CN114660204A - 三白汤指纹图谱的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三白汤指纹图谱的建立方法。包括主要步骤为：对照品溶液及供试品溶液的制备、色谱条件的确定、高效液相色谱图的测定，对多批次供试品溶液的液相色谱图进行对比分析并与对照品溶液的液相色谱图相比较，确认供试品溶液中所含化学成分的特征峰，并由此建立起三白汤的特征指纹图谱。通过以上方式，能够对三白汤中6种有效成分实现同时检测，从而提供了更为丰富的鉴别信息，较全面地反映出三白汤中多指标成分的质量水平。此外，由于该方法准确度高、稳定性高、重复性好，能达到科研和生产的要求，从而为三白汤的质量控制提供了良好的科学基础。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种三白汤指纹图谱的建立方法。
背景技术
中医方剂三白汤记载于明代医学著作《医学入门》中，其药味组成和用法用量为“白芍、白术、白茯苓各一钱，甘草五分，水煎，温服”，具有健运脾胃，调畅气机，滋养胃阴，通经活血之功效。三白汤临床常用于补气益血，调理脾胃虚弱、气机郁滞等不适，同时在临床应用中发现三白汤可以美白润肤，养颜抗衰，逐渐作为美白养颜的方剂流传至今。在中医理论中，白芍味甘、酸，性微寒，有养血的作用，可以治疗面色萎黄、面部色斑、无光泽；白术性温、味甘苦，有延缓衰老的功效；白茯苓，味甘、淡，性平，具有祛斑美白的功效；甘草性平，味甘，可调脾胃虚弱所导致皮肤皲裂，有润肤功效。三白汤中白芍、白术和白茯苓是润泽皮肤、美容养颜的传统中药材，结合甘草“通除百毒、调和诸药”，四味药材配伍精当，可通过调理气血虚寒导致的粗糙、萎黄、色斑、色素沉着等皮肤不健康问题。
目前，关于三白汤的化学成分及抗氧化活性尚不清楚，缺少全面反映三白汤所含有效成分的特征指纹图谱，限制了对其药效物质基础及作用机制的深入研究。但由于三汤白中所含的中药为多组分复杂体系，各种药物化学成分存在相互作用，而且该中药具有多靶点等特点，因此对其质量评价提出了更深层次的要求，急需能够提供丰富鉴别信息的检测方法。但现行的显微鉴别、理化鉴别和单一含量测定等方法不足以解决以上问题。
中药指纹图谱是指中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价，具备专属性强、稳定性好、重现性好的优点，因此中药指纹图谱已经成为目前国际上较为先进的中药质量控制手段。高效液相色谱法(HPLC)具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点，不受样品挥发度和热稳定性的限制，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建中药指纹图谱的主要方法之一。
因此，本发明采用高效液相色谱法，通过梯度洗脱技术建立了三白汤制剂的指纹图谱，可为三白汤药效物质基础研究和质量标准制定及产品开发奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种检测灵敏度高，能较为全面地反映三白汤及其制剂中所含化学成分的种类与相对含量，且准确性、重现性、稳定性均能达到科研和生产要求，并适于推广应用的三白汤指纹图谱的建立方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种三白汤指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：取白术、白芍、白茯苓和甘草四味药材，制备多批次的三白汤供试品溶液；取芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、甘草酸、白术内酯II和甘草次酸，制备对照品溶液；将多批次的所述三白汤供试品溶液和所述对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行测试，得到多批次的所述供试品溶液和所述对照品溶液的液相色谱图；对多批次的所述供试品溶液的液相色谱图进行对比分析并与所述对照品溶液的液相色谱图相比较，确认供试品溶液中所含化学成分的特征峰，建立三白汤的特征指纹图谱。
作为本发明的进一步改进，所述将多批次的三白汤供试品溶液与对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行测试时的色谱条件包括：色谱柱：Agilent5HC-C18，250mm×4.6mm；柱温：35℃；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流速为1.0mL·min-1，检测波长为256nm。
作为本发明的进一步改进，所述注入高效液相色谱仪进行测试时的梯度洗脱条件包括：
作为本发明的进一步改进，所述制备对照品溶液的步骤包括：取芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、甘草酸、白术内酯II和甘草次酸，加甲醇溶解并稀释，即得。
作为本发明的进一步改进，所述制备多批次的三白汤供试品溶液的步骤包括：取白术、白芍、白茯苓和甘草，水浸泡处理后，以所取药材总质量的12倍量的热水为提取溶剂，经多次提取，将多次提取所得提取液混合后进行浓缩，将浓缩液经甲醇稀释后，过滤，即得。
作为本发明的进一步改进，制备所述对照品溶液的方法包括：称取芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、甘草酸、白术内酯II和甘草次酸，加甲醇溶解并稀释至每毫升溶液中含有芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、甘草酸、白术内酯II、甘草次酸分别为0.680、0.220、0.210、0.480、0.200和0.040毫克。
