CN112798721B - 一种治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药检测技术领域，具体涉及一种治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法及应用，步骤：供试品溶液：取适量治疗颈椎病中药制剂，先后用纯水和甲醇超声提取，合并提取液得到供试品溶液；混合对照品溶液：精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1等11种对照品，加入甲醇配置成混合对照品溶液；测定：分别精密量取供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，采用梯度洗脱，记录色谱图；用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱。所构建的指纹图谱能够更加全面反应治疗颈椎病中药制剂的质量信息，具有快捷、稳定、精密度高、重现性强等优点，能够用于该类制剂的质量控制；方法简便、重现性好。

Description

一种治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法及应用

技术领域

本发明涉及医药检测技术领域，具体涉及一种治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法及应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

中药现行的定量评价方法利用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分、活性成分或指标成分，而大多数品种仅有一般的检查项目。中药因其组分复杂，化学成分具有多样性和复杂性，一直是质量评价的重点与难点。

中药指纹图谱指中药经适当处理后，采用一定的分析方法得到的能够体现中药整体特性的图谱，目的在于反应中药多成分特点，整体控制中药质量，确保其内在质量的均一、稳定。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法。近年来，由于色谱技术的迅速发展和检测能力的大大提高，为指纹图谱的研究和应用提供了良好的技术保证，中药指纹图谱对促进中药材的现代化发展和提高中药材及中药制剂的质量具有重要意义。

治疗颈椎病中药制剂由三七、川芎、延胡索、羌活、白芍、威灵仙、葛根七味药制成，其中三七、川芎、延胡索起到活血行气、散瘀通络的作用；羌活、威灵仙、葛根有祛风寒湿邪外出、缓解颈项强紧的功效；而白芍则着力于养血柔阴、濡养筋脉，主要功效是“活血化瘀、行气止痛”。用于神经根型颈椎病属血瘀气滞、脉络闭阻证。

中国药典第一部(2020版)收载了颈痛颗粒的质量标准。该标准仅有薄层色谱法结合对照品延胡索乙素、紫花前胡苷、芍药苷、齐墩果酸和对照药材川芎、葛根对颈痛颗粒进行鉴别，采用高效液相色谱法测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量。

发明专利CN111999423A公开了一种颈痛颗粒指纹图谱的建立方法及其应用，该方法以三七皂苷R1、延胡索乙素及齐墩果酸为混合标准品，构建了颈痛颗粒的指纹图谱，但是该方法为颈痛颗粒指纹图谱建立方法，不能全面代表该类制剂的质量控制能力，并且覆盖面较窄，代表性不强。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，发明人在前述研究的基础上进一步改进和优化技术方案，针对治疗颈椎病的中药制剂提供一种指纹图谱构建方法，所构建的指纹图谱能够更加全面反应该类制剂的质量信息，具有快捷、稳定、精密度高、重现性强等优点，能够用于该类制剂的质量控制。

本发明的目的之一是提供一种治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法，相对于现有技术中采用三七皂苷R1、延胡索乙素及齐墩果酸三种成分作为标准品，本发明中以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、阿魏酸、延胡索乙素、羌活醇、芍药苷、齐墩果酸、阿魏酸苯乙醇酯、异欧前胡素、镰叶芹二醇11种成分为混合标准品，覆盖面广，代表性强。

本发明的目的之二是通过上述方法构建的指纹图谱的应用，通过检测获得待测治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱，用来进行治疗颈椎病中药制剂的质量控制。

本发明的目的之三在于提供一种治疗颈椎病中药制剂的质量控制方法。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

在本发明的第一方面，提供一种治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法，包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：取适量治疗颈椎病中药制剂，研磨成细粉，先用纯水超声提取，然后使用甲醇超声提取，合并提取液得到供试品溶液；

（2）混合对照品溶液制备：精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、阿魏酸、延胡索乙素、羌活醇、芍药苷、齐墩果酸、阿魏酸苯乙醇酯、异欧前胡素、镰叶芹二醇11种对照品，加入甲醇配置成混合对照品溶液；

（3）测定：分别精密量取步骤（1）制备得到的供试品溶液和步骤（2）制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，流动相为0.1％磷酸水溶液-乙腈，采用梯度洗脱，记录色谱图；用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱。

