CN111999423B - 一种颈痛颗粒指纹图谱的建立方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种颈痛颗粒指纹图谱的建立方法及其应用，属于医药检测技术领域。本发明基于HPLC技术采用梯度洗脱的方法建立了颈痛颗粒的指纹图谱，该方法操作简单，稳定可靠，精密度高，分离度好，指纹图谱的稳定性和重现性较好，且信息量大，能够充分反映颈痛颗粒整体化学成分的信息；本发明既避免了因只测定单一化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，同时通过对多个批次的样品进行系统分析，从而能够更加全面、科学评价颈痛颗粒的质量，从而保证产品的质量和疗效，为颈痛颗粒的质量控制提供了良好的解决方案，因此极具实际应用之价值。

Description

一种颈痛颗粒指纹图谱的建立方法及其应用

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种颈痛颗粒指纹图谱的建立方法及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

颈痛颗粒根据孙树椿教授的组方制成，是国内首个专业治疗神经根型颈椎病的国家级新药、山东省自主创新产品、国家重点新产品。该药由三七、川芎、延胡索、羌活、白芍、威灵仙、葛根七味药制成，其中三七、川芎、延胡索起到活血行气、散瘀通络的作用；羌活、威灵仙、葛根有祛风寒湿邪外出、缓解颈项强紧的功效；而白芍则着力于养血柔阴、濡养筋脉，主要功效是“活血化瘀、行气止痛”。用于神经根型颈椎病属血瘀气滞、脉络闭阻证。

目前，2015年版《中华人民共和国药典》(一部)仅采用薄层色谱法结合对照品延胡索乙素、紫花前胡苷、芍药苷等和对照药材川芎对颈痛颗粒进行鉴别，或采用高效液相色谱法测定人参皂苷Rg₁、人参皂苷Rb₁和三七皂苷R₁的含量，质控指标单一，不能全面反映中药方剂多成分、多靶点的特点。而如前所述，中药及其复方是在中医理论指导下进行应用研究的，其成分复杂，发挥药效的部位往往不是单一成分，而是群体疗效，所以任何一种单一成分都是无法反应中药及其复方的整体疗效的。因此，对中药及其复方进行宏观地综合分析将成为必然的趋势。

中药指纹图谱依托各种光谱、波谱、色谱技术综合地反应中药及其复方的质量信息，目前已成为国际公认的中药及其复方质量控制的重要手段。但发明人发现，目前针对颈痛颗粒基于指纹图谱的质量控制研究尚未见报道，因此提供一种颈痛颗粒的指纹图谱建立方法具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种颈痛颗粒指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。针对颈痛颗粒作为一种中药复方制剂，由7味处方药材组成、成分复杂多样、且尚未完全明确等特点，通过研究试验，进一步对颈痛颗粒中特征性成分有效分离，使其形成特征峰多且能够有效表征颈痛颗粒制剂质量的指纹图谱，从而完成本发明。

为了实现所述目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种颈痛颗粒的指纹图谱建立方法，该方法以三七皂苷R1、延胡索乙素及齐墩果酸为混合标准品。

优选的，所述指纹图谱建立方法，其步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取颈痛颗粒，加入甲醇超声提取，过滤后即得待测液；

(2)对照品溶液制备：取减压干燥至恒重的三七皂苷R1、延胡索乙素及齐墩果酸对照品加入甲醇制成混合对照品溶液；

(3)测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，进行HPLC分析，采用梯度洗脱，流动相A相：乙腈，流动相B相：0.15％磷酸水溶液；对高效液相色谱测定所得图谱进行分析处理，即得颈痛颗粒指纹图谱。

可以理解的是，所述步骤(1)和(2)之间并不存在先后顺序之分。

本发明的第二个方面，提供所述建立方法获得的颈痛颗粒的指纹图谱。

本发明的第三个方面，提供所述建立方法和/或指纹图谱在颈痛颗粒质量控制中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种颈痛颗粒的质量控制方法，所述方法包括：取多批次颈痛颗粒按照所述构建方法得到颈痛颗粒指纹图谱，将该多个批次(一般至少10个批次)颈痛颗粒指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；

取待检测样品制备供试品溶液，按照所述构建方法得到颈痛颗粒指纹图谱；

将待检测样品指纹图谱与颈痛颗粒对照指纹图谱进行相似性比较。

优选的，所述相似性比较包括采用夹角余弦法和/或相关系数法进行。

所述一个或多个技术方案的有益技术效果：

所述技术方案采用梯度洗脱的方法建立了颈痛颗粒的指纹图谱，该方法操作简单，稳定可靠，精密度高，分离度好，指纹图谱的稳定性和重现性较好，且信息量大，能够充分反映颈痛颗粒整体化学成分的信息；

