测定条件，在该测定条件下，能够进一步提高测定结果的准确度，能够更全面准确的检测黄蛭益肾胶囊待测样品中重要化学成分的种类和含量，并且进一步提高了检测的灵敏度和精密度，稳定性和重复性更好，能够实现对黄蛭益肾胶囊良好的质控。

本发明另一方面提供所述的黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法在对黄蛭益肾胶囊进行质控中的应用。

利用本发明中方法，能够测定黄蛭益肾胶中重要化学成分的种类和含量，例如能够测定松脂醇二葡萄糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、美迪紫檀苷、黄芪异黄烷苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素等的含量，并且能够实现黄蛭益肾胶中化学成分的药材归属。

本发明另一方面提供一种黄蛭益肾胶囊的质量控制方法。根据本发明的实施例，所述控制方法采用本发明所述的测定方法测定黄蛭益肾胶囊样品中目标物含量；

基于所述目标物含量与阈值之间的关系，确定所述黄蛭益肾胶囊样品是否达标。

在本发明中，通过将测得的目标物含量与标准的该物质含量进行比较，从而对黄蛭益肾胶囊样品进行质控，判定该黄蛭益肾胶囊样品是否达标。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1A显示了黄蛭益肾胶囊对照指纹图谱；

图1B显示了16批黄蛭益肾胶囊样品的叠加指纹图谱；

图2显示了黄蛭益肾胶囊样品的指纹图谱；

图3显示了黄芪药材的色谱图；

图4显示了杜仲药材的色谱图；

图5显示了玄参药材的色谱图；

图6显示了旱墨莲药材的色谱图；

图7显示了三七药材的色谱图；

图8显示了混合标准品的色谱图；

图9A显示了以乙腈-水作为流动相，获得的待测样品的高效液相色谱图；

图9B显示了以乙腈-0.05％磷酸水作为流动相，获得的待测样品的高效液相色谱图；

图9C显示了以乙腈-0.1％磷酸水作为流动相，获得的待测样品的高效液相色谱图；

图10A显示了以Waters Atlantis T3(250×4.6mm，5um)作为色谱柱，获得的待测样品的高效液相色谱图；

图10B显示了以Inter Sustain AQ-C18(250×4.6mm，5um)作为色谱柱，获得的待测样品的高效液相色谱图；

图10C显示了以Waters Symmetry Shield RP18(250×4.6mm，5um)作为色谱柱，获得的待测样品的高效液相色谱图；

图10D显示了以Waters

Shield RP18(250×4.6mm,5um)作为色谱柱，获得的待测样品的高效液相色谱图；

图11A显示了以50％甲醇水溶液作为供试品的提取溶剂，获得的待测样品的高效液相色谱图；

图11B显示了以70％甲醇水溶液作为供试品的提取溶剂，获得的待测样品的高效液相色谱图；

图11C显示了以100％甲醇水溶液作为供试品的提取溶剂，获得的待测样品的高效液相色谱图；

图12A显示了以提取供试品后进行超声处理30min，获得的待测样品的高效液相色谱图；

图12B显示了以提取供试品后进行超声处理45min，获得的待测样品的高效液相色谱图；

图12C显示了以提取供试品后进行超声处理60min，获得的待测样品的高效液相色谱图；

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明一些实施方案中，本发明提供的黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法，包括以下步骤：

1)取黄蛭益肾胶囊待测样品的内容物，用甲醇溶解，超声处理，

2)取上清液过0.45μm的滤膜，取续滤液，得待测样品溶液；

3)利用高效液相色谱法对待测样品溶液进行检测，以获得色谱图，基于所述色谱图，获得黄蛭益肾胶囊中所含化学成分的种类和含量。

在本发明的一些实施方案中，所述内容物的浓度为0.08～0.12g/mL。

在本发明的一些实施方案中，所述超声处理时间为30～60min，所述超声处理功率100W，频率52kHz。

在本发明的一些实施方案中，所述高效液相色谱法的色谱条件如下所述：

色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

以乙腈作为流动相A，以0.05～0.1％磷酸水作为流动相B进行梯度洗脱，

所述梯度洗脱条件为：

时间(min)	A相(％)	B相(％)
			5	5	95
15	10	90
			25	15	85
35	20	80
			45	25	75
55	30	70
			65	35	65
75	40	60
			85	45	55

