CN115184490B - 川蛭通络胶囊hplc标准指纹图谱的建立方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱的建立方法及其在检测川蛭通络胶囊质量的应用，包括对照品溶液制备、供试品溶液制备、HPLC测定、标准指纹图谱建立以及样品检测等步骤。本发明方法操作简便、稳定性高、重现性好，所得川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱，具有28个特征峰，能有效表征和控制川蛭通络胶囊的质量，有利于稳定产品质量，确保其内在质量的均一和稳定，保证临床用药的安全性和有效性。

Description

川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱的建立方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱的建立方法及其应用，属于中药制剂分析领域。
背景技术
“川蛭通络胶囊(国药准字Z20090031，鲁南厚普制药有限公司生产)”由水蛭、川芎、黄芪、丹参四味中药原料制备而成，具有活血化瘀、益气通络之功效，用于治疗中风病经络(脑梗塞)恢复期血虚气虚证，症见半身不遂、口舌歪斜、语言蹇涩或不语、偏身麻木、气短乏力、口角流涎、手足肿胀、舌黯或有瘀斑、苔薄白。
目前，国家部颁标准YBZ00482009中关于川蛭通络胶囊的现行含量检查项目是阿魏酸含测，水蛭、川芎、丹参和黄芪的薄层鉴别，以及常规检测等项目。中药复方制剂成分复杂，仅用薄层色谱法进行成分的定性鉴别和常规检测项目不足以全面反映川蛭通络胶囊的质量优劣。中药指纹图谱作为一项质量控制技术，能够较为全面的控制药品的质量，具有系统性、整体性和稳定性特点。目前，以指纹图谱控制川蛭通络胶囊质量的研究已有报道，但一次区分出28个特征峰的川蛭通络胶囊HPLC指纹图谱建立方法尚未见报道。
本发明公开了一种川蛭通络胶囊的HPLC指纹图谱建立方法，以及用该方法制作的川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱。在使用相似度进行评价的情况下，可用该标准指纹图谱对川蛭通络胶囊的质量进行全面地评价和控制，从而保证产品质量的稳定及临床用药的安全有效。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱的建立方法及其在评价川蛭通络胶囊质量中的应用，以解决现有川蛭通络胶囊质量评价方法不能较全面反映和制剂质量的不足。
为实现上述目的，本发明提供川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱的建立方法，包括供试品溶液制备、HPLC测定、标准指纹图谱建立；所述HPLC测定的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A、以醋酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；
按所述HPLC色谱条件对多批次川蛭通络胶囊供试品溶液进行HPLC测定，对各供试品的指纹图谱进行分析，生成由样品共有特征峰构成的川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱。
所述梯度洗脱条件为：
或
或
或
或
中的任一种。
优选地，所述流动相B以体积百分含量为0.8％-1.2％的醋酸溶液。
所述HPLC的紫外检测波长为254-268nm；流速为1mL/min；柱温为25-32℃；进样体积为5μL。
优选地，所述色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱，紫外检测波长为268nm；柱温为30℃。
进一步优选地，色谱柱规格为4.6×150mm，3.5μm；最佳地，色谱柱规格为4.6×250mm，5μm。
本发明供试品溶液的制备方法为：取川蛭通络胶囊内容物，加入甲醇溶液摇匀，超声，定容，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
优选地，供试品溶液的制备方法为：取川蛭通络胶囊内容物，加入体积百分含量为30％-100％的甲醇摇匀，超声30min，稀释定容，滤过，取续滤液，得浓度为0.02kg/L的供试品溶液。
优选地，所述梯度洗脱条件为：
在一种优选方案中，所述川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
Ⅰ.供试品溶液的制备
取川蛭通络胶囊内容物，研细，精密称定1g，置50mL容量瓶中，加入75％甲醇适量，超声30min，冷却，用75％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
Ⅱ.色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为1％醋酸水溶液为流动相B；梯度洗脱；检测波长：268nm；柱温：25-32℃；进样体积：5μL；流速：1mL/min。
按下表进行梯度洗脱：
Ⅲ.标准指纹图谱的建立
按所述HPLC色谱条件对多批次川蛭通络胶囊供试品溶液进行HPLC测定，采用软件(例如中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件)对各供试品的指纹图谱进行分析，生成由样品共有特征峰构成的川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱。
本发明的另一目的是提供由上述方法得到的川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱，所述HPLC标准指纹图谱由28个共有峰构成。