在本发明的第二方面，提供一种第一方面所述构建方法和/或第一方面所述构建方法得到的指纹图谱在治疗颈椎病中药制剂质量控制中的应用。

所述治疗颈椎病中药制剂包括颈痛颗粒、颈痛片和颈痛胶囊；

在本发明的第三方面，提供一种治疗颈椎病中药制剂的质量控制方法，包括以下步骤：

（1）取多个批次的治疗颈椎病中药制剂按上述构建方法得到治疗颈椎病中药制剂样品的指纹图谱，将该多个批次治疗颈椎病中药制剂样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；

取待测样品制备供试品溶液，按照上述构建方法的步骤进行操作，获得待检测样品指纹图谱；

（2）将待测样品指纹图谱与治疗颈椎病中药制剂对照指纹图谱进行相似性比较，以评价待测治疗颈椎病中药制剂的质量，计算方法为相关系数法。

本发明的具体实施方式具有以下有益效果：

本发明具体实施方式中采用具体的11种对照品，覆盖面广，代表性强，所构建的指纹图谱能够更加全面反应治疗颈椎病中药制剂的质量信息，具有快捷、稳定、精密度高、重现性强等优点，能够用于该类制剂的质量控制；

本发明具体实施方式中对治疗颈椎病中药制剂的处理方法能够使得其中的有效成分更好得溶出，使得检测见过更加精确；

能更加全面地表征治疗颈椎病中药制剂的质量，更有利于指导该类产品生产和临床用药，确保临床用药的安全性和有效性；方法简便、重现性好。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中混合对照品的指纹图谱；

图2为本发明实施例1中颈痛系列产品的指纹图谱；

图3为本发明实施例1中15批次颈痛系列产品（颈痛颗粒5批次、颈痛片5批次、颈痛胶囊5批次）的指纹图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术中论述的，发明人研究发现，现有技术中建立的指纹图谱特征峰难以全面反映产品的整体质量特征，无法从整体上控制产品的质量。鉴于此，本发明提供一种治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法及其应用。

本发明的一种实施方式中，提供了一种治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法，包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：取适量治疗颈椎病中药制剂，研磨成细粉，先用纯水超声提取，然后使用甲醇超声提取，合并提取液得到供试品溶液；

（2）混合对照品溶液制备：精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、阿魏酸、延胡索乙素、羌活醇、芍药苷、齐墩果酸、阿魏酸苯乙醇酯、异欧前胡素、镰叶芹二醇11种对照品，加入甲醇配置成混合对照品溶液；

（3）测定：分别精密量取步骤（1）制备得到的供试品溶液和步骤（2）制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，流动相为0.1％磷酸水溶液-乙腈，采用梯度洗脱，记录色谱图；用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱。

优选的，所述治疗颈椎病中药制剂包括颈痛颗粒、颈痛片和颈痛胶囊。

优选的，供试品溶液制备的具体步骤为：取治疗颈椎病中药制剂适量，研成细粉，取细粉精密称定，加入纯化水超声提取；提取完成后离心，得上清液1；沉淀物中加入甲醇，继续超声提取，提取完成后离心，得上清液2；将上清液1与上清液2转移至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液；

所述制备方法可以增加样品中有效成分溶出量，使得后续的高效液相色谱分析能够出峰更加明显，使检测结果更加精确。

进一步优选的，超声提取的条件为：时间30min，提取功率300W，频率40kHz；

进一步优选的，离心条件为：10000转/分，15分钟；

优选的，步骤（2）中加入的甲醇为50%色谱甲醇。

优选的，步骤（3）中采用的色谱柱为：Waters Symmetry Shield RP18 (4 .6mm×250mm，5μm)；

优选的，流动相为0 .1％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；

优选的，梯度洗脱条件为：0～3min，95％A→95％A；3～15min，95％A→85％A；15～20min，85％A→85％A；20～45min，85％A→70％A；45～60min，70％A→ 70％A；60～75min，70％A→10％A；75～85min，10％A→10％A。