所述色谱柱为Waters

Shield RP18。

在本发明的一些实施方案中，所述色谱柱的柱温为28℃～32℃。

在本发明的一些实施方案中，所述流动相的流速为0.8～1.2mL/min。

在本发明的一些实施方案中，所述高效液相色谱法中检测波长为205-215nm。

在本发明的一些实施方案中，所述高效液相色谱法中进样体积8μL～12μL。

在本发明一些优选的实施方案中，本发明提供的黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法，包括以下步骤：

(1)取黄蛭益肾胶囊待测样品的内容物2g，精密称定，加入甲醇20mL，超声处理30min，超声处理功率100W，频率52kHz；

(2)取上清液过0.45μm的滤膜，取续滤液，得待测样品溶液；

(3)以Waters

Shield RP18(250mm×4.6mm，5μm)为色谱柱，以乙腈作为流动相A，以0.05％磷酸水作为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：

流速1.0mL/min，柱温30℃，进样体积10μL，检测波长：210nm。

1、仪器

赛默飞高效液相色谱仪UltiMate3000；XSE105型电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；Thermo Heraeus MultifugeX3离心机(赛默飞世尔科技公司)；KUDOS超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

2、试药

对照品8个：松脂醇二葡萄糖苷(批号:111537-20160501，纯度≥94.6％)，购自中国食品药品检定研究院；7,2'-二羟基-3',4-二甲氧基异黄烷(批号:Y28M10H84303，纯度≥98％)、黄芪异黄烷苷(批号:Y08S8H43409，纯度≥98％)、美迪紫檀甘(批号:P21N9F75533，纯度≥98％)，毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：Y27F9H54731，纯度≥98％)、刺芒柄花苷(批号：R28O8F46957，纯度≥98％)、毛蕊异黄酮(批号：Y24N9Y75652，纯度≥98％)购自上海源叶生物科技有限公司、芒柄花黄素(批号：MUST-18033005，纯度：99.03％)购自成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇、乙腈，色谱纯；磷酸，分析纯；水为超纯水。

黄芪、枸杞、杜仲、山药、玄参、薏苡仁、北沙参、车前子、墨旱莲、三七、益母草、牛膝原药材；缺黄芪阴性样品、缺枸杞阴性样品、缺杜仲阴性样品、缺山药阴性样品、缺玄参阴性样品、缺薏苡仁阴性样品、缺北沙参阴性样品、缺车前子阴性样品、缺墨旱莲阴性样品、缺三七阴性样品、缺益母草阴性样品、缺牛膝阴性样品以及黄蛭益肾胶囊16批由苏州雷允上药业有限公司提供。

实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、样液的制备

供试品溶液的制备：取黄蛭益肾胶囊粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇20mL，超声处理(功率100W，频率52kHz)30min，取出，放冷，上清液过0.45μm的滤膜，取续滤液，即得。

对照药材溶液制备：取黄芪、枸杞、杜仲、山药、玄参、薏苡仁、北沙参、车前子、墨旱莲、三七、益母草、牛膝药材粉末各2g，精密称定置具塞锥形瓶中，加甲醇10mL超声处理30min，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

对照品混合溶液的制备：取松脂醇二葡萄糖苷、7,2'-二羟基-3',4-二甲氧基异黄烷、黄芪异黄烷苷、美迪紫檀甘、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素、适量，精密称定，加甲醇制成对照品储备溶液。分别依次精密吸取上述对照品储备液适量加甲醇配制成每对照品混合溶液，即得。

阴性溶液制备：取缺黄芪阴性样品、缺枸杞阴性样品、缺杜仲阴性样品、缺山药阴性样品、缺玄参阴性样品、缺薏苡仁阴性样品、缺北沙参阴性样品、缺车前子阴性样品、缺墨旱莲阴性样品、缺三七阴性样品、缺益母草阴性样品、缺牛膝阴性样品各2g，精密称定，按供试品溶液方法分别制备阴性样品溶液

2、高效液相色谱检测

分别对供试品溶液的、对照药材溶液、对照品混合溶液、阴性溶液制进行高效液相色谱检测，检测条件如下：

以Waters

Shield RP18(250mm×4.6mm，5μm)为色谱柱，流动相A和流动相B按下表1进行梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温30℃，供试品溶液进样体积10μL，检测波长：210nm。