其中，3号峰为丹参素钠，9号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，10号峰为阿魏酸，14号峰为迷迭香酸，17号峰为参比峰丹酚酸B，24号峰为藁本内酯，27号峰为丹参酮IIA，28号峰为殴当归内酯A。
此外，2号峰、6号峰、8号峰、10号峰、11号峰、13号峰、15号峰、22号峰、23号峰、24号峰、25号峰、28号峰为川芎中的成分；9号峰、12号峰、18号峰、19号峰、21号峰为黄芪中的成分；3号峰、14号峰、16号峰、17号峰、26号峰、27号峰、28号峰为丹参中的成分，1号峰为水蛭、黄芪、丹参和川芎的共有成分，4号峰为丹参和川芎的共有成分，5号峰为水蛭、川芎和黄芪的共有成分。
以17号峰为参照峰，计算28个共有峰的相对保留时间依次为：0.073、0.079、0.084、0.106、0.111、0.120、0.182、0.205、0.319、0.373、0.562、0.680、0.721、0.733、0.777、0.823、1.000、1.113、1.166、1.443、1.583、1.804、1.907、2.318、2.382、2.872、3.361、3.393。
本发明的第三个目的是公开了按上述方法建立的HPLC标准指纹图谱在检测川蛭通络胶囊质量的应用。
所述应用包括以下步骤：按上述方法建立川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱；取川蛭通络胶囊待检样品，按上述HPLC测定同法操作，得到川蛭通络胶囊待检样品指纹图谱，采用软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》，对所得川蛭通络胶囊待检样品指纹图谱和上述HPLC标准指纹图谱进行相似度对比分析。可以根据相似度判断川蛭通络胶囊待检样品质量。本发明通过大量实验验证，相似度大于0.995可判断为待检样品合格。
在一种优选方案中，所述的应用包括以下步骤：
Ⅰ.供试品溶液的制备
取川蛭通络胶囊内容物，研细，精密称定1g，置50mL容量瓶中，加入75％甲醇适量，超声30min，冷却，用75％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
Ⅱ.色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为1％醋酸水溶液为流动相B；梯度洗脱；检测波长：268nm；柱温：30℃；进样体积：5μL；流速：1mL/min。
按下表进行梯度洗脱：
Ⅲ.标准指纹图谱的建立
按所述HPLC色谱条件对多批次川蛭通络胶囊供试品溶液进行HPLC测定，采用软件(例如中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件)对各供试品的指纹图谱进行分析，生成由样品共有特征峰构成的川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱。
Ⅳ.样品检测
取川蛭通络胶囊待检样品，按上述HPLC测定同法操作，得到川蛭通络胶囊待检样品指纹图谱，采用软件(例如中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件)对所得川蛭通络胶囊待检样品指纹图谱和上述HPLC标准指纹图谱进行比对分析。
进一步地，所述的应用还包括对照品溶液的制备：精密称取丹参素钠、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、丹参酮IIA、殴当归内酯A对照品适量，加75％甲醇稀释溶解至每1mL含58.88μg、51.14μg、16.44μg、61.09μg、217.80μg、85.21μg、8.72μg、76.28μg上述对照品的对照品溶液。
将上述各供试品溶液HPLC指纹图谱、待检样品溶液HPLC指纹图谱或HPLC标准指纹图谱分别与所述对照品溶液HPLC指纹图谱进行对比，可以快速判断所述各供试品溶液或待检样品溶液是否含有川蛭通络胶囊标志性成分丹参素钠、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、迷迭香酸、参比峰丹酚酸B、藁本内酯、丹参酮IIA和殴当归内酯A，可以同时测定28种成分，以快速判断川蛭通络胶囊质量，方法简便稳定可靠、省时省力。
在中药生产和流通中，还没有一种质量控制手段能够全面地、综合地反映出中药产品的质量变异，有效地用于全过程的质量控制。通过对川蛭通络胶囊的系统研究，证明采用高效液相色谱方法用指纹图谱作为指控标准是可行的。通过与川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱的相似度对比，发现质量变异和缺陷，从而全面、特异地把控川蛭通络胶囊的质量，保证患者用药的安全性和有效性。
与现有技术相比，本发明的技术方案取得了以下有益技术效果：
1.本发明川蛭通络胶囊HPLC指纹图谱的建立方法精密度高、重现性好，且分离度良好，稳定性高，能较为全面、准确地评价制剂的质量，可用于川蛭通络胶囊的真伪鉴别和质量过程控制，对川蛭通络胶囊的现代化生产具有良好的科学指导意义。
2.本发明检测方法以丹酚酸B为参比峰，确定28个共有峰为构成川蛭通络胶囊标准指纹图谱的主要特征峰，指纹图谱的组成更加丰富、全面；从共有峰中鉴定出丹参素钠、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、丹参酮IIA和殴当归内酯A等8种化学成分，并对其进行成分归属，进一步阐明了川蛭通络胶囊的化学物质基础。