所述技术方案既避免了因只测定单一化学成分而判定制剂整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，同时通过对多个批次的样品进行系统分析，从而能够更加全面、科学评价颈痛颗粒的质量，从而保证产品的质量和疗效，为颈痛颗粒的质量控制提供了良好的解决方案，因此极具实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中混合对照品的HPLC图；

图2为本发明实施例中14批次颈痛颗粒的HPLC指纹图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种颈痛颗粒的指纹图谱建立方法，该方法以三七皂苷R1、延胡索乙素及齐墩果酸为混合标准品。

本发明的又一具体实施方式中，所述指纹图谱建立方法，其步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取颈痛颗粒，加入甲醇超声提取，过滤后即得待测液；

(2)对照品溶液制备：取减压干燥至恒重的三七皂苷R1、延胡索乙素及齐墩果酸对照品加入甲醇制成混合对照品溶液；

(3)测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，进行HPLC分析，采用梯度洗脱，流动相A相：乙腈，流动相B相：0.15％磷酸水溶液；对高效液相色谱测定所得图谱进行分析处理，即得颈痛颗粒指纹图谱。

可以理解的是，所述步骤(1)和(2)之间并不存在先后顺序之分。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(1)中称取一定量的颈痛颗粒加入甲醇后超声10-30min(优选为20min)，其中颈痛颗粒：甲醇的比为(80-120)mg：(4-6)mL(优选为100mg：5mL)；超声提取后摇匀过滤，滤液过0.22μm微孔滤膜后得供试品溶液；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(2)中混合对照品溶液的配制方法如下：精密称取三七皂苷R1标准品0.0100g、延胡索乙素标准品0.0099g和齐墩果酸标准品0.0099g置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配置混合标准品溶液。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(3)中色谱柱为CAPCELL PAK C18 MGII(4.6mm×250mm，5μm)；流动相流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长为300nm，进样量10μL。

本发明的又一具体实施方式中，步骤(3)中梯度洗脱方式为：梯度洗脱：0～15min，2％A→15％A；15～30min，15％A→30％A；30～45min，30％A→50％A；45～60min，50％A→65％A；60～75min，65％A→100％A。需要说明的是，在选择指纹图谱的洗脱时间时记录了2h的色谱图。结果表明65min以后基本没有明显的色谱峰出现，同时为了照顾各批次样品的差异性，保证所有批次样品的特征峰都能够被检出，因此选择75min作为分析时间。并对梯度洗脱条件进行优化，各色谱峰保留时间适中，提高了色谱图的分离度，避免色谱图的拖尾现象，从而有利于色谱指纹图谱的检测和分析。

本发明的又一具体实施方式中，如前所述颈痛颗粒指纹图谱构建方法得到的颈痛颗粒指纹图谱，该指纹图谱中的共有峰为22个。

本发明的又一具体实施方式中，提供所述建立方法获得的颈痛颗粒的指纹图谱。

本发明的又一具体实施方式中，提供所述建立方法和/或指纹图谱在颈痛颗粒质量控制中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种颈痛颗粒的质量控制方法，所述方法包括：取多批次颈痛颗粒按照所述构建方法得到颈痛颗粒指纹图谱，将该多个批次(一般至少10个批次)颈痛颗粒指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；

取待检测样品制备供试品溶液，按照所述构建方法得到颈痛颗粒指纹图谱。

将待检测样品指纹图谱与颈痛颗粒对照指纹图谱进行相似性比较。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

1、仪器与材料

安捷伦(agilent1200)高效液相色谱仪；赛多利斯十万分之一电子分析天平、指纹图谱相似度评价软件为“中药色谱指纹相似度评价系统”(国家药典委员会2004A版)；KQ-1000DE型数控超声波仪。

色谱柱：日本资生堂CAPCELL PAK C18 MGII(4.6mm×250mm，5μm)，三七皂苷R1、延胡索乙素和齐墩果酸标准品均购于上海纯优生物科技有限公司。

磷酸、甲醇(色谱纯，山东创益化工有限公司)；乙腈(色谱纯，美国费希尔Fisher)；实验用水为超纯水(18MΩ)；14批次(S1-S14)颈痛颗粒(明仁)样品取自山东明仁福瑞达制药股份有限公司。

2、实验方法

2.1供试品溶液的制备

取颈痛颗粒0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入10mL色谱甲醇，超声提取20min(提取功率300W，频率40kHz)，摇匀，过滤，滤液过0.22μm微孔滤膜后作为供试品溶液，备用。

2.2混合对照品溶液的制备

精密称取三七皂苷R1标准品0.0100g、延胡索乙素标准品0.0099g和齐墩果酸标准品0.0099g置10mL容量瓶中，加色谱甲醇溶解并稀释至刻度，配置混合标准品溶液。