表1

时间(min)	A相(％)	B相(％)
			5	5	95
15	10	90
			25	15	85
35	20	80
			45	25	75
55	30	70
			65	35	65
75	40	60
			85	45	55

实施例2评价分析

利用实施例1方法进行如下评价分析：

1、精密度检测

取同一供试品溶液(批号：SC26007)，连续进样6次，测定。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2和表3，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.02～0.38％(n＝6)，相对峰面积的RSD为0.40～4.97％(n＝6)，表明仪器精密度良好。

表2各批次黄蛭益肾胶囊指纹图谱精密度试验共有峰相对保留时间(min)

表3各批次黄蛭益肾胶囊指纹图谱精密度试验共有峰相对峰面积

2、重复性试验

精密称取同一批样品(批号：SC26007)6份，每份2g，按照供试品溶液制备方法平行制备，注入液相色谱仪中。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表4、表5，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.01～0.24％(n＝6)，相对峰面积的RSD为1.34～5.35％(n＝6)，表明方法重复性良好。

表4黄蛭益肾胶囊指纹图谱重复性试验共有峰相对保留时间(min)

表5黄蛭益肾胶囊指纹图谱重复性试验共有峰相对峰面积

3、稳定性试验

取同一份供试品溶液(批号：SC26007)，分别在0、3、6、12、18、24h分别进样，测定。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表6、表7(两次重复测定)，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.01～0.24％(n＝6)，相对峰面积的RSD为1.16～5.57％(n＝6)，表明样品在24h内稳定。

表6黄蛭益肾胶囊指纹图谱稳定性试验共有峰相对峰面积

表7黄蛭益肾胶囊指纹图谱稳定性试验共有峰相对峰面积

4、耐用性试验

取同一份供试品溶液(批号：SC26007)，分别选取同一色谱柱Waters XBridgeShield RP18(250×4.6mm,5um)的不同批号进样，批号分别为0135383132、0136392001、0137392827，测进样定。计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表8、表9，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.03～0.39％(n＝3)，相对峰面积的RSD为0.69～6.94％(n＝3)。

表8黄蛭益肾胶囊指纹图谱耐用性试验共有峰相对保留时间(min)

表9黄蛭益肾胶囊指纹图谱耐用性试验共有峰相对峰面积

实施例3标准图谱的建立

取不同批号的黄蛭益肾胶囊，按照上述方法测定，得到16批黄蛭益肾胶囊的HPLC指纹图谱。导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》中进行数据处理，设定时间窗口0～85min，时间宽度0.1min，进行mark峰匹配，以平均数法生成黄蛭益肾胶囊的共有指纹图谱(见图1A)。选择稳定性较好、210nm下紫外吸收较强的色谱峰作为共有峰。结果见图1B，以及表10，共匹配得到25个共有峰，其中17号峰毛蕊异黄酮保留时间适中，峰面积较大，峰型较好，故选择为参照峰。16批样品的相似度在在0.925～0.999，相似度的平均值为0.9826。

表10黄蛭益肾胶囊样品指纹图谱相似度

实施例4主要色谱峰的药材归属

取供试品溶液、各药味的对照药材溶液、各药味的阴性溶液分别进样，按上述方法测定，对供试品色谱图中的共有峰进行归属。结果见图2-7，对照指纹图谱中8、11、13、14、17、21、22号峰来自黄芪；3、5、7、9、16、18号峰来自杜仲；10、15号峰来自玄参；12号峰来自三七；19号峰来自墨旱莲；其余峰可能来源于方中其他药味或多种药味共同贡献，或中间产物。

经过对照品进样对比，结果见图8，7号峰为松脂醇二葡萄糖苷，8号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，11号峰刺芒柄花苷，13号峰为美迪紫檀苷，14号峰为黄芪异黄烷苷，17号峰为毛蕊异黄酮，21号峰为芒柄花黄素，22号峰为7,2'-二羟基-3',4-二甲氧基异黄烷。

实施例5流动相的探索

在该实施例中，研究如下不同流动相对检测结果的影响，具体检测方法参见实施例1。

流动相1：乙腈为流动相A，水为流动相B；

流动相2：乙腈为流动相A，0.05％磷酸水为流动相B；

流动相3：乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B；

色谱图显示于图9A-9C，通过观察色谱峰形、分离效果等因素，发现利用乙腈-0.05％磷酸水或乙腈-0.1％磷酸水的流动相所得色谱峰形、响应及分离度均较好，尤其是选用乙腈-0.05％磷酸水作为流动相，获得的色谱图峰形和分离度更优良。