3.本发明指纹图谱在川蛭通络胶囊质量评价中的应用，通过对比所得标准指纹图谱中共有峰的有无，可对制剂的质量进行较为全面的评价，更有效的保证成品的质量，可克服现有技术检测指标单一，不能反映川蛭通络胶囊内在质量不足的问题。
附图说明
图1为实施例1中12批川蛭通络胶囊的HPLC指纹图谱(即图1中曲线S1-S12)；
图2为实施例1川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱(1-28为28个共有特征峰)；
图3为实施例1对照品溶液的HPLC指纹图谱(其中，第3、9、10、14、17、24、27、28号峰为特征峰)；
图4为实施例1单味药供试品溶液HPLC指纹图谱；
图5为实施例2中12批川蛭通络胶囊的HPLC指纹图谱(即图1中曲线S1-S12)；
图6为实施例2川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱(1-28为28个共有特征峰)；
图7为实施例3中12批川蛭通络胶囊的HPLC指纹图谱(即图1中曲线S1-S12)；
图8为实施例3川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱(1-28为28个共有特征峰)；
图9为实施例4中12批川蛭通络胶囊的HPLC指纹图谱(即图1中曲线S1-S12)；
图10为实施例4川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱(1-28为28个共有特征峰)；
图11为实施例5中12批川蛭通络胶囊的HPLC指纹图谱(即图1中曲线S1-S12)；
图12为实施例5川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱(1-28为28个共有特征峰)。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不用来限制本发明的范围，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，所做的显而易见的修饰及改进也属于本发明的保护范围。若未特别指明，所用原料均为市售商品。
实施例1川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
Waters Acquity Arc高效液相色谱仪(2998PDA检测器，美国)，四元超高压梯度泵，Empower色谱工作站。
1.2试药
川蛭通络胶囊由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表1。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
表1川蛭通络胶囊测试样品批号
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备
精密称取丹参素钠、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、丹参酮IIA、殴当归内酯A对照品适量，加75％甲醇稀释溶解至每1mL含58.88μg、51.14μg、16.44μg、61.09μg、217.80μg、85.21μg、8.72μg、76.28μg上述对照品的对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备
取川蛭通络胶囊内容物，研细，精密称定1g，置50mL容量瓶中，加入75％甲醇适量，超声30min，冷却，用75％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3单味药供试品溶液的制备
按川蛭通络胶囊处方工艺制得川芎、黄芪、丹参、水蛭单味药提取液，照“2.2”项下供试品溶液制备方法，分别制成单味药供试品溶液。
2.4色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为1％醋酸水溶液为流动相B；梯度洗脱；检测波长：268nm；柱温：30℃；进样体积：5μL；流速：1mL/min。
按下表进行梯度洗脱：
2.5指纹图谱的建立
取12个批号川蛭通络胶囊样品，按“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.4”项下方法进行检测分析，得12批样品色谱叠加图(附图1)。将12个批号的川蛭通络胶囊HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》进行色谱峰匹配，拟合生成标准指纹图谱(附图2)。
所得标准指纹图谱包含28个共有特征峰，以色谱图中峰形及分离度均较好、左右无干扰色谱峰且响应值较高的17号峰为参照峰S峰，计算28个特征峰与S峰的相对保留时间依次为0.073、0.079、0.084、0.106、0.111、0.120、0.182、0.205、0.319、0.373、0.562、0.680、0.721、0.733、0.777、0.823、1.000、1.113、1.166、1.443、1.583、1.804、1.907、2.318、2.382、2.872、3.361、3.393min；峰面积依次为23.72、2.66、2.09、2.39、2.90、13.94、2.07、4.73、8.94、23.83、6.64、37.55、3.09、5.56、7.42、9.04、100.00、4.42、6.42、6.30、2.80、5.01、43.82、176.49、17.91、11.70、13.41、14.97。具体见表2和表3。
表2 12批川蛭通络胶囊共有峰的相对保留时间(min)
表3 12批川蛭通络胶囊共有峰的相对峰面积
2.6相似度评价