2.3色谱条件

日本资生堂CAPCELL PAK C18 MGII(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.15％磷酸水溶液(B)。梯度洗脱：0～15min，2％A→15％A；15～30min，15％A→30％A；30～45min，30％A→50％A；45～60min，50％A→65％A；60～75min，65％A→100％A。流动相流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长为300nm，进样量10μL。

3、结果与讨论

3.1指纹图谱的比较

用指纹图谱软件对所得图谱进行分析处理，即得各批次颈痛颗粒指纹图谱(如图2)。图谱共有22个共有特征峰。混合对照品的指纹图谱如图1所示，通过与对照品色谱图比较，确认4号峰为齐墩果酸，6号峰为三七皂苷R1，21号峰为延胡索乙素。

将所测的14批次颈痛颗粒图谱导入“中药色谱指纹相似度评价系统”软件分析，进行色谱峰匹配。以S1作为参照图谱，生成的对照指纹图谱为R(采用平均法，见图1)。各批次样品的指纹图谱与对照指纹图谱以及各样品之间指纹图谱的相似度结果见表1。

表1 14个批次指纹图谱的相似度值

由表1中可以看出，各批次样品与R的相似度均在0.900以上，说明颈痛颗粒各批次样品的化学组成总体上较为相近。

3.2方法学考察

方法学考察主要考察了精密度、稳定性和重复性，考察方法和结果如下：

(1)精密度实验取同一批次颈痛颗粒样品，在上述色谱条件下，连续测定6次，记录色谱图，结果见表2。由表2可知，各共有峰相对保留时间和相对峰的RSD均小于3％，说明仪器精密度良好。

(2)稳定性实验取同一批次颈痛颗粒样品，在上述色谱条件下，分别于0h，2h，4h，8h，12h和24h进样分析，记录色谱图，结果见表2。由表2可见，各共有峰相对保留时间和相对峰的RSD均小于3％，说明供试品溶液成分在24h内稳定。

(3)重复性实验取同一批次的颈痛颗粒样品，在上述色谱条件下，分别进样分析，记录色谱图，结果见表2，各共有峰相对保留时间和相对峰的RSD均小于3％，说明该实验方法具有较佳的重复性。

表2颈痛颗粒指纹图谱方法学验证结果

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种颈痛颗粒的指纹图谱建立方法，所述方法以三七皂苷R1、延胡索乙素及齐墩果酸为混合标准品；

其特征在于，步骤如下：

(1)供试品溶液的制备：取颈痛颗粒，加入甲醇超声提取，过滤后即得待测液；

(2)对照品溶液制备：取减压干燥至恒重的三七皂苷R1、延胡索乙素及齐墩果酸对照品加入甲醇制成混合对照品溶液；

(3)测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，进行HPLC分析，采用梯度洗脱，流动相A相：乙腈，流动相B相：0.15％磷酸水溶液；对高效液相色谱测定所得图谱进行分析处理，即得颈痛颗粒指纹图谱；

所述步骤(1)和(2)之间并不存在先后顺序之分；

所述步骤(3)中色谱柱为CAPCELL PAK C18 MGII，4.6mm×250mm，5μm；流动相流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长为300nm，进样量10μL；

所述步骤(3)中梯度洗脱方式为：0～15min，2％A→15％A；15～30min，15％A→30％A；30～45min，30％A→50％A；45～60min，50％A→65％A；60～75min，65％A→100％A。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中称取颈痛颗粒加入甲醇后超声10-30min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中称取颈痛颗粒加入甲醇后超声为20min。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中颈痛颗粒：甲醇的比为(450-550)mg：(8-12)mL；超声提取后摇匀过滤，滤液过0.22μm微孔滤膜后得供试品溶液。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中颈痛颗粒：甲醇的比为500mg：10mL。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中混合对照品溶液的配制方法如下：精密称取三七皂苷R1标准品0.0100g、延胡索乙素标准品0.0099g和齐墩果酸标准品0.0099g置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制 混合标准品溶液。

7.权利要求1-6任一项所述方法和/或根据 权利要求1-6所述方法获得的指纹图谱在颈痛颗粒质量控制中的应用。

8.一种颈痛颗粒的质量控制方法，其特征在于，所述方法包括：取多批次颈痛颗粒按照权利要求1-6任一项所述方法得到颈痛颗粒指纹图谱，将多个批次颈痛颗粒指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；

取待检测样品制备供试品溶液，按照权利要求1-6任一项所述方法得到颈痛颗粒指纹图谱；

将待检测样品指纹图谱与颈痛颗粒对照指纹图谱进行相似性比较。

9.如权利要求8所述的质量控制方法，其特征在于，所述相似性比较包括采用夹角余弦法和/或相关系数法进行。

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