优选的，流动相流速为1ml/min；柱温为35℃；检测波长为250nm，进样量20μl。

本发明的一种实施方式中，提供了一种上述构建方法和/或第一方面所述构建方法得到的指纹图谱在治疗颈椎病中药制剂质量控制中的应用；

优选的，所述治疗颈椎病中药制剂包括颈痛颗粒、颈痛片和颈痛胶囊。

本发明的一种实施方式中，提供了一种治疗颈椎病中药制剂的质量控制方法，包括以下步骤：

（1）取多个批次的治疗颈椎病中药制剂按上述构建方法得到治疗颈椎病中药制剂样品的指纹图谱，将该多个批次治疗颈椎病中药制剂样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；

取待测样品制备供试品溶液，按照上述构建方法的步骤进行操作，获得待检测样品指纹图谱；

（2）将待测样品指纹图谱与治疗颈椎病中药制剂对照指纹图谱进行相似性比较，以评价待测治疗颈椎病中药制剂的质量，计算方法为相关系数法。

实施例1

1.仪器与试剂：

岛津(LC-2040C 3D)高效液相色谱仪；赛多利斯十万分之一电子分析天平；指纹图谱相似度评价软件为“中药色谱指纹相似度评价系统”(国家药典委员会2004A版)；KQ-1000DE型数控超声波仪； Waters Symmetry Shield RP18 (4 .6mm× 250mm，5μm)色谱柱；人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、阿魏酸、延胡索乙素、羌活醇、芍药苷、齐墩果酸、阿魏酸苯乙醇酯、异欧前胡素、镰叶芹二醇对照品均购于中国食品药品检定研究院；磷酸、甲醇(色谱纯，天津康科德)；乙腈(色谱纯，天津康科德)；实验用水为超纯水(18MΩ)；颈痛系列样品（颈痛颗粒5批次、颈痛片5批次、颈痛胶囊5批次）取自山东明仁福瑞达制药股份有限公司。

2. 试验方法：

2.1供试品溶液制备：取颈痛系列样品适量，研成细粉，取细粉1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入10ml纯化水，超声提取30min(提取功率300W，频率40kHz)，摇匀，离心（10000转/分，15分钟），得上清液1；沉淀物中加入10ml甲醇，继续超声提取30min(提取功率300W，频率40kHz)，摇匀，离心（10000转/分，15分钟），得上清液2；将上清液1与上清液2转移至25ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0 .22μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，备用。

2.2 混合对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、阿魏酸、延胡索乙素、羌活醇、芍药苷、齐墩果酸、阿魏酸苯乙醇酯、异欧前胡素、镰叶芹二醇对照品各10mg置10ml容量瓶中，加50%色谱甲醇超声溶解并稀释至刻度，配置混合标准品溶液。

2.3 色谱条件：

色谱柱：Waters Symmetry Shield RP18 (4 .6mm× 250mm，5μm)；流动相：0 .1％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脱：0～3min，95％A→95％A；3～15min，95％A→85％A；15～20min，85％A→85％A；20～45min，85％A→70％A；45～60min，70％A→ 70％A；60～75min，70％A→10％A；75～85min，10％A→10％A；流动相流速为1ml/min；柱温为35℃；检测波长为250nm，进样量20μL。

3. 结果与讨论：

3.1指纹图谱的比较：

用指纹图谱软件对所得图谱进行分析处理，即得各批次颈痛系列产品指纹图谱。图谱共有30个共有特征峰。混合对照品的指纹图谱如图1所示，通过与混合对照品色谱图比较，确认1号峰为齐墩果酸，2号峰为芍药苷，3号峰为三七皂苷R1，4号峰为羌活醇，5号峰为阿魏酸，6号峰为阿魏酸苯乙醇酯，7号峰为人参皂苷Rg1，8号峰为异欧前胡素，9号峰为镰叶芹二醇，10号峰为人参皂苷Rb1，11号峰为延胡索乙素。

测得15批次颈痛系列产品的指纹图谱见附图3；将所测的15批次颈痛系列产品图谱导入“中药色谱指纹相似度评价系统”软件分析，进行色谱峰匹配。以附图1作为参照图谱，生成的指纹图谱为图2。各批次样品的指纹图谱与对照指纹图谱以及各样品之间指纹图谱的相似度结果见表1 。