将12个批号的川蛭通络胶囊HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》与标准指纹图谱进行对比，相似度计算结果依次为：0.995、0.995、0.998、0.995、0.998、0.996、0.995、0.995、0.998、0.996、0.998、0.996。相似度均在0.995以上，表明各样品批间质量稳定性和均一性良好。
2.7共有峰的归属与指认
取对照品溶液和单味药供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行分析，得对照品溶液(附图3)和单味药供试品溶液(附图4)指纹图谱。经对照品保留时间定位及色谱峰分析，指认出3号峰为丹参素钠，9号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，10号峰为阿魏酸，14号峰为迷迭香酸，17号峰为参比峰丹酚酸B，24号峰为藁本内酯，27号峰为丹参酮IIA，28号峰为殴当归内酯A。其中，2号峰、6号峰、8号峰、10号峰、11号峰、13号峰、15号峰、22号峰、23号峰、24号峰、25号峰、28号峰为川芎中的成分；9号峰、12号峰、18号峰、19号峰、21号峰为黄芪中的成分；3号峰、14号峰、16号峰、17号峰、26号峰、27号峰、28号峰为丹参中的成分，1号峰为水蛭、黄芪、丹参和川芎的共有成分，4号峰为丹参和川芎的共有成分，5号峰为水蛭、川芎和黄芪中共有成分。
2.8方法学考察
2.8.1精密度试验
取川蛭通络胶囊样品(批号：16210011)，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样6针，按“2.4”项下色谱条件进行测定，考察精密度。以17号峰为参照峰，计算出1-28号共有峰的相对保留时间(表4)和相对峰面积(表5)的RSD值均小于2％，同时用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器稳精密度良好。
表4同批次川蛭通络胶囊的相对保留时间
表5同批川蛭通络胶囊的相对峰面积
2.8.2稳定性试验
取川蛭通络胶囊样品(批号：16210011)，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、16、20、24h进样，按“2.4”项下色谱条件进行检测，以17号峰为参照峰，计算出1-28号共有峰的相对保留时间(表6)和相对峰面积(表7)的RSD值均小于2％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在24小时内稳定。
表6同批次不同时间川蛭通络胶囊的相对保留时间
表7同批次不同时间川蛭通络胶囊的相对峰面积
2.4.3重现性试验
取川蛭通络胶囊样品(批号：16210011)，分别精密量取6份，按照“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，考察重复性。以17号峰为参照峰，计算1-28号共有峰的相对保留时间(表8)和相对峰面积(表9)的RSD值均小于2％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重现性良好。
表8 6份同批阳春口服液供试品的相对保留时间
表9 6份同批阳春口服液供试品的相对峰面积
实施例2川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
同实施例1。
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备
精密称取丹参素钠、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、丹参酮IIA、殴当归内酯A对照品适量，30％甲醇稀释溶解至每1mL含58.88μg、51.14μg、16.44μg、61.09μg、217.80μg、85.21μg、8.72μg、76.28μg上述对照品的对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备
取川蛭通络胶囊内容物，研细，精密称定1g，置50mL容量瓶中，加入30％甲醇适量，超声30min，冷却，用30％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3单味药供试品溶液的制备
按川蛭通络胶囊处方工艺制得川芎、黄芪、丹参、水蛭单味药提取液，照“2.2”项下供试品溶液制备方法，分别制成单味药供试品溶液。
2.4HPLC色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为1％醋酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
检测波长：258nm；柱温：25℃；进样体积：5μL；流速：1mL/min。
2.3指纹图谱的建立
取12个批号川蛭通络胶囊样品，按“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.4”项下方法进行检测分析，得12批样品色谱叠加图(附图5)。将12个批号的川蛭通络胶囊HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》进行色谱峰匹配，拟合生成标准指纹图谱(附图6)。以17号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的28个共有峰的相对保留时间分别为：0.075、0.080、0.084、0.106、0.111、0.120、0.155、0.182、0.206、0.318、0.374、0.561、0.681、0.734、0.777、0.824、1.000、1.112、1.162、1.217、1.522、1.775、2.05、2.09、2.558、2.640、3.167、3.210。