作为本发明的进一步改进，所述制备多批次的三白汤供试品溶液的步骤包括：精密称取白术3.73g、白芍3.73g、白茯苓3.73g和甘草1.87g，将上述药材水浸0.5h后，以12倍量的100℃的水作为提取溶剂，经2次提取，每次1h，将两次提取所得提取液混合后进行浓缩，用甲醇稀释所得浓缩液，经微孔膜过滤后，即得。
作为本发明的进一步改进，所述供试品溶液的质量浓度为0.1g/mL。
作为本发明的进一步改进，所述将两次提取所得提取液混合后进行浓缩的方法包括旋转蒸发法。
作为本发明的进一步改进，过滤用的微孔膜的孔径为0.22μm。
作为本发明的进一步改进，所述对多批次的所述供试品溶液的液相色谱图进行对比分析并与所述对照品溶液的液相色谱图相比较的步骤包括：将多批次所述供试品溶液的液相色谱图与所述对照品溶液的液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，采用多点校正法对多批次所述供试品溶液的液相色谱图进行自动匹配叠加指纹图谱，再与对照品溶液的液相色谱图相比较，进行供试品溶液中的化学成分指认。
作为本发明的进一步改进，所述特征指纹图谱含有20个共有峰。
作为本发明的进一步改进，所述特征指纹图谱中：1号峰来自没食子酸，6号峰来自芍药内酯苷，7号峰来自芍药苷，16号峰来自甘草酸，19号峰来自白术内酯II，20号峰来自甘草次酸。
本发明的有益效果是：
本发明提供的三白汤指纹图谱的建立方法，通过成功制备供试品和对照品溶液，并合理制定高效液相色谱的梯度洗脱工艺，成功建立了三白汤中所含有效成分的特征指纹图谱，可对三白汤中的6种有效成分实现同时检测，从而能够提供更为丰富的鉴别信息，较为全面地反映出三白汤中多指标成分的质量水平。
本发明的三白汤指纹图谱的建立方法，精密吸取供试品溶液进行精密度试验、稳定性试验以及重复性试验测试后，结果表明该方法准确度高、稳定性高、重复性好，能达到科研和生产的要求，从而为三白汤的质量控制提供了基础。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
图1为本发明的12个批次的三白汤的指纹图谱；
图2为本发明的采用中位数法生成的三白汤对照图谱(R)；
图3为本发明对照品溶液的液相色谱图；
图4为本发明的流动相及洗脱条件的选择方法中方法一所得的色谱图；
图5为本发明的流动相及洗脱条件的选择方法中方法二所得的色谱图；
图6为本发明的流动相及洗脱条件的选择方法中方法三所得的色谱图；
图7为本发明的流动相及洗脱条件的选择方法中方法四所得的色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、仪器与试剂
对照品：甘草酸(批号:20122305)、没食子酸(批号:21071405)、芍药内酯苷(批号:21031601)、甘草次酸(批号:21030707)、白芍内酯Ⅱ(批号:20110610)可以使用成都曼斯特生物科技有限公司，芍药苷可以使用(批号:ZLSW201128-1)西安泽朗生物技术有限公司，上述对照品质量分数均≥98％。
供试品：十二批药材的产地和批号如下表所示：
仪器：戴安U3000系列高效液相色谱仪(美国赛默飞有限公司)，AB135－S型十万分之一电子天平(德国梅特勒-托利多公司)，LC－4016型低速离心机离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，IKARV10digital(德国IKA公司)，Milli-QGradientA10超纯水系统(密理博上海贸易有限公司)。
试剂：乙腈(色谱纯，瑞典欧普森有限公司)，甲醇(色谱纯，瑞典欧普森有限公司)。
二、供试品溶液及对照品溶液的制备：
1.供试品溶液的制备：精密称取白术3.73g、芍药3.73g、白茯苓3.73g和甘草1.87g，将上述药材水浸泡0.5h后，加入上述药材总质量的12倍量的水156.72g作为提取溶剂，加热至100℃后，蒸煮1h，并重复以上操作两次，将2次提取后所得的提取液混合到一起，并通过旋转蒸发仪进行浓缩。随后加入甲醇稀释所得浓缩液至质量浓度为0.1g/mL，并经孔径为0.22μm的微孔膜过滤后，即得三白汤供试品溶液，备用，并根据上述方法制备12批各不同批次的三白汤供试品溶液。
2.对照品溶液的制备：按照处方比例精密称取芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、甘草酸、白术内酯II和甘草次酸，加甲醇溶解并稀释至芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、甘草酸、白术内酯II、甘草次酸的质量浓度分别为0.680、0.220、0.210、0.480、0.200和0.040mg/mL，从而制得对照品溶液，备用。
三、色谱条件的确定：
本发明中选取的色谱条件为：
色谱柱：安捷伦Agilent5HC-C18，250mm×4.6mm；柱温：35℃；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流速为1.0mL·min-1，检测波长为256nm。
流动相梯度洗脱程序为：
其中，本发明中流动相及洗脱条件的选取是采用如下方法进行比较后确定：