表1. 15个批次指纹图谱的相似度值

由表1中可以看出，各批次样品与R的相似度均在0 .900以上，说明颈痛颗粒各批次样品的化学组成总体上较为相近。

3.2方法学考察：

方法学考察主要考察了精密度、稳定性和重复性，考察方法和结果如下：

（1）精密度实验取同一批次颈痛片样品，在上述色谱条件下，连续测定6次，记录色谱图，结果见表2。由表2可知，各共有峰相对保留时间和相对峰的RSD均小于3％，说明仪器精密度良好。

（2）稳定性实验取同一批次颈痛片样品，在上述色谱条件下，分别于0h，2h，4h，8h，12h和24h进样分析，记录色谱图，结果见表2。由表2可见，各共有峰相对保留时间和相对峰的RSD均小于3％，说明供试品溶液成分在24h内稳定。

（3）重复性实验取同一批次的颈痛片样品，在上述色谱条件下，分别进样分析，记录色谱图，结果见表2，各共有峰相对保留时间和相对峰的RSD均小于3％，说明该实验方法具有较佳的重复性。

表2 颈痛片精密度、重复性、稳定性试验数据对比

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：取适量治疗颈椎病中药制剂，研磨成细粉，先用纯水超声提取，然后使用甲醇超声提取，合并提取液得到供试品溶液；

（2）混合对照品溶液制备：精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、阿魏酸、延胡索乙素、羌活醇、芍药苷、齐墩果酸、阿魏酸苯乙醇酯、异欧前胡素、镰叶芹二醇11种对照品，加入甲醇水溶液配置成混合对照品溶液；

（3）测定：分别精密量取步骤（1）制备得到的供试品溶液和步骤（2）制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，流动相为0.1％磷酸水溶液-乙腈，采用梯度洗脱，记录色谱图；用指纹图谱软件对所得图谱进行处理，即得治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱；

供试品溶液制备的具体步骤为：取治疗颈椎病中药制剂适量，研成细粉，取细粉精密称定，加入纯化水超声提取；提取完成后离心，得上清液1；沉淀物中加入甲醇，继续超声提取，提取完成后离心，得上清液2；将上清液1与上清液2转移至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液；

步骤（3）中采用的色谱柱为：Waters Symmetry Shield RP18；流动相为A相：0 .1％磷酸水溶液，B相乙腈；

梯度洗脱条件为：0～3 min，95％A→95％A；3～15 min，95％A→85％A；15～20 min，85％A→85％A；20～45 min，85％A→70％A；45～60 min，70％A→ 70％A；60～75 min，70％A→10％A；75～85 min，10％A→10％A；

所述治疗颈椎病中药制剂包括颈痛颗粒、颈痛片和颈痛胶囊。

2.如权利要求1所述的治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，超声提取的条件为：时间30 min，提取功率300 W，频率40 kHz；

离心条件为：10000转/分，15分钟。

3.如权利要求1所述的治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，步骤（2）中加入的甲醇水溶液 为50%色谱甲醇。

4.如权利要求1所述的治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，流动相流速为1 ml/min；柱温为35℃；检测波长为250 nm，进样量20 μl。

5.权利要求1所述的治疗颈椎病中药制剂的指纹图谱构建方法和/或所述构建方法得到的指纹图谱在治疗颈椎病中药制剂质量控制中的应用；

所述治疗颈椎病中药制剂包括颈痛颗粒、颈痛片和颈痛胶囊。

6.一种采用如权利要求1-5任一项所述的指纹图谱对治疗颈椎病中药制剂的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取多个批次的治疗颈椎病中药制剂按权利要求1-5任一项所述的构建方法得到治疗颈椎病中药制剂样品的指纹图谱，将该多个批次治疗颈椎病中药制剂样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；

取待测样品制备供试品溶液，按照上述构建方法的步骤进行操作，获得待检测样品指纹图谱；

（2）将待测样品指纹图谱与治疗颈椎病中药制剂对照指纹图谱进行相似性比较，以评价待测治疗颈椎病中药制剂的质量，计算方法为相关系数法。

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