实施例3川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
同实施例1。
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备
精密称取丹参素钠、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、丹参酮IIA、殴当归内酯A对照品适量，45％甲醇稀释溶解至每1mL含58.88μg、51.14μg、16.44μg、61.09μg、217.80μg、85.21μg、8.72μg、76.28μg上述对照品的对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备
取川蛭通络胶囊内容物，研细，精密称定1g，置50mL容量瓶中，加入45％甲醇适量，超声30min，冷却，用45％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3单味药供试品溶液的制备
按川蛭通络胶囊处方工艺制得川芎、黄芪、丹参、水蛭单味药提取液，照“2.2”项下供试品溶液制备方法，分别制成单味药供试品溶液。
2.4色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm，3.5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.8％醋酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
检测波长：260nm；柱温：27℃；进样体积：5μL；流速：1mL/min。
2.3指纹图谱的建立
取12个批号川蛭通络胶囊样品，按“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.4”项下方法进行检测分析，得12批样品色谱叠加图(附图7)。将12个批号的川蛭通络胶囊HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》进行色谱峰匹配，拟合生成标准指纹图谱(附图8)。以17号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的28个共有峰的相对保留时间分别为：0.075、0.080、0.084、0.106、0.111、0.120、0.155、0.182、0.206、0.318、0.373、0.561、0.680、0.733、0.776、0.823、1.000、1.112、1.169、1.219、1.422、1.542、1.819、2.153、2.205、2.670、3.126、3.151。
实施例4川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
同实施例1。
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备
精密称取丹参素钠、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、丹参酮IIA、殴当归内酯A对照品适量，60％甲醇稀释溶解至每1mL含58.88μg、51.14μg、16.44μg、61.09μg、217.80μg、85.21μg、8.72μg、76.28μg上述对照品的对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备
取川蛭通络胶囊内容物，研细，精密称定1g，置50mL容量瓶中，加入60％甲醇适量，超声30min，冷却，用60％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3单味药供试品溶液的制备
按川蛭通络胶囊处方工艺制得川芎、黄芪、丹参、水蛭单味药提取液，照“2.2”项下供试品溶液制备方法，分别制成单味药供试品溶液。
2.4色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为1.2％醋酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
检测波长：268nm；柱温：30℃；进样体积：5μL；流速：1mL/min。
2.3指纹图谱的建立
取12个批号川蛭通络胶囊样品，按“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.4”项下方法进行检测分析，得12批样品色谱叠加图(附图9)。将12个批号的川蛭通络胶囊HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》进行色谱峰匹配，拟合生成标准指纹图谱(附图10)。以17号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的28个共有峰的相对保留时间分别为：0.075、0.080、0.084、0.106、0.112、0.120、0.155、0.181、0.206、0.318、0.374、0.560、0.681、0.734、0.777、0.824、1.000、1.112、1.164、1.224、1.423、1.569、1.876、2.263、2.324、2.783、3.114、3.127。