方法一：流动相采用乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)，并用0min，90％B；10min，84％B；20min，76％B；30min，69％B；40min，62％B；45min，5％；50min，5％B的梯度洗脱程序，检测波长选用238nm进行试验，其HPLC色谱图如图4所示，分离出的色谱峰较少，不能有效分离复方中的有效成分。
方法二：流动相采用乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)，并用0min，95％B；17min，80％B；18min，75％B；20min，68％B；35min，60％B；50min，48％；54min，27％B；62min，14％B；65min，5％B；70min，5％B的梯度洗脱程序，检测波长选用238nm进行试验，其HPLC色谱图如图5所示，分离出的色谱峰较少，不能有效分离复方中的有效成分。
方法三：流动相采用乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)，并用0min，95％B；17min，80％B；18min，75％B；20min，68％B；35min，60％B；50min，48％；54min，27％B；62min，14％B；65min，5％B；70min，5％B的梯度洗脱程序，检测波长选用256nm进行试验，其HPLC色谱图如图6所示，色谱峰分离度不够，不能有效分离复方中的多种成分。
方法四：流动相采用乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)，并用0min，93％B；5min，89％B；15min，80％B；16min，79％B；25min，74％B；33min，69％；36min，65％B；56min，49％B；58min，27％；60min，5％B；65min，5％B的梯度洗脱程序，检测波长选用256nm进行试验，其HPLC色谱图如图7所示。在该条件下，HPLC色谱峰可以很好的分离，且能分离复方中多种有效成分。
四、进行图谱采集:
取上述制备好的12批三白汤供试品溶液与对照品溶液，分别按上述色谱条件进行测定，设置进样量为20μL，并记录下各自的图谱。
五、三白汤特征指纹图谱的建立:
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》对获取到的12批次供试品溶液的液相色谱图进行对比分析，采用多点校正及全谱峰匹配生成HPLC叠加指纹图谱，结果如图1所示，采用中位数法生成对照指纹图谱(R)，见图2。由图1和图2比对后可知，其中20个峰为12批汤剂所共有，因此确定20个峰为共有色谱峰。随后，将上述获得的供试品溶液的液相色谱图再与对照品溶液的液相色谱图(如图3所示)进行比较分析，通过指认出两者的共有特征峰，从而确认供试品溶液中所含六种化学成分的特征峰，其中，确定1号峰来自没食子酸，6号峰来自芍药内酯苷，7号峰来自芍药苷，16号峰来自甘草酸，19号峰来自白术内酯Ⅱ，20号峰来自甘草次酸。因此确定这6个峰为三白汤HPLC指纹图谱的特征峰。并由此建立起三白汤的特征指纹图谱。
六、对12批三白汤供试品溶液样品进行相似度评价：
将12批三白汤供试品溶液的HPLC色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，以S1号样品色谱图为参照图谱,设置时间窗宽度为0.1min，采用多点校正及全谱峰匹配生成HPLC叠加指纹图谱，采用中位数法生成对照指纹图谱(R)，得到三白汤的指纹图谱并进行相似度评价。如下表1中所示的结果表明：12批三白汤供试品溶液指纹图谱的相似度在0.911-0.989之间，平均值为0.957，由此可知：12批三白汤供试品溶液质量一致性较高。
表1. 12批三白汤供试品溶液指纹图谱相似度计算结果
七、方法学验证：
1.精密度考察，精密吸取同一供试品溶液S2，每次吸取20μL，在上述色谱条件下，连续进样6次，以甘草酸峰(16号峰)的保留时间和色谱峰面积为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见下表2、3，RSD值均小于2％，可见该仪器精密度良好。
2.稳定性考察，精密吸取同一供试品溶液S2，每次吸取20μL，在上述色谱条件下，分别于2h，4h，6h，12h，24h，48h进行进样分析，以甘草酸峰(16号峰)的保留时间和色谱峰面积为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见下表2、3，由RSD值均小于2％，可见供试品溶液在48小时内稳定，因此表明供试品溶液在48h内稳定性良好。
3.重复性考察，取同一批三白汤供试品溶液S2，共6份，分别吸取每份供试品溶液20μL，在上述相同的色谱条件下进样测定，以甘草酸峰(16号峰)的保留时间和色谱峰面积为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见下表2、3，由RSD值均小于2％，可见本方法重复性良好。
表2三白汤供试品溶液共有峰的相对保留时间
表3三白汤供试品溶液共有峰的相对峰面积
综上所述，本发明提供的三白汤指纹图谱的建立方法，通过成功提取和制备供试品和对照品溶液，并合理制定高效液相色谱的梯度洗脱工艺，成功建立了三白汤中所含有效成分的特征指纹图谱，可对三白汤中的6种有效成分实现同时检测，从而能够提供更为丰富的鉴别信息，较为全面地反映出三白汤中多指标成分的质量水平。利用供试品溶液对本方法进行精密度试验、稳定性试验以及重复性试验测试后，结果表明该方法准确度高、稳定性高、重复性好，能达到科研和生产的要求，从而为三白汤的质量控制提供了基础。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种三白汤指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