实施例6色谱柱的探索

由于供试品溶液中极性大的成分较多，所以优先考虑亲水性型色谱柱，分别选择Waters Atlantis T3(250×4.6mm，5um)、Inter Sustain AQ-C18(250×4.6mm，5um)、Waters Symmetry Shield RP18(250×4.6mm，5um)、Waters

Shield RP18(250×4.6mm，5um)在同一色谱条件下进样(与实施例1中色谱条件相同，不同之处仅在于采用不同的色谱柱)，结果见图10A-10D，表明Waters

Shield RP18(250×4.6mm，5um)色谱柱的分离效果最优，且峰数量相对其他色谱柱也更多。

实施例7提取溶剂的探索

分别采用50％甲醇水溶液、70％甲醇水溶液和100％甲醇作为提取溶剂(供试品溶液的制备过程同实施例1，不同之处仅在于采用不同的提取试剂)，检测器对供试品的色谱图检测结果的影响，结果显示于图11A-11C。通过对色谱图的观察，结果显示以100％甲醇作为提取溶剂时，样品色谱峰信息丰富，峰形更好(与实施例1中色谱条件相同)。

实施例8超声时间的选择

以甲醇为提取溶剂，分别比较超声30、45、60min对供试品色谱图的影响(供试品溶液的制备过程同实施例1，不同之处仅在于采用不同的超声时间，色谱条件同实施例1)，选择含量测定项下的四种黄酮类成分作为目标进行考察，结果显示于图12A-12C和表11，结果说明：不同的超声提取时间对色谱峰数目无显著影响，主要峰面积差异不大，为了节约时间，确定超声时间为30min。

表11

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (12)

1.一种黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法，其特征在于，包括：利用高效液相色谱法对黄蛭益肾胶囊样品进行检测；

其中，所述高效液相色谱法采用的流动相包括：

流动相A，所述流动相A选自乙腈；

流动相B，所述流动相B选自0.05～0.1％磷酸水溶液。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用如下梯度洗脱方式：

时间(min) A相(％) B相(％) 5 5 95 15 10 90 25 15 85 35 20 80 45 25 75 55 30 70 65 35 65 75 40 60 85 45 55

。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用的色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。

4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述色谱柱为Waters

ShieldRP18，尺寸250mm×4.6mm，5μm。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用的柱温为28℃～32℃。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用的流动相流速为0.8～1.2mL/min。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用的检测波长为205～215nm。

8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用的进样体积8μL～12μL。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述黄蛭益肾胶囊样品进行高效液相色谱检测之前，预先经过如下预处理；

1)将所述黄蛭益肾胶囊样品中的内容物与有机溶剂进行混合，得到溶解液；

2)将所述溶解液进行过滤，收集滤液，得待测样品溶液；

任选地，所述有机溶剂选自80～100体积％的甲醇溶液；

任选地，所述混合是在80～120W的功率、45～60kHz频率的超声中进行20～40min；

任选地，所述溶解液的浓度为0.08～0.12g/mL。

10.一种黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取黄蛭益肾胶囊待测样品的内容物2g，精密称定，加入甲醇20mL，超声处理30min，超声处理功率100W，频率52kHz；

(2)取上清液过0.45μm的滤膜，取续滤液，得待测样品溶液；

(3)以Waters

Shield RP18(250mm×4.6mm，5μm)为色谱柱，以乙腈作为流动相A，以0.05％磷酸水作为流动相B进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：

时间(min) A相(％) B相(％) 5 5 95 15 10 90 25 15 85 35 20 80 45 25 75 55 30 70 65 35 65 75 40 60 85 45 55

流速1.0mL/min，柱温30℃，进样体积10μL，检测波长：210nm。

11.权利要求1～10中任一项所述的黄蛭益肾胶囊指纹图谱测定方法在对黄蛭益肾胶囊进行质控中的应用。

12.一种黄蛭益肾胶囊的质量控制方法，其特征在于，包括：

采用权利要求1～10中任一项所述的测定方法测定黄蛭益肾胶囊样品中目标物含量；

基于所述目标物含量与阈值之间的关系，确定所述黄蛭益肾胶囊样品是否达标。

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