实施例5川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
同实施例1。
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备
精密称取丹参素钠、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、丹参酮IIA、殴当归内酯A对照品适量，100％甲醇稀释溶解至每1ml含58.88μg、51.14μg、16.44μg、61.09μg、217.80μg、85.21μg、8.72μg、76.28μg上述对照品的对照品溶液。
2.2供试品溶液的制备
取川蛭通络胶囊内容物，研细，精密称定1g，置50mL容量瓶中，加入100％甲醇适量，超声30min，冷却，用100％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.3单味药供试品溶液的制备
按川蛭通络胶囊处方工艺制得川芎、黄芪、丹参、水蛭单味药提取液，照“2.2”项下供试品溶液制备方法，分别制成单味药供试品溶液。
2.4色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm，3.5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为1％醋酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
检测波长：254nm；柱温：32℃；进样体积：5μL；流速：1mL/min。
2.3指纹图谱的建立
取12个批号川蛭通络胶囊样品，按“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.4”项下方法进行检测分析，得12批样品色谱叠加图(附图11)。将12个批号的川蛭通络胶囊HPLC指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》进行色谱峰匹配，拟合生成标准指纹图谱(附图12)。以17号峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的28个共有峰的相对保留时间分别为：0.075、0.080、0.084、0.106、0.112、0.120、0.155、0.181、0.206、0.317、0.373、0.560、0.680、0.733、0.777、0.823、1.000、1.112、1.165、1.434、1.585、1.910、2.321、2.384、2.911、3.277、3.298。
以上实施例仅是本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理及构思的前提下，还可以做出若干修饰和改进，这些也应都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.川蛭通络胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，包括供试品溶液制备、对照品溶液制备、HPLC测定、标准指纹图谱建立，其特征在于，所述HPLC测定的色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A、醋酸溶液为流动相B进行梯度洗脱；所述对照品为丹参素钠、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、丹参酮IIA、欧当归内酯A；
按所述HPLC色谱条件对多批次川蛭通络胶囊供试品溶液进行HPLC测定，对各供试品的指纹图谱进行分析，生成由样品共有特征峰构成的川蛭通络胶囊HPLC标准指纹图谱；
所述梯度洗脱条件为：
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱，规格4.6×250mm，5μm，按下表进行梯度洗脱：
或色谱柱：Agilent Eclipse XDB- C18柱，规格4.6×150mm，3.5μm，按下表进行梯度洗脱：
或色谱柱：Agilent Eclipse XDB- C18柱，规格4.6×250mm，5μm，按下表进行梯度洗脱：
或色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱，规格4.6×150mm，3.5μm，按下表进行梯度洗脱：
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相B以体积百分含量为0.8%-1.2%的醋酸溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，紫外检测波长为254-268 nm；流速为1 mL/min；柱温为25-32 ℃；进样体积为5 µL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱，紫外检测波长为268 nm；柱温为30 ℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法为：取川蛭通络胶囊内容物，加入甲醇溶液摇匀，超声，定容，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法为：取川蛭通络胶囊内容物，加入体积百分含量为30%-100%的甲醇摇匀，超声30min，稀释定容，滤过，取续滤液，得浓度为0.02 kg/L的供试品溶液。
7.权利要求1-6中任一项所述方法建立的HPLC标准指纹图谱在检测川蛭通络胶囊质量的应用。
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