取白术、白芍、白茯苓和甘草，制备多批次的三白汤供试品溶液；
取芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、甘草酸、白术内酯II和甘草次酸，制备对照品溶液；
将多批次的所述三白汤供试品溶液和所述对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行测试，得到多批次的所述供试品溶液和所述对照品溶液的液相色谱图；
对多批次的所述供试品溶液的液相色谱图进行对比分析并与所述对照品溶液的液相色谱图相比较，确认供试品溶液中所含化学成分的特征峰，建立三白汤的特征指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的三白汤指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述将多批次的三白汤供试品溶液与对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行测试时的色谱条件包括：
色谱柱：Agilent 5HC-C18，250mm×4.6mm；柱温：35℃；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，流速为1.0mL·min-1，检测波长为256nm。
3.根据权利要求2所述的三白汤指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述注入高效液相色谱仪进行测试时的流动相梯度洗脱条件包括：
4.根据权利要求1所述的三白汤指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述制备对照品溶液的步骤包括：
取芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、甘草酸、白术内酯II和甘草次酸，加甲醇溶解并稀释，即得。
5.根据权利要求1所述的三白汤指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述制备多批次的三白汤供试品溶液的步骤包括：
取白术、白芍、白茯苓和甘草，水浸泡处理后，以所取药材总质量的12倍量的热水为提取溶剂，经多次提取，将多次提取所得提取液混合后进行浓缩，将浓缩液经甲醇稀释后，过滤，即得。
6.根据权利要求1所述的三白汤指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述制备对照品溶液的步骤包括：
称取芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、甘草酸、白术内酯II和甘草次酸，加甲醇溶解并稀释至每毫升溶液中含有芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸、甘草酸、白术内酯II、甘草次酸分别为0.680、0.220、0.210、0.480、0.200和0.040毫克。
7.根据权利要求1所述的三白汤指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述制备多批次的三白汤供试品溶液的步骤包括：
精密称取白术3.73g、白芍3.73g、白茯苓3.73g和甘草1.87g，将上述药材水浸泡0.5h后，以所取药材总质量的12倍量100℃的热水作为提取溶剂，经2次提取，每次1h，将两次提取所得提取液混合后进行浓缩，用甲醇稀释所得浓缩液，经微孔膜过滤后，即得。
8.根据权利要求7所述的三白汤指纹图谱的建立方法，其特征在于：
所述供试品溶液的质量浓度为0.1g/mL。
9.根据权利要求7所述的三白汤指纹图谱的建立方法，其特征在于：
所述将两次提取所得提取液混合后进行浓缩的方法包括旋转蒸发法。
10.根据权利要求7所述的三白汤指纹图谱的建立方法，其特征在于：
过滤用的微孔膜的孔径为0.22μm。
11.根据权利要求1所述的三白汤指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述对多批次的所述供试品溶液的液相色谱图进行对比分析并与所述对照品溶液的液相色谱图相比较的步骤包括：
将多批次所述供试品溶液的液相色谱图与所述对照品溶液的液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，采用多点校正法对多批次所述供试品溶液的液相色谱图进行自动匹配叠加指纹图谱，再与对照品溶液的液相色谱图相比较，进行供试品溶液中的化学成分指认。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的建立方法，其特征在于：
所述特征指纹图谱含有20个共有峰。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的建立方法，其特征在于：
所述特征指纹图谱中：1号峰来自没食子酸，6号峰来自芍药内酯苷，7号峰来自芍药苷，16号峰来自甘草酸，19号峰来自白术内酯II，20号峰来自甘草次酸。
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| GR01 | Patent grant | ||
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